一种大豆根瘤菌培养基以及用其制备大豆液体根瘤菌剂的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及根瘤菌培养基W及采用其制备大豆根瘤菌剂的方法。
【背景技术】
[0002] 中国耕地面积占全世界耕地面积的7%，而氮肥用量却占全球总用量的25%，是 世界平均用量的3. 75倍。生产化工合成氮肥将消耗大量的、不可再生的石化原料，如天然 气、石油和煤炭等。随着自然能源有限储量的不断减少，石油天然气的价格将持续攀升，从 而不可避免地拉动化肥价格上涨。化肥工业还是造成环境污染，产生溫室气体的重要源头。 化肥在施入田间后会造成±壤板结，降低±地生产潜力。植物对化肥的吸收利用率只有 30 %，运意味着有70 %的氮肥不仅没有滋养作物，而且进入地下水源和空气中，造成饮用水 和空气质量下降，进而危害我们的身体健康。
[0003] 事实上大豆生长所需的氮素营养基本上由根瘤菌提供，如果没有根瘤菌的存在， 每亩要施一百多公斤尿素才能满足亩产180公斤大豆的氮肥需求。
[0004] 一亩地产180公斤大豆，同时还要产270公斤的賴杆；
[0005] 大豆蛋白质含量按40%计算：180X0. 4 = 72公斤（蛋白质）；
[0006] 賴杆蛋白质含量按10%计算：270X0. 1 = 27公斤（蛋白质）；
[0007] 一亩地产蛋白质：7化27 = 99公斤；
[0008] 蛋白质的氮含量为16%，生产99公斤蛋白质需99X0. 16 = 15. 84公斤纯氮；
[0009] 15. 84公斤纯氮折合尿素：15. 84今0. 46 = 34. 43公斤尿素；
[0010] 考虑到尿素的利用率一般在30%W下，34. 43今0.3 = 115公斤。
[0011] 运就是说，如果没有根瘤菌提供氮肥，每生产180公斤大豆需要施115公斤尿素才 能满足氮素需求。所W说大豆的氮肥基本上是根瘤菌贡献的。由此可见，根瘤菌的好与坏 对大豆的生产至关重要。
[0012] 根瘤菌接种技术之所W在我国未能广泛采用，除了科学知识普及不够，农民对根 瘤菌的作用不甚了解外，最主要原因是根瘤菌产品质量不过关，保质期短。根瘤菌剂的有效 成份是活的根瘤菌，但如果制剂不过关，当产品经过一个长的供应链到达农民手中时往往 只有少量活性根瘤菌，实际应用效果不明显。
[0013] 目前，采用文献公开报道的培养基和常规发酵工艺（主要是用于芽抱杆菌发酵） 的方法生产大豆液体根瘤菌剂，存在着营养不平衡、菌体活性低的弊端，而且，目前培养大 豆根瘤菌的培养基碳源交单一，虽然大多数培养基能很好地支持根瘤菌生长，菌数可达 30-80亿/毫升，但它们基本上都难W在室溫下稳定存活，其常溫放置2个月的活菌数仅为 1 ~10%。
【发明内容】
[0014] 本发明的目的是为了解决现有存在的大豆液体根瘤菌剂营养不均衡、菌体活性低 和发酵工艺制备的大豆根瘤菌在室溫下不能稳定存活的问题，而提供大豆根瘤菌培养基w及采用其制备大豆液体根瘤菌剂的方法。
[0015] 一种大豆根瘤菌培养基，其特征在于：包括W下组分：丙Ξ醇、甘露醇、葡萄糖、鼠 李糖、果糖、α-酬戊二酸、酵母粉、丝氨酸、精氨酸、氯化锭、憐酸氨二钟、憐酸二氨钟、屯水 合硫酸儀、二水合氯化巧、屯水合硫酸铁、氯化钢、二水合钢酸钢、生物素和水；其中，各组分 相对水的溶度分别为：丙Ξ醇浓度为1~3克/升、甘露醇浓度为1~3克/升、葡萄糖浓 度为1~3克/升、鼠李糖浓度为1~3克/升、果糖浓度为1~3克/升、α-酬戊二酸 浓度为0. 5~1. 5克/升、酵母粉浓度为2. 5~4. 5克/升、丝氨酸浓度为0. 13~0. 25克 /升、精氨酸浓度为0. 1~0. 2克/升、氯化锭浓度为0. 65~1. 6克/升、憐酸氨二钟浓度 为1~3克/升、憐酸二氨钟浓度为0. 2~0. 5克/升、屯水合硫酸儀浓度为0. 1~0. 3克 /升、二水合氯化巧浓度为0. 1~0. 2克/升、屯水合硫酸铁浓度为0. 005~0. 011克/升、 氯化钢浓度为0. 05~0. 15克/升、二水合钢酸钢浓度为0. 01~0. 03克/升、生物素浓度 为0. 0005~0. 002克/升，所述的培养基抑为6. 8~7. 5。
