本发明涉及农业微生物领域中一株豌豆根瘤菌及其发酵培养方法与应用。
背景技术：
：豌豆(PisumsativumL.)为豆科豌豆属一年生或越年生草本植物，其籽实可食用，茎叶为良好的绿肥和饲料，又因其适应性很广，是世界上分布广泛的一种作物，因此种植利用面积较大，全世界干豌豆种植面积621.43万公顷，总产955.82万吨；全世界青豌豆种植面积224.13万公顷，总产1697.50万吨,是世界第四大豆类作物。我国干豌豆种植面积94.00万公顷，总产119.00万吨；青豌豆种植面积129.59万公顷，总产1027.43万吨。我国干豌豆栽培面积和总产分别占全世界的15.13％和12.45％，青豌豆栽培面积和总产分别占全世界的57.82％和60.53％，仅次于加拿大，是世界第二大豌豆生产国，在世界豌豆生产中占有举足轻重的地位。蚕豆(ViciafabaLinn)是豆科野豌豆属一年生草本，为粮食、蔬菜和饲料、绿肥兼用作物。蚕豆营养价值丰富，含8种必需氨基酸，碳水化合物含量为47％～60％，可食用，也可作饲料、绿肥和蜜源植物种植，为粮食、蔬菜和饲料、绿肥兼用作物。氮素是植物生长中最重要的营养元素之一，农作物依赖于施用氮素化肥所获得的增产实际上是以消耗能源和污染环境为代价所取得的，而土壤中的固氮微生物将空气中的氮气转化为植物可吸收的氨的过程却是高效和环境友好的。根瘤菌(rhizobia)是一类广泛存在于土壤中的革兰氏阴性细菌。它们能与豆科植物形成共生关系，通过侵染豆科植物的根部或茎部形成根瘤或(和)茎瘤，然后以共生体的形式将空气中的氮气转化成植物可吸收利用的优质氮素―谷氨酸和谷氨酚胺类物质。豆科根瘤菌的研究和应用已有一百多年历史，几乎在全世界范围内都提倡对豆科作物进行根瘤菌接种。根瘤菌和豆科植物共生体系是已知生物固氮能力最强的体系之一，每年固氮量占全球生物总固氮量的65％以上。全世界豆科植物约七百四十八属，二万种，我国已知有一百七十二个属，一千四百八十五种，还有许多能够与根瘤菌共生结瘤的豆科植物正在不断地被收录和记载。在这些豆科植物中只有不足16％的种做过结瘤的调查研究，并且只有0.3％－0.5％研究过共生关系。因此开发和利用豆科植物与根瘤菌共生固氮效应的潜力很大。在生物固氮过程中，依据根瘤菌对寄主植物的专一性，把适于同一种根瘤菌结瘤固氮的植物列为一族，根瘤菌在族内各植物间可以转接，称为互接种族。豌豆根瘤菌可以用于豌豆属、蚕豆属、山黧豆属和苕子接种。种植豆科作物时,因地制宜接种适宜的根瘤菌可以提高共生固氮作用和籽粒产量。豌豆和蚕豆具有抗旱、耐瘠薄,在我国西部土壤贫瘠、荒漠化严重的地区有着特殊的适应性,并通过其生物固氮作用抑制土壤退化和节约氮肥使用量,有利于培养地力、修复生态损伤。近些年来，我国豌豆和蚕豆种植面积不断扩大，各地十分重视豌豆和蚕豆的栽培和推广，豌豆和蚕豆接种根瘤菌技术的研究和应用也不断被加大重视。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是如何显著增加豆科植物植株重量和/或植株高度。为了解决以上技术问题，本发明提供了一株根瘤菌。本发明所提供的根瘤菌是豌豆根瘤菌(Rhizobiumleguminosarum)，其菌株号为H10，该菌株已于2015年12月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCCNo.11878，以下简称为豌豆根瘤菌H10。豌豆根瘤菌H10小短杆状，菌体大小为0.5～0.9微米×1.2～6.0微米，在不同培养基生长的菌体形态不同。一般含有聚-β-羟基丁酸盐颗粒。无芽孢，具端生鞭毛或周生鞭毛，运动，好氧。最适生长温度25～30℃，最适pH6.0～7.0。菌落呈圆形，边缘整齐，凸起，无色半透明或浅乳白色，粘稠。在酵母汁甘露醇无机盐琼脂培养基平板上生长3-6天后直径2～4mm。在含糖培养基上的生长物常伴有丰富的胞外粘液。为了解决以上技术问题，本发明还提供了促进豆科植物生长的菌剂。本发明所提供的促进豆科植物生长的菌剂，含有豌豆根瘤菌H10或/和豌豆根瘤菌H10的代谢物。