一种大豆根瘤内生菌DEnt1302及其制备方法和应用,菌剂及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种大豆根瘤内生菌DEntl302及其制备 方法和应用，菌剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 小麦是我国的大宗作物，每年施用大量化肥来提高作物小麦的生长和产量给土壤 结构和生态环境带来极大的破坏。目前，开发和筛选生物促生菌株来研发生物促生菌剂，对 保持绿色农业和生态环境的可持续发展具有重要意义。一些对草类和其他作物植物具有 生长促进作用的土壤微生物菌株如 Azospirillum sp.，Enterobacter sp.，Pseudomonas sp. ， Klebsiella sp. ， Serratia sp. ， Bacillus sp. ， Enterobacter sp. ， Pantoea sp.， Listeria sp. ，Xanthomonas sp.和 Micrococcus spp. 〇
[0003] 已有报道，Bacillus分离自小麦和草类根际被认为是有效的固氮菌株； Azospirillum接种谷物和草类提高产量和干物质重量已引起特别的重视;Mauricio Shoebitz 等在〈〈Plant growth promoting properties of a strain of Enterobacter ludwigii isolated from Lolium perenne rhizosphere》的研究报道表明，分离自黑 麦草根际的Enterobacter ludwgii接种黑麦草，对垄、根的鲜重和高度都有显著的提 高；Stefan Kutter 等在《Colonization of bar 1 ey (Hordeumvu 1 gare)with Salmonella enteric and Listeria spp》的研究报道中表明 Gluconoacetobacter diazotrophicus， Herbaspirillum seropedicaeor能定殖在甘薦、水稻和草类，具有固氮等功能；Dilafruz Juraeva 等在《Study the possible mechanisms of plant growth promotion by wheat diazotrophic bacteria grown in Uzbekistan soil》的研究报道中表明分离自小麦根 部和根际的 Bacillus licheniformis BL43 和 Xanthomonas sp. Xsl48 对冬小麦具有促生 长作用；中国专利CN103952344A公开了一种高效固氮大豆根瘤菌SCAUs46,该根瘤菌具有 分泌吲噪乙酸的能力、具有溶无机磷、有机磷和溶钾能力、抗逆性强，属于Bradyrhizobium diazoefficiens ;中国专利 CN102796684A 公开 了一种 Enterobacter ludwigii 菌株 MJM-11，产生ACC脱氨酶、吲哚乙酸、嗜铁素等促进植物生长，不具有溶解有机磷、无机磷、 产生果胶酶和纤维素酶的作用。
[0004] 产生果胶酶和纤维素酶的菌株均具有较强入侵能力，能够定殖在宿主植物体内， 表现为较强的定殖功能，进入宿主植物组织内部、诱导宿主抗性（ISR)、抑制和防治植物病 原真菌菌丝的生长和发展具有重要意义。
【发明内容】
[0005] 为了克服现有技术的缺陷，本发明的目的之一在于提供一种能够分泌吲哚乙酸， 具有产生果胶酶、纤维素酶、ACC脱氨酶，溶解无机磷的促小麦幼苗生长的大豆根瘤内生菌 DEntl302〇
[0006] 本发明的目的之二在于提供一种大豆根瘤内生菌DEntl302的制备方法。
[0007] 本发明的目的之三在于提供一种促小麦幼苗生长的菌剂。
[0008] 本发明的目的之四在于提供一种促小麦幼苗生长的菌剂的制备方法。
[0009] 本发明的目的之五在于提供一种大豆根瘤内生菌DEntl302在促小麦生长方面的 应用。
[0010] 本发明的目的之六在于提供一种大豆根瘤内生菌DEntl302在制备纤维素酶方面 的应用。
[0011] 本发明的目的之七在于提供一种大豆根瘤内生菌DEntl302在制备果胶酶方面的 应用。
