一种高效促进大豆根瘤菌竞争结瘤的大豆根系分泌物的制备方法
【专利摘要】本发明一种高效促进大豆根瘤菌竞争结瘤的大豆根系分泌物的制备方法，属于生物工程【技术领域】。该方法包括下述步骤：(1)对大豆种子进行表面灭菌处理；(2)将经过灭菌的大豆种子在无菌条件下移至YMA琼脂表面皿中催芽，待种子发芽后，移至灭菌的浓度为30％的无氮Rigaud-Puppo营养液进行培养，在培养第12天收集大豆根系分泌物，即得高效促进大豆根瘤菌竞争结瘤的大豆根系分泌物。本发明具有确定了无氮Rigaud-Puppo营养液最佳浓度为30％，收集时间为12d时所收集的大豆根系分泌物能显著提高大豆根瘤菌结瘤基因的表达，进而体现其高效促进大豆竞争结瘤效果的优点。
【专利说明】一种高效促进大豆根瘤菌竞争结瘤的大豆根系分泌物的制 备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程【技术领域】，具体涉及一种高效促进大豆根瘤菌竞争结瘤的大 豆根系分泌物的制备方法。
【背景技术】
[0002] 根瘤菌-豆科植物构成的共生体系是自然界生物固氮效率最高的体系，其固氮量 占整个生物固氮量的3/4,成为农业生产的主要氮源，大豆与大豆根瘤菌的共生体系是生物 固氮中的典型代表。利用大豆根瘤菌接种豆科植物以提高其固氮效率已有100多年历史， 作为一项节本增效的农业措施，在许多国家得到了广泛的应用。然而，作为大豆起源地的中 国，大豆根瘤菌的接种面积仅占大豆种植面积的2%左右，远低于美国、巴西、阿根廷等主要 大豆主产国70%以上接种率。其主要原因是具有高效匹配和竞争结瘤能力的优良菌株的筛 选和根瘤菌竞争结瘤过程中与豆科植物根系分泌物间信号识别的"分子对话"研究滞后于 生产，导致接种根瘤菌的竞争结瘤能力差，土壤中存在大量的土著根瘤菌群，干扰和降低了 接种根瘤菌的占瘤率，致使接种根瘤菌剂的增产效果不显著，制约了其应用和发展。
[0003] 大豆根瘤菌的竞争结瘤是以大豆宿主与大豆根瘤菌菌株之间可扩散复杂信号分 子的特异识别为基础的复杂调控过程，这一过程受到一系列由大豆品种和根瘤菌菌株双方 提供的信号分子的严格调控。研究表明，根瘤菌的竞争结瘤决于菌株自身产生的不同NodD 调节蛋白与豆科植物根系不同分泌物组分的早期相互作用，大豆苷元和染料木黄酮是一类 能影响根瘤菌结瘤的黄酮物质。为了响应豆科植物分泌的类黄酮类物质，根瘤菌可以合成 宿主特异的（LCOs)作为精确外源结瘤因子，从而启动根瘤菌和宿主的早期识别。特异结瘤 因子的物质骨架都是由普通的nod基因（nodABC)合成，而后进一步被其他nod基因所编码 的蛋白质所修饰。根瘤菌中NodD(原核生物LysR家族转录调节因子）通过与宿主特异的 类黄酮进行相互识别，能够激活结瘤基因的表达。
[0004] 大豆根瘤菌nod基因的表达受到宿主大豆根系分泌物的影响，很多研究大多采用 类黄酮类纯物质、大豆苷元或大豆幼苗根系提取物来代替大豆根系分泌物，但实际上，豆科 植物根系分泌物组分复杂，截至目前，已发现豆科植物根系分泌物中的类黄酮种类已超过 4000种，某些单一的纯组分或几种纯组分的复合虽然能够影响大豆根瘤菌nod基因的表 达，但研究结果有一定的片面性；大豆苷元及大豆幼苗根系提取物能够影响根瘤菌竞争结 瘤，但在其制备过程中，还包含了大豆根系组织，并不能真正模拟大豆根系中的实际环境； 除此之外，目前已报导的大豆根系分泌物的收集大都集中在收集装置的设计上，对培养条 件和收集时间上存在较大的主观性，其组分和浓度未知，有效性也无法评价，在一定程度上 制约了研究的深入。因此，建立大豆根系分泌物的制备方法，并对其有效性进行评价，对研 究大豆根系分泌物与根瘤菌的互作、大豆根瘤菌nod基因表达的分子调控机制以及高效菌 株的筛选具有重要的理论价值和实践意义。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于公开了一种高效促进大豆根瘤菌竞争结瘤的大豆根系分泌物 的制备方法。
[0006] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