所述促进豆科植物生长的菌剂具体可为提高豆科植物单株重量和/或提高豆科植物株高的菌剂。所述豆科植物单株重量是指豆科植物单株的地上部分重量。上述菌剂的活性成分可为豌豆根瘤菌H10或/和豌豆根瘤菌H10的代谢物，上述菌剂的活性成分还可含有其他生物成分或非生物成分，上述菌剂的其他活性成分本领域技术人员可根据菌剂对豆科植物植株重量和/或植株高度促进效果确定。所述菌剂还可包括载体。所述载体可为固体载体或液体载体。所述固体载体为矿物材料、生物材料；所述矿物材料可为草炭、粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述生物材料为各类作物的秸秆、松壳、稻草、花生壳、玉米粉、豆粉、淀粉、草炭和动物的粪便中的至少一种；所述液体载体可为水；所述菌剂中，豌豆根瘤菌H10或/和豌豆根瘤菌H10的代谢物可以以被培养的活细胞、活细胞的发酵液、细胞培养物的滤液或细胞与滤液的混合物的形式存在。所述菌剂的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。根据需要，所述菌剂中还可添加表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、pH调节剂等。豌豆根瘤菌H10或所述促进豆科植物生长的菌剂在制备促进豆科植物生长的产品中的应用和在促进豆科植物生长中的应用均属于本发明的保护范围。上述应用中，所述促进豆科植物生长可为提高豆科植物单株重量和/或提高豆科植物株高。上述应用中，所述促进豆科植物生长的产品可为促进豆科植物生长的菌剂或含有所述促进豆科植物生长的菌剂的生物肥料。本申请中，所述豆科植物可为豌豆或蚕豆。为了解决以上技术问题，本发明还提供了一种培养豌豆根瘤菌H10的方法。本发明所提供的培养豌豆根瘤菌H10的方法，包括在用于培养根瘤菌的培养基中培养豌豆根瘤菌H10的步骤。所述用于培养根瘤菌的培养基可按照如下方法配制：丙三醇3-5ml，甘露醇2-5g，酵母浸粉0.8-1g，K2HPO40.5-1g，无水MgSO40.1-0.2g，CaSO4·2H2O0.1-0.2g，NaCl0.1-0.2g，1％(NH4)6Mo7O24·4H2O1-1.5ml、1％H3BO31-1.5ml，琼脂20g，用水定容至1000ml，调pH值为6.8-7.0，灭菌得到用于培养根瘤菌的培养基。实验证明，将豌豆根瘤菌H10接种草原23、草原24、草原28、青海12和青海13后，植株高度、植株鲜重和植株干重比不接菌对照鲜重增加：植株平均鲜重比不接菌对照植株分别增长76.09％、46.67％、78.95％、89.12％和76.10％，植株平均高度比不接菌对照植株分别增长109.19％、29.60％、69.97％、127.31％和90.81％，植株平均干重比不接菌对照植株分别增长556.61％、455.00％、597.16％、875.00％和377.78％(表1和3)。豌豆和蚕豆种子接种豌豆根瘤菌(Rhizobiumleguminosarum)H10CGMCCNo.11878后植株高度、植株鲜重和植株干重比接种豌豆根瘤菌ACCC16001的植株高度、植株鲜重和植株干重相比显著增加(表4)：草原23、草原24、草原28、青海12和青海13的植株平均高度分别增加70.25％、6.19％、47.08％、61.13％和63.49％，植株平均鲜重分别增加58.51％、41.94％、63.86％、78.92％和55.21％，植株平均干重分别增加482.05％、256.79％、526.02％、748.83％和340.27％(表4)。表明本发明的豌豆根瘤菌(Rhizobiumleguminosarum)H10CGMCCNo.11878比豌豆根瘤菌ACCC16001对豌豆和蚕豆具有更显著的促进生长和增产效果。本发明具有较高的实用性和可推广性，有望发展成为豌豆根瘤菌应用领域中一项新的优良组合技术。本发明在豆科植物(如豌豆和蚕豆)种植业中具有广阔的应用前景。