专利名称：：保质期延长及增强种上稳定性的液体细菌接种剂的制作方法
技术领域：
：本发明涉及液体接种剂，尤其涉及一种提高液体接种剂中细菌在包装容器内和施用于种子之后的存活和稳定性的方法。
背景技术：
：据我们所知，对植物有益的微生物种类繁多，它们包括根瘤菌(朋^Wi'鹏)(包括慢生根瘤菌属(Ara办r/Lf^^i鹏))、假单胞菌属(尸5"e〃Jo膨/7S5")、沙雷氏菌属(Serrs"a)、杆菌属(jfeci^iAs)(包括类芽胞杆菌属(尸ae/7J'^cj7^/5"))、巴斯德氏菌属(尸<95~te〃ria)、固氮菌属(z^6acter)、肠杆菌属(￡^teir^sc、固氮螺菌属(力^xs^j'rj7Ji/zff)、甲基杆菌属(#e^j^oZ<3"eriw/z)、蓝细菌(O^w^cter^)(蓝绿藻(blue-greenalgae))等细菌和菌根真菌(mycorrhizalfungae)。利用接种剂组合物可以将这些微生物导入植物。制备接种剂组合物的方法包括通常在营养培养基中使微生物发酵的步骤。可以直接将接种剂组合物施到植物种子上，也可以在播种前将其尽速施到犁沟内。往种子或土壤内接种有益微生物以提高产量的做法已风行多年。但得到的结果却往往变化不一，波动起伏，其原因可能是由于接种剂活性丧失，或者接种剂活性变化而导致剂量变化所致。播种时，无论将接种剂施到犁沟内还是种子内，接种剂内的微生物都来不及适应新环境。所以接种剂中的微生物的存活可能较低。为提高接种剂中微生物活性，目前的通行做法是，将接种剂加到种子内或播种时，往接种剂内添加糖或聚合物等补充剂。由于这些补充剂是在接种剂装到容器之后才添加的，所以它们对装在容器内的接种剂的存活状态和稳定性并不产生效果。另外，往种子内加入接种剂或播种时添加补充剂不仅劳神费事，而且通常还得该接种剂的终端用户(如农民)在无法操控的环境下(如谷仓或农田)亲力亲为。所以在使用补充剂时往往会操作不当。为克服在接种剂制备好之后添加补充剂所引起的种种问题，还有一种做法就是，在制备液体接种剂的发酵阶段之前将补充剂加到营养培养基中。但是，在发酵前按最适宜接种剂在种上(onseed)存活的量加入补充剂时，微生物的生长却受到抑制。所以，需要发明一种方法来提高储存期间液体接种剂中微生物(如细菌)的存活和稳定性，以及液体接种剂施到种子上之后微生物的种上存活和稳定性。
发明内容本发明的一个实施例是关于制备含干燥剂的液体接种剂产品的方法。该方法包括提供细菌生长已达到近稳定期(substantiallystationaryphase)的液体接种剂。将含有干燥剂的干燥处理剂加到液体接种剂中制得半干燥接种剂(partiallydesiccatedinoculant)产品。本发明的另一实施例中，将半干燥接种剂包装后储存。本发明的再一实施例中，将半干燥接种剂施到种子上。图l是表示本发明的几个实施例中，液体肉汤中慢生大豆根瘤菌(j5raoyr力i^^j'鹏j'邵朋j'c湖)的存活情况与时间、温度之间的函数关系图。图2是表示本发明的几个实施例中，液体肉汤中慢生大豆根瘤菌的存活情况与时间、温度之间的函数关系图。图3是表示本发明的几个实施例中，慢生大豆根瘤菌的种上存活情况与时间、温度之间的函数关系图。图4是表示本发明的几个实施例中，液体肉汤中慢生大豆根瘤菌的存活情况与干燥剂类型和用量之间的函数关系图。图5是表示本发明的几个实施例中，液体肉汤中慢生大豆根瘤菌的存活情况与干燥剂类型和用量之间的函数关系图。图6是表示本发明的几个实施例中，慢生大豆根瘤菌的种上存活情况与干燥剂类型和用量之间的函数关系图。图7是表示本发明的几个实施例中，液体肉汤中荧光假单胞菌(/^eWoMM^/7ware5re/L9)的存活情况与干燥剂类型和用量之间的函数关系图。图8是表示本发明的几个实施例中，液体肉汤中Spro"oya3c"h/^的存活情况与干燥剂类型和用量之间的函数关系图。