[0012] 本发明的目的之八在于提供一种大豆根瘤内生菌DEntl302在制备ACC脱氨酶方 面的应用。
[0013] 本发明的目的之九在于提供一种大豆根瘤内生菌DEntl302在制备吲哚乙酸方面 的应用。
[0014] 为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
[0015] -种大豆根瘤内生菌DEntl302,该大豆根瘤内生菌DEntl302为肠杆菌 (Enterobacter ludwigi)DEntl302,于2013年12月1日保藏在位于中国湖北省武汉市武 汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO :M2013621。
[0016] 上述大豆根瘤内生菌DEntl302的制备方法，包括以下操作步骤：
[0017] 1)对大豆根瘤进行表面消毒处理；
[0018] 2)在无菌条件下，取表面消毒处理后的大豆根瘤汁液涂抹在牛肉膏蛋白胨培养基 平板上进行培养；
[0019] 3)步骤2)培养获得的单菌落分别转移到牛肉膏蛋白胨培养基上进行划线分离， 筛选获得菌体大小均一，形状一致的菌株，即得所述的大豆根瘤内生菌DEntl302。
[0020] 步骤1)中所述的大豆根瘤为选择开花期的大豆植株，筛选健康、饱满、粉红色大 豆根瘤。
[0021] 步骤1)中所述的表面消毒处理的具体方法为：将大豆根瘤用无菌水清洗后，经无 水乙醇处理20~30s，再采用质量体积百分含量为3%的NaCIO处理3~5min，再用无菌水 洗涤5~8次。保留最后一次洗涤的水，涂布在牛肉膏蛋白胨培养基上培养，观察培养基表 面是否有菌落形成，如无菌落表明大豆根瘤表面消毒彻底。
[0022] 步骤2)中所述大豆根瘤汁液的获取方法为：用无菌镊子在无菌条件下压迫根瘤， 挤压出汁液，即得大豆根瘤汁液。
[0023] 步骤2)中所述培养为28°C温度下倒置培养2~7天。
[0024] 将上述步骤3)获得的菌株对应的单菌落接种到牛肉膏蛋白胨固体斜面培养基 上，28°C温度下培养3~5天，至管内菌苔饱满，4°C低温短期保藏7~30天。
[0025] 或将上述步骤3)获得的菌株对应的单菌落接种到牛肉膏蛋白胨固体斜面培养基 上，28°C温度下培养3~5天，至管内菌苔饱满，采用体积浓度为30%的甘油将菌苔刮下制 成菌悬液，_80°C低温冷冻长期保藏1~10年。
[0026] 所述牛肉膏蛋白胨培养基的组成为：每1000ml水中含有牛肉膏2~4g，蛋白胨 8 ~12g，NaCl 3 ~6g，琼脂 15 ~20g。
[0027] -种促小麦幼苗生长的菌剂，由含有如权利要求1所述的大豆根瘤内生菌 DEntl302的菌悬液与无菌水复配而成；其中菌悬液的浓度为10 8CFU/ml，菌悬液与无菌水的 体积比为（1~2) : (1~5)。
[0028] 所述菌悬液与无菌水的体积比为1 :2。
[0029] 上述促小麦幼苗生长的菌剂的制备方法，其特征在于，包括采用YM液体培养基对 如权利要求1所述的大豆根瘤内生菌DEntl302进行活化培养后，收集菌体，制成浓度为 10 8CFU/ml的菌悬液，将菌悬液与无菌水复配，即得所述的促小麦幼苗生长的菌剂。
[0030] 所述YM液体培养基的组成为：甘露醇10g，K2HP040. 5g，MgS04?7H200?2g，NaCl 0? 10g，酵母粉3. 0g，H20 1000mL，pH 6. 8-7. 0。
[0031] 所述活化培养的条件为：28°C~30°C恒温130rpm振荡培养3~4天。
[0032] 所述收集菌体的具体方法为：活化培养后在8000rpm条件下冷冻离心10min，收集 沉淀菌体，并用无菌水清洗菌体。
[0033] 上述大豆根瘤内生菌DEntl302在促进小麦生长方面的应用。
[0034]上述大豆根瘤内生菌DEntl302在制备纤维素酶方面的应用。在含有羧甲基纤维 素和胰蛋白胨的NFB培养基中培养上述大豆根瘤内生菌DEntl302,收集发酵产物，即得纤 维素酶。其中所述NFB培养基的组成为：DL-苹果酸5. 0g，K2HP040. 5g，MgS04 ? 7H200. 2g， NaclO. lg，Cacl20. 2g，微量元素2ml;每1000ml微量元素的配方为：Na2Mo04 ? 2H200. 2g， MnS04 ? 7H20 0? 2g，H3B030. 28g，Cu