保藏说明菌种名称：豌豆根瘤菌Rhizobiumleguminosarum菌株编号：H10保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏机构简称：CGMCC地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号保藏日期：2015年12月14日保藏中心登记入册编号：CGMCCNo.11878具体实施方式下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中的豌豆根瘤菌(Rhizobiumleguminosarum)ACCC16001于1991年1月1日收藏于中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心(简称ACCC，地址：北京市海淀区中关村南大街12号，中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，邮编100081)，自该收藏日起公众可从中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心获得该菌株。豌豆根瘤菌(Rhizobiumleguminosarum)ACCC16001在下文中简称豌豆根瘤菌ACCC16001。实施例1、豌豆根瘤菌(Rhizobiumleguminosarum)H10CGMCCNo.11878的分离及鉴定1、菌株的分离从青海省乐都县采集野生豌豆根瘤，用平板(取甘露醇10g，酵母浸粉1g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸钙0.2g，硫酸镁0.2g，氯化钠0.1g，质量含量为1％的钼酸铵水溶液1ml和质量含量为1％的硼酸水溶液1ml，0.5％刚果红1ml，20g琼脂，用水定容至1L，pH值为6.8-7.0)划线分离得到菌株H10。2、菌株的鉴定2.1、形态学鉴定将处于对数生长期，且菌落大小稳定，上述步骤1分离并纯化得到的菌株H10进行单菌落状态描述，主要包括菌落的大小、颜色、透明度、湿润度、菌落表面状态、菌落边缘状态。另一方面，对处于对数生长期的菌株H10，经涂片染色后采用光学显微镜观察菌体的形态。结果表明菌株H10属革兰氏染色阴性，小短杆状，菌体大小为0.5～0.9微米×1.2～6.0微米，在不同环境中生长的菌体形态不同。一般含有聚-β-羟基丁酸盐颗粒。无芽孢，具端生鞭毛或周生鞭毛，运动，好氧。最适生长温度25～30℃，最适pH6.0～7.0。菌落呈圆形，边缘整齐，微凸起，无色半透明或浅乳白色，粘稠。在酵母汁甘露醇无机盐琼脂培养基平板上生长3-6天后直径2～4mm。在含糖培养基上的生长物常伴有丰富的胞外粘液。2.2、16SrDNA序列同源性分析采用菌落PCR方法扩增步骤1所得的菌株H10的16SrDNA片段，相关试剂由全式金公司提供。对16SrRNA基因片段进行扩增并克隆测序的结果表明，菌株H10的16SrDNA具有序列表中序列1的核苷酸序列。菌株H10的16SrDNA与豌豆根瘤菌RhizobiumleguminosarumstrainINTAD156的16SrRNA基因(SequenceID:KX066064.1)的相似性最高为99％。2.3、生理生化特征鉴定参考《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册.北京:科学出版社，2011.)和《微生物学实验》(沈萍,范秀容,李广武.微生物学实验(第三版).北京:高等教育出版社,1999.)测定菌株H10的生理生化特征。结果表明菌株H10是化能异养型，能利用各种碳水化合物和有机酸的盐类作为碳源，如能利用葡萄糖、乳糖、D-核糖、D-纤维二糖、D-阿拉伯糖、甘露醇、木糖、D-半乳糖、果糖、卫矛醇和肌醇；能利用铵盐、硝酸盐和多数氨基酸可作为氮源；刚果红吸色反应微吸色；石蕊牛奶反应不凝结，不产酸；不能利用纤维素和淀粉；不能水解酪素；不利用3-酮基乳糖；从甘露醇产酸；在含糖培养基上生长常伴有丰富的胞外粘液；不产生硫化氢；不在甘油磷酸钙培养基产生沉淀。