图9是表示本发明的几个实施例中，慢生大豆根瘤菌群和时间之间的函数关系图。图10是表示本发明的几个实施例中，慢生大豆根瘤菌群和时间之间的函数关系图。图1l是表示本发明的几个实施例中，根瘤菌群和时间之间的函数关系图。图12是表示本发明的几个实施例中，根瘤菌群和时间之间的函数关系图。图13是表示本发明的几个实施例中，慢生大豆根瘤菌群和时间之间的函数关系图。图14是表示本发明的几个实施例中，慢生大豆根瘤菌群和时间之间的函数关系图。具体实施例方式本发明提供一种制备液体接种剂的方法。该方法包括在细菌生长达到近稳定期后向液体接种剂中加入干燥剂的步骤。将干燥剂加到液体接种剂中制得半干燥接种剂。通过这种方法制成的半干燥接种剂无论在包装容器内，还是施到种子上之后，其细菌稳定性均得到增强。而稳定性增强使包装容器内和种子上的细菌存活相应提高。将细菌接种到液体培养基中获得细菌培养物。可将各种微生物接种到液体营养培养基中，具体包括但不限于根瘤菌(包括慢生根瘤菌属)、假单胞菌属、沙雷氏菌属、杆菌属(包括类芽胞杆菌属)、巴斯德氏菌属、固氮菌属、肠杆菌属、固氮螺菌、甲基杆菌属、蓝细菌(蓝绿藻)等细菌。其他微生物(如菌根真菌)也可以接种到液体营养培养基内获得细菌培养物。根瘤菌属和慢生根瘤菌属中，优选菌株包括慢生大豆根瘤菌(处，aoyr力J'^/^朋J'3/70/^Ci//77)、苜蓿根瘤菌(必i'^^'"ffl/ze^7o")、豌豆根瘤菌三叶草生物型(豆8辨凝;^蘑Worar^^'/Wh')、豌豆根瘤菌蚕豆生物型(豆弃裙盧蘑ri'ceae)和豌豆根瘤菌菜豆生物型(豆"弃/^^曹ZiorarpA^h')。这些细菌能在豆科植物根部形成根瘤。虽然以下内容主要涉及根瘤菌属接种剂组合物，但应当理解，其他微生物亦同样适用。细菌接种用的培养基可以是本领域技术人员已知的适合所选用细菌的任何液体营养培养基。例如，YMB是根瘤菌属常用的培养基。YMB组分列于下表1。表lYMB配方<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>将细菌加到液体营养培养基中，然后培养(或发酵)至细菌生长到"近稳定期"。"近稳定期"是指从"对数期"晚期到"稳定期"之间的一段培养时期。"对数生长期"是指发酵起始阶段的延迟期之后的一段时期，该时期营养供应充分，细菌一般呈指数生长。"稳定期"是指对数生长期之后的一段时期，这个时期细菌生长基本上停止。稳定期一般在液体营养培养基中营养基本耗尽之后达到。本文将含有生长到近稳定期的细菌的物质称为"液体接种剂"。细菌培养期一般为1-15天，确切点说是2-7天。培养期间可以利用振荡培养箱、发酵反应器或其他类似装置使液体营养培养基和细菌通气并维持在适宜生长的温度。具体培养条件依所用的菌种和液体营养培养基种类而定。例如，慢生大豆根瘤菌接入营养培养基后，可在振荡培养箱上培养大约1-10天，温度约为20-35°C。最好是培养大约2-7天，温度约为28。C。近稳定期的细菌数依菌种而异。例如，对根瘤菌属细菌来说，液体接种剂的细菌数预计约为1X109-5X107ml。在该实例中，液体接种剂中含有约lX107ml的细菌数。这些数量只是举例说明，本发明还涵盖像这样的其他数量。达到近稳定期后(即细菌生长到对数生长率之后)，往液体接种剂加入含有干燥剂的干燥处理剂，获得半干燥接种剂。术语"干燥处理剂"是指干燥剂和稀释物(一般为水)的混合物。术语"干燥剂"是指加到水中可降低水分活度(物体表面水蒸汽分压与饱和压的比值)的物质。水分活度降到0.995以下应能增加半干燥接种剂包装容器内细菌的存活。水分活度降到O.990以下，最好降到约O.980以下，应能增加半干燥接种剂中细菌的种子存活数。