[0007] -种高效促进大豆根瘤菌竞争结瘤的大豆根系分泌物的制备方法，包括下述步 骤：
[0008] (1)、对大豆种子先用蒸馏水洗净，放入95%的酒精中浸泡lmin，转至5%次氯酸 纳溶液浸泡5min进行表面灭菌，然后用无菌水冲洗至少10次；
[0009](2)、将经过表面灭菌的大豆种子在无菌条件下移至YMA琼脂表面皿中催芽，待种 子发芽后，移至灭菌的浓度为30 %的无氮Rigaud-Puppo营养液进行培养，在培养第12天收 集大豆根系分泌物，即得高效促进大豆根瘤菌竞争结瘤的大豆根系分泌物；其中培养条件 为：白天30°C、16h光照，光照强度为960iimol?JiT2 ?S4 ;夜间15°C、8h黑暗。
[0010] 上述技术方案所述的一种高效促进大豆根瘤菌竞争结瘤的大豆根系分泌物的制 备方法，其中，YMA培养基组成为：甘露糖醇 10. 0g、K2HP040. 5g、MgS04，7H20 0. 2g、NaC10.lg、 酵母粉0.88、0&〇)31.5 8、浓度为0.5%的刚果红51111、琼脂15-2(^、1120 10001111;￥麻培养基 pH值为6. 8?7. 0。
[0011] 上述技术方案所述的一种高效促进大豆根瘤菌竞争结瘤的大豆根系分泌物的制 备方法，其中，无氮Rigaud-Puppo营养液中的成分为：CoCl2 *6H20 0? 004mg/L、H3B032. 86mg/ L、MnCl2 ? 4H20I. 81mg/L、ZnSO4 ? 7H20 0? 22mg/L、CuSO4 ?SH2O0? 102mg/L、Na2MoO4 ? 2H20 0? 122mg/L、MgSO4 ? 7H20 492. 96mg/L、K2HP04174. 18mg/L、KH2P04136 . 886mg/L、CaCl2 ? 2H20 110. 99mg/L和FeC6H5O7 ? 5H20 5. 62mg/L。
[0012] 本发明具有以下有益效果：
[0013] 本发明确定了当无氮Rigaud-Puppo营养液最佳浓度为30%，收集时间为12d时 所收集的大豆根系分泌物能显著提高大豆根瘤菌结瘤基因的表达，具体表现为：当无氮 Rigaud-Puppo营养液浓度为30 %所收集的大豆根系分泌物，能使菌株Bradyrhizobium diazoefficiensUSDA110中nodC和nodDl基因分别较对照上调5. 48倍和4. 95倍，使菌株 BradyrhizobiumjaponicumUSDA6 中nodC和nodDl基因分别较对照上调 1. 92 倍和 3. 04 倍；当收集时间为12d时所收集的大豆根系分泌物，能使菌株B.diazoefficiensUSDA110 中nodC和nodDl基因分别较对照上调22. 41倍和8. 27倍，使菌株B.japonicumUSDA6中 nodC和nodDl基因分别较对照上调11. 86倍和7. 33倍。最终通过nod基因的上调实现高 效促进大豆根瘤菌竞争结瘤的效果。
【专利附图】
【附图说明】：
[0014] 1、图1为大豆根系分泌物收集玻璃容器；
[0015] 2、图2为大豆根系分泌物收集玻璃容器置于光照培养箱内生长照片；
[0016] 3、图3为不同营养液浓度条件下收集的根系分泌物对菌株B.diazoefficiens USDA110中nod基因的诱导表达差异；
[0017] 4、图4为不同营养液浓度条件下收集的根系分泌物对菌株B.japonicumUSDA6 中nod基因的诱导表达差异；
[0018] 5、图5为不同时期收集的根系分泌物对菌株B. diazoefficiens USDA 110中nod 基因的诱导表达差异；
[0019] 6、图6为不同时期收集的根系分泌物对菌株B. japonicum USDA 6中nod基因的 诱导表达差异。
【具体实施方式】：
[0020] 为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体试验例对本发明一种高效促进大 豆根瘤菌竞争结瘤的大豆根系分泌物的制备方法作进一步的说明。