鉴于上述形态、生理生化特征分析和16srDNA序列同源性分析结果，将步骤1分离纯化得到的菌株H10鉴定为豌豆根瘤菌(Rhizobiumleguminosarum)。该豌豆根瘤菌(Rhizobiumleguminosarum)H10已于2015年12月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCCNo.11878，以下简称为豌豆根瘤菌H10。实施例2、促进豆科植物生长的菌剂1、豌豆根瘤菌H10的斜面培养将豌豆根瘤菌H10接种于固体培养基进行斜面培养，在28℃下培养56h。固体培养基的配制方法如下：丙三醇5ml，甘露醇5g，酵母浸粉1g，K2HPO40.5g，无水MgSO40.2g，CaSO4·2H2O0.2g，NaCl0.1g，1％(NH4)6Mo7O24·4H2O1ml、1％H3BO31ml，琼脂20g，用水定容至1000ml，调pH值为6.8-7.0，121℃灭菌30min。2、菌种的活化挑取步骤1斜面培养的豌豆根瘤菌H10，将其接种于500ml液体培养基中，在28℃下培养72h，得到豌豆根瘤菌H10菌液。液体培养基的配制方法如下：丙三醇5ml，甘露醇5g，酵母浸粉1g，K2HPO40.5g，无水MgSO40.2g，CaSO4·2H2O0.2g，NaCl0.1g，1％(NH4)6Mo7O24·4H2O1ml、1％H3BO31ml，用水定容至1000ml，调pH值为6.8-7.0，121℃灭菌30min。3、种子罐培养取6L步骤2的豌豆根瘤菌H10菌液，将其接入100L种子罐中(含有60L步骤2的液体培养基)进行种子培养，在30℃、120rpm下振荡培养60h培养，得到豌豆根瘤菌H10种子液。4、发酵罐培养按10％比例(体积比)将步骤3的豌豆根瘤菌H10种子液接入1000L发酵罐中(含有600L步骤2的液体培养基)进行发酵培养，在28℃、150rpm下振荡培养60h，得到豌豆根瘤菌H10发酵液，该豌豆根瘤菌H10发酵液中豌豆根瘤菌H10的含量为30亿cfu/mL。5、豌豆根瘤菌H10菌剂的制备将草炭自然干燥后进行粉碎，过100目筛，然后用石灰水调pH值为6.8，在121℃灭菌60min，得到无菌草炭。将步骤4的豌豆根瘤菌H10发酵液与该无菌草炭按3：1的比例混匀，再在28℃条件下增殖培养48h，得到豌豆根瘤菌H10菌剂，分装入库。经检测成品合格，该豌豆根瘤菌H10菌剂中的豌豆根瘤菌H10的含量为2.0×108cfu/克。实施例3、豌豆根瘤菌(Rhizobiumleguminosarum)H10CGMCCNo.11878与豌豆根瘤菌ACCC16001接种豌豆品种的效果比较试验一、ACCC16001菌剂的制备1、豌豆根瘤菌ACCC16001的斜面培养将豌豆根瘤菌ACCC16001接种于实施例2的固体培养基进行斜面培养，在28℃下培养56h。2、菌种的活化挑取步骤1斜面培养的豌豆根瘤菌ACCC16001，将其接种于500mL实施例2的液体培养基中，在28℃下培养72h，得到豌豆根瘤菌ACCC16001菌液。3、种子罐培养取6L步骤2的豌豆根瘤菌ACCC16001菌液，将其接入100L种子罐中(含有60L实施例2的液体培养基)进行种子培养，在30℃、120rpm下振荡培养60h培养，得到豌豆根瘤菌ACCC16001种子液。4、发酵罐培养按10％比例(体积比)将步骤3的豌豆根瘤菌ACCC16001种子液接入1000L发酵罐中(含有600L实施例2的液体培养基)进行发酵培养，在28℃、150rpm下振荡培养60h，得到豌豆根瘤菌ACCC16001发酵液，该豌豆根瘤菌ACCC16001发酵液中豌豆根瘤菌ACCC16001的含量为30亿cfu/ml。5、豌豆根瘤菌ACCC16001菌剂的制备将草炭自然干燥后进行粉碎，过100目筛，然后用石灰水调pH值为6.8，在121℃灭菌60min，得到无菌草炭。