本文中，"干燥剂"可包括干燥剂一类的任何化合物或其混合物，而不论所使用的该化合物或其混合物浓度是否真正对液体接种剂有干燥效果。适宜用的干燥剂例如包括海藻糖、蔗糖、甘油和三乙撑乙二醇(triethyleneglycol)中的一种或多种。其他适合的干燥剂包括但不限于非还原糖和糖醇(例如甘露醇)。液体接种剂中所加入的干燥剂一般约占半干燥接种剂的5-50%(重量/体积)。如果使用的干燥剂是海藻糖，则其使用量约占半干燥接种剂的10-40%(重量/体积)比较理想，约20-30%(重量/体积)则更佳。如果使用的干燥剂是山梨醇，则其使用量约占半干燥接种剂的10-35%(重量/体积)比较理想，约15-20%(重量/体积)则更佳。干燥处理剂可以包括一种以上干燥剂的混合物。事实上，该混合物可以是本文所限定的任意两种或两种以上干燥剂的组合。例如，干燥处理剂可以包括海藻糖和甘油、海藻糖和蔗糖，或者蔗糖和三乙撑乙二醇的混合物。海藻糖和甘油的混合物中，海藻糖约占半干燥接种剂的5-40%(重量/体积)，甘油约占半干燥接种剂的1-10%(重量/体积)。海藻糖和甘油分别约占半干燥接种剂的20%和5%(重量/体积)是更理想的。发现包括海藻糖作为干燥剂的干燥处理剂对本发明大豆(如Bjaponicum)中常用的细菌的种上存活有部分益处。也可以包含其它的混合物。例如，山梨醇可以和其它的干燥剂如海藻糖和甘油混合。山梨醇也可以和聚合物如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)混合。发现包括山梨醇作为干燥剂的干燥处理剂对本发明豌豆和扁豆(如豆科根瘤菌biovarviceae)中常用的细菌的种上存活有部分益处。不管是否混合用于豌豆和扁豆或其它的作物如棉花上，山梨醇的有益效果都是可以期待的。可以在培养期间(例如发酵反应器或振荡培养箱)向装在培养容器内的液体接种剂中加入干燥剂，也可在液体接种剂进行包装期间加入干燥剂。在包装步骤之前(如，当液体接种剂仍在培育容器中)向液体接种剂中加入干燥处理剂时，一旦干燥处理剂加入到液体接种剂中，部分干燥的接种剂优选进入处理阶段中。处理阶段包括允许部分千燥的接种剂产品呼吸，即暴露于空气中。在处理阶段，细菌优选以全速或接近全速代谢。处理阶段的重要好处就是细菌可以适应干燥剂。没有处理阶段，干燥剂将影响细菌，导致降低的细菌存活。优选的，处理阶段约1-10填。更加优选的，处理阶段约2-3天。处理阶段的时间长短取决于加入的干燥剂的类型、接种剂中细菌的类型，等等。在一个实施例中，加入足量干燥剂使半干燥接种剂中的细菌至少部分干燥，从而(1)提高分装和储存等后续步骤中细菌的稳定性和存活，(2)而且提高例如将半干燥接种剂施到种子上等后续步骤中细菌的稳定性和存活。半干燥接种剂然后可以包装起来并储存。包装容器可以是工业上已知的任何标准容器，例如可以用聚乙烯囊包装半干燥接种剂。将半干燥接种剂包装完后予以储存。储存条件可以包括温度在环境温度与冷藏温度之间，相对湿度在低到中等湿度之间，理想条件包括温度约低于35。C，相对湿度约低于80%。更加优选的，储存条件包括温度约为4r-5'C，最大的优选温度约为15X:。半干燥接种剂可施用于各类种子。例如，可将半干燥接种剂施用于豆科植物的种子。豆科植物是重要经济作物中的一大家族，如大豆、紫花苜蓿(紫苜蓿)、花生、豌豆类、豆类等。半干燥接种剂中的细菌可聚集在植物根围，和/或感染植物根，例如侵入根毛，并聚集在根部，产生根瘤。依靠这种共生关系，植物通过固氮作用将气态氮转化为氮的有机化合物，并利用这些有机化合物生长。半干燥接种剂施用到种子上时，种上细菌数会发生改变。半干燥接种剂施用后10周，种上细菌数还在变化，但其数量应该与原始数量悬殊不大。换句话说，种上细菌数应该不会随时间而急剧减少。例如，如果半干燥接种剂施到种子上时，种上细菌数至少为6X105，大约10周后种上细菌数至少为1X105则比较理想。