[0021] 实施例1 :一种高效促进大豆根瘤菌竞争结瘤的大豆根系分泌物的制备方法:
[0022] (1)、对大豆种子先用蒸馏水洗净，放入95%的酒精中浸泡lmin，转至5%次氯酸 纳溶液浸泡5min进行表面灭菌，然后用无菌水冲洗至少10次；
[0023](2)、将经过表面灭菌的大豆种子在无菌条件下移至YM琼脂表面皿中催芽，待种 子发芽后，移至灭菌的浓度为30 %的无氮Rigaud-Puppo营养液进行培养，在培养第12天收 集大豆根系分泌物，即得高效促进大豆根瘤菌竞争结瘤的大豆根系分泌物；其中培养条件 为：白天30°C、16h光照，光照强度为960iimol?JiT2 ?S4 ;夜间15°C、8h黑暗。
[0024] 以下通过具体试验例来说明本发明的一种高效促进大豆根瘤菌竞争结瘤的大豆 根系分泌物的制备方法所具有的有益效果：
[0025]试验例1 :大豆根系分泌物的制备方法中营养液浓度和收集时间的确定:
[0026] -、大豆根系分泌物的收集：
[0027] 1、大豆根系分泌物收集装置：
[0028] 选择圆柱形容器，在距离容器底部一定高度处放置带孔圆板用于支撑大豆植株， 容器用无菌过滤透气封口膜密封。上述容器及支撑圆板材质不限，但须耐12rC，30min高 温灭菌。本发明选用的是圆柱形玻璃容器（小150mmX250mm)，在距离容器底部约1/4高度 设置聚丙烯圆板，匀布设圆孔（小8mm)约80个，装置如图1所示。容器内置500ml不同浓 度无氮Rigaud-Puppo营养液，成分见表1，12rC，30min灭菌待用。
[0029] 表1无氮Rigaud-Puppo营养液成分
[0030]
【权利要求】
1. 一种高效促进大豆根瘤菌竞争结瘤的大豆根系分泌物的制备方法，包括下述步骤： (1) 、对大豆种子先用蒸馏水洗净，放入95 %的酒精中浸泡lmin，转至5 %次氯酸纳溶 液浸泡5min进行表面灭菌，然后用无菌水冲洗至少10次； (2) 、将经过表面灭菌的大豆种子在无菌条件下移至YMA琼脂表面皿中催芽，待种子发 芽后，移至灭菌的浓度为30%的无氮Rigaud-Puppo营养液进行培养，在培养第12天收集 大豆根系分泌物，即得高效促进大豆根瘤菌竞争结瘤的大豆根系分泌物；其中培养条件为： 白天30°C、16h光照，光照强度为960 y mol ? nT2 ? s4 ;夜间15°C、8h黑暗。
2. 根据权利要求1所述的一种高效促进大豆根瘤菌竞争结瘤的大豆根系分泌物的制 备方法，其特征在于，YMA培养基组成为：甘露糖醇10. 0g、K2HP040. 5g、MgS04 *711200. 2g、NaCl 〇.18、酵母粉〇.88工&0)31.58、浓度为0.5%的刚果红51111、琼脂15-2(^、11 20 100〇1111;￥麻培 养基pH值为6. 8?7.0。
3. 根据权利要求1所述的一种高效促进大豆根瘤菌竞争结瘤的大豆根系分泌物的 制备方法，其特征在于，无氮Rigaud-Puppo营养液中的成分为：CoCl2 ? 6H200. 004mg/L、 H3B032. 86mg/L、MnCl2 ? 4H20 1. 81mg/L、ZnS04 ? 7H20 0? 22mg/L、CuS04 ? 5H20 0? 102mg/L、 Na2Mo04 ? 2H20 0? 122mg/L、MgS04 ? 7H20 492. 96mg/L、K2HP04174. 18mg/L、KH2P04136 . 886mg/ L、CaCl2 ? 2H20 110. 99mg/L 和 FeC6H507 ? 5H20 5. 62mg/L。
【文档编号】A01H4/00GK104351047SQ201410439069
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年8月28日 优先权日:2014年8月28日
【发明者】李俊, 马鸣超, 姜昕, 关大伟, 刘尧, 曹凤明, 陈慧君, 沈德龙, 杨小红, 李力 申请人:中国农业科学院农业资源与农业区划研究所