将步骤4的豌豆根瘤菌ACCC16001发酵液与该无菌草炭按3：1的比例混匀，再在28℃条件下增殖培养48h，得到豌豆根瘤菌ACCC16001菌剂，分装入库。经检测成品合格，该豌豆根瘤菌ACCC16001菌剂中的豌豆根瘤菌H10的含量为2.0×108cfu/g。二、促进豌豆和蚕豆生长实验选择草原23、草原24和草原28这3个豌豆品种和青海12和青海13这两个蚕豆品种进行促进生长实验：选择大小均一的种子，用浓硫酸浸泡2-3分钟之后用无菌水洗涤数次，以去除酸为止，得到处理后的种子。将每个品种处理后的种子分别设H10—品种处理、ACCC16001—品种处理和不接菌—品种对照处理(不接菌对照处理)。H10—品种处理中将实施例2的豌豆根瘤菌H10菌剂和种子按照1：10的质量比混合、拌匀。将实施例2的豌豆根瘤菌H10菌剂和草原23、草原24、草原28、青海12和青海13种子均按照1：10的质量比混合、拌匀得到的种子分别称为H10—草原23、H10—草原24、H10—草原28、H10—青海12和H10—青海13。ACCC16001—品种处理中将ACCC16001菌剂和种子按照1：10的质量比混合、拌匀。将ACCC16001菌剂和草原23、草原24、草原28、青海12和青海13种子均按照1：10的质量比混合、拌匀得到的种子分别称为ACCC16001—草原23、ACCC16001—草原24、ACCC16001—草原28、ACCC16001—青海12和ACCC16001—青海13。不接菌—品种对照处理中将实施例2中的无菌草炭和种子按照1：10的质量比混合、拌匀。将实施例2中的无菌草炭和草原23、草原24、草原28、青海12和青海13种子均按照1：10的质量比混合、拌匀得到的种子分别称为CK—草原23、CK—草原24、CK—草原28、CK—青海12和CK—青海13。将经过上述H10—品种处理、ACCC16001—品种处理和上述不接菌—品种对照处理的种子分别播种到装有相同土壤的盆中(15cm×18cm的盆中装有2.5kg土壤)，每盆播种10粒种子。实验重复三次，每次重复每个处理4盆。播种后放温室在相同条件下培养至开花期，记录各个植株地上部分高度(植株高度)、地上部分鲜重(植株鲜重)和地上部分干重(植株干重)，并计算出各组的平均值，分别得到植株平均高度、植株平均鲜重和植株平均干重。结果表明将豌豆根瘤菌ACCC16001接种品种草原23、草原24、草原28、青海12和青海13后，植株高度、植株鲜重和植株干重比不接菌对照鲜重增加：植株平均鲜重比不接菌对照植株分别增长11.09％、3.33％、9.21％、5.70％和13.46％，植株平均干重比不接菌对照植株分别增长12.81％、55.56％、11.36％、14.86％和8.52％，植株平均高度比不接菌对照植株分别增长22.87％、22.05％、15.56％、41.07％和16.71％(表1和2)。将豌豆根瘤菌H10接种草原23、草原24、草原28、青海12和青海13后，植株高度、植株鲜重和植株干重比不接菌对照鲜重增加：植株平均鲜重比不接菌对照植株分别增长76.09％、46.67％、78.95％、89.12％和76.10％，植株平均干重比不接菌对照植株分别增长556.61％、455.00％、597.16％、875.00％和377.78％，植株平均高度比不接菌对照植株分别增长109.19％、29.60％、69.97％、127.31％和90.81％(表1和3)。豌豆和蚕豆种子接种豌豆根瘤菌(Rhizobiumleguminosarum)H10CGMCCNo.11878后植株高度、植株鲜重和植株干重比接种豌豆根瘤菌ACCC16001的植株高度、植株鲜重和植株干重相比显著增加(表4)：草原23、草原24、草原28、青海12和青海13的植株平均高度分别增加70.25％、6.19％、47.08％、61.13％和63.49％，植株平均鲜重分别增加58.51％、41.94％、63.86％、78.92％和55.21％，植株平均干重分别增加482.05％、256.79％、526.02％、748.83％和340.27％(表4)。