根据本发明制备的接种剂的优点在于该接种剂的使用比率可以低于现有使用的(即约少于4.2液量盎司/cwt)，同时种上细菌的存活却高于现有技术的存活(即种上12周后，大于105cfu/种子)。这种低体积比率应用，同时获得高的种上存活的优点有几点原因第一，低体积应用比率降低了生产和运输成本(即较少的体积产生和获得同样的产量)。第二，低体积应用比率防止了种子的桥接(即两个或多个种子由于过量的液体产生结块)。种子桥接的起点通常约5液体盎司/cwt(百磅种子)，约高于6液体盎司/cwt时发生高水平的种子桥接。种子桥接使得接种剂抑制了种子的全覆盖，甚至也抑制了种植时播种。第三，低体积应用比率可以在保持种上细菌高存活的情况下，多用集中功能性物质，并不会超过种子桥接的极限(即通常超过约6液体盎司/百磅)。功能性物质包括致死化合物(cidalcompound)。致死化合物包括杀昆虫剂、除真菌剂、除草剂、杀菌剂、除害虫剂、杀病毒剂、杀螨剂、杀线虫剂、灭鼠剂或其组合。优选的致死化合物包括杀真菌剂和杀虫剂。例如，优选的是APRONMAXXRFC(Mefe丽am，Fludioxonil)，APR0腿XXRTA(Mefe丽am，Fludioxonil)，WARDENRTA(Mefenoxam，Fludioxonil),CRUISERMAXX(PAK)(Thiamethoxam，Mefenoxam，Fludioxonil)，CRUISER(Thiamethoxam)和BEANPAK(Mefenoxam,Fludioxonil)。致死化合物可以和本发明的接种剂以多种方式结合，形成接种剂混合物。例如，对于100磅的种子，2液体盎司的根据本发明制备的接种剂、l液体盎司的第一致死化合物、l液体盎司的第二致死化合物和l液体盎司的水作为混合物用于种上。这种接种剂混合物具有种上高存活的优点，第一致死化合物和第二致死化合物的优点是不会对种子的桥接有危害，从而不需要新的制剂来避免这种危害。如有需要，接种剂混合物可以包含高于l液体盎司的睡。增加的水可以增加种子的覆盖率，也可以延长接种剂混合物种上的保质期。致死化合物和本发明的接种剂的混合时间也可以不同。致死化合物和接种剂可以混合在一起形成化合物，然后将该混合物用于种子。致死化合物和接种剂可以同时用于种子。致死化合物和接种剂根据不同的使用时间和顺序，可以先后用于种子。对于约为2000-5000种子/磅的种子(如黄豆和豌豆)，用于种子的接种剂混合物(如只有接种剂、接种剂+水、接种剂+致死混合物、接种剂+致死混合物+水)中总的液体体积优选为约大于4.0液体盎司/cwt。对于小一点的种子(如大于5000种子/磅)，表面积增加。因此，为了获得所需的种上细菌稳定性(如种上约10周后大于105cfu/种子)，接种剂混合物中较多的液体是必须的。相反的，对于较大的种子，为了获得种上细菌稳定性，接种剂混合物中较少的液体是必须的。实例4和5显示了本发明的半干燥接种剂以低体积应用比率应用时的细菌种上存活。优选的，接种剂单独以囊状物包装。囊状物可以是由聚丙烯、聚乙烯和其它类似出材料制成。可选择的，接种剂可以和一种或多种致死化合物、和/或一种或多种其它成分(如着色剂和枯草芽孢杆菌)一起包装。接种剂/致死化合物、接种剂/其它成分、接种剂/致死化合物/其它成分可以多个袋子混合包装(如两个袋子)。在进一步的可选择实施方案中，接种剂可以作为两个单独的成分包装。第一成分为"高度浓縮的"。高度浓縮液包括细菌、水、至少一种干燥剂和至少一种聚合物。高度浓縮液也包括胶凝剂。细菌可以是本文中讨论的任何细菌，但是优选为慢生根瘤菌。甘井子可以是本文中讨论的任何干燥剂，但是优选为海藻糖。聚合物可以本文中讨论的任何聚合物，但是优选为乙烯吡咯酮和乙烯醋酸酯共聚物。胶凝剂可以是本文讨论的任何胶凝剂，但是优选为结冷胶。