[0016] 进一步，所述的丙Ξ醇浓度为1. 5~2. 5克/升、甘露醇浓度为1. 5~2. 5克/升、 葡萄糖浓度为1. 5~2. 5克/升、鼠李糖浓度为1. 5~2. 5克/升、果糖浓度为1. 5~2. 5 克/升、α-酬戊二酸浓度为0. 75~1. 25克/升、酵母粉浓度为3. 0~4. 0克/升、丝氨 酸浓度为0. 15~0. 20克/升、精氨酸浓度为0. 125~0. 175克/升、氯化锭浓度为0. 8~ 1. 25克/升、憐酸氨二钟浓度为1. 1~1. 6克/升、憐酸二氨钟浓度为0. 25~0. 4克/升、 屯水合硫酸儀浓度为0. 15~0. 25克/升、二水合氯化巧浓度为0. 11~0. 15克/升、屯水 合硫酸铁浓度为0. 006~0. 009克/升、氯化钢浓度为0. 08~0. 12克/升、二水合钢酸钢 浓度为0. 015~0. 025克/升和生物素浓度为0. 0008~0. 0012克/升。
[0017] 进一步，所述的丙Ξ醇浓度为2克/升、甘露醇浓度为2. 0克/升、葡萄糖浓度为 2. 0克/升、鼠李糖浓度为2. 0克/升、果糖浓度为2. 0克/升、α-酬戊二酸浓度为1. 0克 /升、酵母粉浓度为3. 5克/升、丝氨酸浓度为0. 18克/升、精氨酸浓度为0. 15克/升、氯 化锭浓度为1. 1克/升、憐酸氨二钟浓度为1. 2克/升、憐酸二氨钟浓度为0. 34克/升、 屯水合硫酸儀浓度为0. 2克/升、二水合氯化巧浓度为0. 13克/升、屯水合硫酸铁浓度为 0. 0083克/升、氯化钢浓度为0. 1克/升、二水合钢酸钢浓度为0. 02克/升和生物素浓度 为0.001克/升。
[0018] 利用该大豆根瘤菌培养基制备大豆液体根瘤菌剂的方法，包括W下步骤：
[0019] 步骤一，按丙Ξ醇浓度为1~3克/升、甘露醇浓度为1~3克/升、葡萄糖浓度 为1~3克/升、鼠李糖浓度为1~3克/升、果糖浓度为1~3克/升、α-酬戊二酸浓 度为0. 5~1. 5克/升、酵母粉浓度为2. 5~4. 5克/升、丝氨酸浓度为0. 13~0. 25克/ 升、精氨酸浓度为0. 1~0. 2克/升、氯化锭浓度为0. 65~1. 6克/升、憐酸氨二钟浓度为 1~3克/升、憐酸二氨钟浓度为0. 2~0. 5克/升、屯水合硫酸儀浓度为0. 1~0. 3克/ 升、二水合氯化巧浓度为0. 1~0. 2克/升、屯水合硫酸铁浓度为0. 005~0. 011克/升、 氯化钢浓度为0. 05~0. 15克/升、二水合钢酸钢浓度为0. 01~0. 03克/升、生物素浓度 为0. 0005~0. 002克/升称取上述物质，并依次加入到纯水中混合均匀，调节pH至6. 8~ 7. 5,得大豆液体根瘤菌培养基；
[0020] 步骤二，将步骤一得到的大豆液体根瘤菌培养基加入到发酵罐中，12rc高压灭菌 20min，待培养基溫度降至30°C时，将大豆根瘤菌按体积百分含量为5%~10%的接种量接 种至灭菌的大豆液体根瘤菌培养基中，在发酵溫度为25~35°C、揽拌速度为50~15化/ min、空气流量为0. 3~0. 6v/v/m、罐压为0. 05~0. 2kPa、溶氧为60 %~80 %、发酵液抑 为6. 5~7. 5的条件下，发酵72~14地，即得大豆液体根瘤菌剂。
[0021] 进一步，步骤一中所述的按丙Ξ醇浓度为1. 5~2. 5克/升、甘露醇浓度为1. 5~ 2. 5克/升、葡萄糖浓度为1. 5~2. 5克/升、鼠李糖浓度为1. 5~2. 5克/升