表明本发明的豌豆根瘤菌(Rhizobiumleguminosarum)H10CGMCCNo.11878比豌豆根瘤菌ACCC16001对豌豆和蚕豆具有更显著的促进生长和增产效果。表1、不接菌—品种对照的植株平均高度和植株平均鲜重和干重不接菌—品种对照植株平均高度(cm)植株平均鲜重(g/株)植株平均干重(g/10株)CK-草原2328.730.4600.242CK-草原2440.370.4200.180CK-草原2832.770.3800.176CK-青海1227.100.3860.148CK-青海1328.310.4310.270表2、豌豆根瘤菌ACCC16001与不接菌—品种对照效果比较结果表3、豌豆根瘤菌H10与不接菌—品种对照效果比较结果表4、豌豆根瘤菌H10与豌豆根瘤菌ACCC16001效果比较结果<110>中国农业科学院农业资源与农业区划研究所<120>一株豌豆根瘤菌及其发酵培养方法与应用<160>1<170>PatentInversion3.5<210>1<211>1034<212>DNA<213>豌豆根瘤菌（Rhizobiumleguminosarum）<400>1tgatgaaggccctagggttgtaaagctctttcaccggagaagataatgacggtatccgga60gaagaagccccggctaacttcgtgccagcagccgcggtaatacgaagggggctagcgttg120ttcggaattactgggcgtaaagcgcacgtaggcggatcgatcagtcaggggtgaaatccc180agggctcaaccctggaactgcctttgatactgtcgatctggagtatggaagaggtgagtg240gaattccgagtgtagaggtgaaattcgtagatattcggaggaacaccagtggcgaaggcg300gctcactggtccattactgacgctgaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagat360accctggtagtccacgccgtaaacgatgaatgttagccgtcgggcagtatactgttcggt420ggcgcagctaacgcattaaacattccgcctggggagtacggtcgcaagattaaaactcaa480aggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgc540agaaccttaccagcccttgacatgcccggctacttgcagagatgcaaggttcccttcggg600gaccgggacacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaag660tcccgcaacgagcgcaaccctcgcccttagttgccagcattcagttgggcactctaaggg720gactgccggtgataagccgagaggaaggtggggatgacgtcaagtcctcatggcccttac780gggctgggctacacacgtgctacaatggtggtgacagtgggcagcgagcacgcgagtgtg840agctaatctccaaaagccatctcagttcggattgcactctgcaactcgagtgcatgaagt900tggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtac960acaccgcccgtcacaccatgggagttggttttacccgaaggtagtgcgctaaccgcaagg1020aggcagctaaccag1034当前第1页1 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