第二组分为"调节剂"。调节剂包括水、至少一种干燥剂和至少一种聚合物。调节剂也包括水。干燥剂可以是本文中讨论的任何干燥剂，优选为海藻糖。聚合物可以本文中讨论的任何聚合物，但是优选为乙烯吡咯酮和乙烯醋酸酯共聚物。为了获得高度浓縮液，细菌可以在约20。C-35T:的营养介质中培养约2-10天。营养介质可以是微过滤成较小的体积(如100升-5升)。为了微过滤营养介质，介质重复通过灭菌的微过滤单元，直至获得所需的细菌浓度(如约lxl011cfu/ml-lx1012cfu/ml)。然后，在微过滤的体积中加入水、干燥剂、聚合物和可能的胶凝剂(如水+30%w/v(基于最终的体积)、lXw/v乙烯吡咯酮和乙烯醋酸酯共聚物和0.05^w/v的结冷胶)，将其补充至较高的体积单元，但是低于营养介质原始的量(如5升-10升)。在种上使用前，得到的单元可以在约2'C-2(TC保藏。为了获得调节剂，干燥剂、聚合物和可能的水的混合物可以独立于高度浓縮液(如90升的海藻糖(30%w/v)、乙烯吡咯酮和乙烯醋酸酯共聚物(1%)和的结冷胶(0.05%w/v))制备。混合物可以是灭菌的(但是不是必须的)，在种上使用前，在约15。C-25。C下防腐包装和保藏。高度浓縮液和调节剂可以一起用于种上。也可以和水和/或官能化合物(如致死化合物)一起应用。用于100磅的种子，高度浓縮液的量优选约为O.l液体盎司到0.5液体盎司，更加优选为0.2液体盎司。调节剂的量优选约为1.2液体盎司到2.5液体盎司，更加优选为1.8液体盎司。水和/或功能性化合物的量优选为1.5液体盎司到5.5液体盎司，更加优选为3.0液体盎司。合并的高度浓縮液和调节剂中的细菌浓度优选约为lx109cfu/ml-5xlOncfu/ml，更加优选为lx1010cfu/ml。要提高半干燥接种剂装在容器内和施于种子时其细菌的稳定性和存活量，可以考虑在向种子施用半干燥接种剂之前，将聚合物加到半干燥接种剂中，也可以在包装之前或储存之后加入该聚合物。聚合物可以包括聚乙烯基吡咯垸酮、烷基化乙烯基吡咯垸酮聚合物、乙烯基吡咯垸酮和醋酸乙烯酯共聚物、乙烯基吡咯烷酮和苯乙烯共聚物、聚乙烯醇聚合物和其他类似聚合物。聚合物约占半干燥接种剂的1-25%(重量/体积)。在细菌达到近稳定期之后向液体接种剂加入干燥剂得到半干燥接种剂即可提高细菌的稳定性，这样播种时则不必再添加补充剂，但这并不排除不能使用补充剂。事实上，将半干燥接种剂施用于种子之后，再往种子内添加补充剂亦属本发明的范围。补充剂可在播种时加入，也可在向种子施用半干燥接种剂之后加入。补充剂可以包括糖、胶浆，羧甲基纤维素和聚合物等任何常用的补充剂。半干燥接种剂可加到泥炭、粘土和/或其他类似干燥载体中形成干燥、可流动的接种剂。可借助喷雾器或其他已知装置使用该半干燥接种剂。下面用非限制性实施例对本发明进行说明。实施例l:海藻糖和甘油/海藻糖混合物对慢生大豆根瘤菌稳定性的影响将慢生大豆根瘤菌接种到装有营养培养基的摇瓶中，置于振荡培养箱内、28"C培养7天，获得为期7天的成熟发酵肉汤。制备四种处理剂分别置于250ml摇瓶内(见表2)。每种处理剂制备两份，则共有8个250ml摇瓶。取50ml上述成熟发酵肉汤加到各摇瓶内。然后将所有摇瓶置于振荡培养箱内28"C再培养7天，使摇瓶中内容物达到平衡。之后，将每种含处理剂摇瓶中的一个摇瓶转到28。C静止培养，另一个烧瓶转到35°C静止培养。表2处理剂一海藻糖和甘油对慢生大豆根瘤菌稳定性的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>藻糖定期从摇瓶中取样，利用总活板计数法进行活菌计数。用平板计数时，先混合样品，然后用移液器(calibratedpipette)和无菌枪头取lml样品，加到装有9ml反渗透(RO)水的试管内，得到10—稀释液。然后用IOOOulRainin移液器(校准并调到IOOOu1)和无菌枪头从10—i稀释试管中取出1000uL稀释液，加到装有9ml反渗透水的另一试管内，得到10_2稀释液。重复上述步骤，直到获得10—7稀释液。要注意每次转移前要将装有稀释液的试管振荡混匀。再用100p1Rainin移液器(校准并调到30yl)和无菌枪头，从10—，希释试管中取出30ul，在营养琼脂平板上滴3滴，每滴10ii1，用作污染检测平板。该营养琼脂为Oxoid培养基。按上述步骤制备其他稀释液，但10—5、10_6和10—7稀释液除外。将样品加到刚果红酵母甘露醇琼脂标准平板上("CRYMA"，见表3)。表3CRYMA平板组分<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>待平板干燥后，将平板倒置于28'C培养箱内培养5天。之后在低倍显微镜下进行菌落计数。根据平均值X稀释倍数X100，算出总菌数。经四种处理剂处理的慢生大豆根瘤菌在液体肉汤中28。C培养后的存活结果如图l所示。经四种处理剂处理的慢生大豆根瘤菌在液体肉汤中35。C培养后的存活结果如图2所示。实验期间含5%甘油的处理剂被污染，所以未包括在图2中。图1的结果表明经20%海藻糖和20%海藻糖/5%甘油处理的细菌在28°C、液体肉汤中存活情况良好。对照中的细菌数从实验开始后大约12-16周之间某个时段开始减少。而分别经20%海藻糖和20%海藻糖/5%甘油处理后的细菌数在同一时段内、甚至在该时段之后仍保持在较稳定的水平。图2的结果表明经20。/。海藻糖处理的细菌在35。C、液体肉汤中存活情况良好。经其他处理的细菌数，包括对照处理，在实验初期显著减少，而经20%海藻糖处理的细菌数在整个实验期间均保持相对稳定。IO周后，分别从对照和20%海藻糖处理剂取样，施到大豆种子上。将种子置于22i:培育。定期取样，测定慢生大豆根瘤菌的活菌数。测定种上活菌数的方法如下。称取500g大豆种子，放到作了标记、可重新封口的干净塑料袋中。用2ml注射器或无菌的2ml移液器，取l.38ml处理剂均匀加到种子表面。将环境空气充到已接种的塑料袋中，然后立即将塑料袋封口，摇晃塑料袋直到处理剂将种子均匀覆盖住为止(大约30秒)。打开塑料袋，置于环境实验室条件(21°C)中避免阳光直射，让种子干燥(约10分钟)。取一支匙形刮伊，用酒精整个擦拭一遍，待干燥后从塑料袋中随机挑出100个完整的种子。将种子置于装有预先制备的100ml稀释液瓶中。将稀释液瓶封口后立即用力摇晃约l分钟。使用无菌技术，按如下方法将已制备的100ml稀释液进行系列稀释(1)在摇晃100ml稀释液瓶之后立即取lml悬浮细菌和稀释液无菌转移到第一个装有9ml反渗透水的稀释管内，得到1(T稀释液。(2)将10—工稀释液旋转混合15秒，(3)旋转混合之后立即从10—1希释液中取lml转到另一个装有9ml反渗透水的稀释管内得到10—2稀释液，(4)然后将10—2稀释液旋转混合；(5)重复步骤(3)和(4)，得到1(T和10—4稀释液。然后在菌落计数用琼脂平板上详细标明所使用的稀释管、处理剂和铺板日期。每份稀释液铺2个平板。每次从稀释管取样铺板前，都要将稀释液旋转混匀。然后，用标准的无菌移液技术从每份稀释液中取100ul样品，加到各琼脂平板中央。用无菌涂布棒将样品均匀涂布在整个平板表面。然后将平板置于28i:培养7天。之后数各平板的菌落形成单位(CFU)数并记录。然后用以下公式算出各平板的CFU:[平均菌落数X(标记的稀释倍数X10WX100^/100W]，其中(a)是O.lml稀释液/板的校正值，(b)是对原始稀释液瓶中100ml稀释液的校正值，(c)是原始样品中种子数的校正值。10周后慢生大豆根瘤菌的种上存活结果如图3所示。结果显示对照处理后的细菌数超过1X107种子的时长小于1周，而20%海藻糖处理后的时长在10周以上。这些结果表明20%海藻糖处理使种上细菌存活情况良好。实施例2:使慢生大豆根瘤菌稳定所需的最佳海藻糖/蔗糖使用摇瓶制备步骤同实施例l。该实施例中的处理情况见表4。表4处理剂一海藻糖和蔗糖对慢生大豆根瘤菌稳定性的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>经处理剂处理的慢生大豆根瘤菌在28。C、液体肉汤中培养后的存活结果如图4所示。经处理剂处理的慢生大豆根瘤菌在35"C、液体肉汤中培养后的存活结果如图5所示。图4的结果表明，28°C、海藻糖浓度为10-30%(重量/体积)最适宜细菌在液体肉汤中的存活。图4还表明经浓度为5-10%(重量/体积)的蔗糖处理也有利于细菌液体肉汤中的存活，但达不到与海藻糖处理同样的效果。图4还表明细菌经40%海藻糖处理后仍能存活，说明细菌在抑制微生物生长的制剂中仍具有存活能力。图5的结果表明，35°C、海藻糖浓度为10-30%(重量/体积)最适宜细菌在液体肉汤中的存活。图5还表明经浓度为5。/。(重量/体积)的蔗糖处理也有利于液体肉汤中细菌的存活，但达不到与海藻糖处理同样的效果。IO周后，分别从表4所列的处理剂中取样，施用到大豆种子上。将种子置于22'C培育。分别从起始、种上6天后、种上2周后和种上4周后取样。测定这些样品中慢生大豆根瘤菌的活菌数。种上活菌数测定方法如实施例l所述，结果如图6所示。图6的结果表明，22°C、海藻糖浓度为20-30%(重量/体积)最适宜细菌在种上存活。实施例3:X寸Serra"a尸2Y^eo历ac^/a/^和荧光假单胞菌在液体肉汤中稳定性的评价在22。C、标准微生物培养基中培养5"erratj'a含量减半的胰蛋白酶大豆肉汤一"TSB")24小时，得到细菌肉汤。准备一组摇瓶，每个摇瓶相当于表5中列出的一种处理剂。将50ml细菌肉汤加到各摇瓶中。所有摇瓶在振荡培养箱内22。C再培养3天，使其平衡。然后将摇瓶转移到28t:静止培养。定期取样，制备系列稀释液，铺到含量减半的胰蛋白酶大豆琼脂("TSA")上测定细菌数。重复上述步骤对荧光假单胞菌进行试验("Pfluorescens")。表5:处理剂一海藻糖、蔗糖和甘油对5";ro^oyHacWayw和荧光假单胞菌的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>经处理剂处理的荧光假单胞菌在28"C、液体肉汤中培养后的存活结果如图7所示。结果表明在28T:经甘油、海藻糖和蔗糖处理均能提高荧光假单胞菌的存活。经处理剂处理的5pr"eo/^c^a7^在28。C、液体肉汤中培养后的存活结果如图8所示。结果显示到第4周，分别经30%海藻糖、10%蔗糖和30%蔗糖处理后的细菌存活数大于对照。数据表明这些处理剂均育巨^高5;7Y^eo/Mc^a/^的^^。实施例4:低体积比率应用对"种上"存活的影响及和商业产品的对比根据实例l制备半干燥接种剂。产品包括慢生大豆根瘤菌、20%海藻糖和2X的S-630。在应用于种子前，产品在500ml的囊状物、没有空气、5"C中保藏四个月。半干燥接种剂产品用于大豆种子(12%的水分)。用总体积为4液体盎司/百磅种子(半干燥接种剂产品+水)处理种子。将不同体积的浓縮液(l-4液体盎司/百磅种子)和合适量的水混合制备处理剂，得到体积达到4液体盎司/百磅种子。处理后，种子在袋子里摇晃，以确保完全覆盖。然后打开袋子，种子在环境温度(18。C-2(TC)下保藏。种子也用两种商业液体处理。商业液体A，具有为公开添加剂的大豆接种剂，施用的比率为5.0液体盎司/cwt。商业液体A为ApexPro4，Agribiotics，Inc.生产的液体大豆接种剂。商业液体B，具有为公开添加剂的大豆接种剂，施用的比率为4.25液体盎司/cwt。商业液体A为Cel1-TechSCI，Nitragin，Inc.生产的液体大豆接种剂。种子的取样。50粒种子用灭菌的压舌板随意选取，然后放到装有反渗透水的100ml的医用烧瓶中。种子剧烈摇晃l分钟。将1000ul的样品以无菌的方式取出并放在9ml的McCartney瓶中。使用无菌技术，按如下方法将已制备的悬浮液进行系列稀释(1)在摇晃100ml稀释液瓶之后立即取lml悬浮细菌和稀释液无菌转移到第一个装有9ml反渗透水的稀释管内，得到1(T稀释液。(2)将10—1稀释液旋转混合15秒，(3)旋转混合之后立即从1(T稀释液中取21lml转到另一个装有9ml反渗透水的稀释管内得到l(T2稀释液，(4)然后将10—2稀释液旋转混合;(5)重复步骤(3)和(4)，得到10一3和10_4稀释液。然后在菌落计数用琼脂平板(YeastMannitolAgar)上详细标明所使用的稀释管、处理剂和铺板日期。每份稀释液铺2个平板。每次从稀释管取样铺板前，都要将稀释液旋转混匀。然后，用标准的无菌移液技术从每份稀释液中取100ul样品，加到各琼脂平板中央。用无菌涂布棒将样品均匀涂布在整个平板表面。然后将平板置于28。C培养5-6天。之后数各平板的菌落形成单位(CFU)数并记录。然后用以下公式算出各平板的CFU:[平均菌落数X(标记的稀释倍数X10(a)X100(b)}/100(。]，其中(a)是O.lml稀释液/板的校正值，(b)是对原始稀释液瓶中100ml稀释液的校正值，(c)是原始样品中种子数的校正值。种上存活结果如图9所示。结果显示，处理6周后，本发明的半干燥接种剂(用于种子的总量为4液体盎司/百磅种子)最小的2液体盎司浓縮液获得的种上稳定性超过105CFU/种子。这些结果也表明本发明的半干燥接种剂产品的种上存活超过所测试的两种商业液体。实施例5:低体积比率应用对"种上"存活的影响及和商业产品的对比和实例4的程序一样，除了半干燥接种剂中含有l^的S-630(不是2X的S-630)，产品保藏在3.l升的囊状物中(不是500ml的囊状物)，种子保藏的温度是20。C(不是18-2(TC)。种上存活结果如图10所示。结果显示，处理6周后，本发明的半干燥接种剂(用于种子的总量为4液体盎司/百磅种子)最小的2液体盎司浓縮液获得的种上稳定性超过105CFU/种子。这些结果也表明本发明的半干燥接种剂产品的种上存活超过所测试的两种商业液体。实施例6:杀虫剂相容性的研究和实例l一样的过程一样。本实例中的处理剂包括30%的海藻糖和P/。的S-630。处理剂可以三种不同的方式用于种子。第一种测试对种子仅用半干燥接种剂。该测试的结果如表6所示。第二种和第三种测试对种子施用半干燥接种剂和杀虫剂。在第二种测试中施用的杀虫剂为APRONMAXXRTA，应用比率为5液体盎司/cwt。在第三种测试中施用的杀虫剂为CRUISE腿AXX，应用比率为3液体盎司/cwt。在第二和第三种测试中，杀虫剂以三种方式加入容器混合、依次的和同时的。第二种测试的结果列于表7。第三种测试的结果列于表8。对于容器混合，所示的半干燥接种剂产品的液体盎司/cwt应用是在20"C、与标记比率的杀虫剂容器混合4小时。混合后，接种剂产品/杀虫剂的组合以累积的液体盎司/cwt比率用于种子。对于依次的，杀虫剂以标记的比率用于种子，并允许干燥。然后半干燥接种剂产品和水以所示的液体盎司/cwt用于种子，总的比率达到4液体盎司/cwt(如2液体盎司/cwt产品+2液体盎司/cwt水)。对于同时的，半干燥接种剂产品和杀虫剂同时用于种子。杀虫剂一标记的比率施用。半干燥接种剂产品的应用比率为液体盎司/cwt(如2液体盎司/cwt)。表6-8中所示的保质期是天数，半干燥接种剂产品用于种子后，根瘤菌数/种子超过了lx105根瘤菌/种子的阈值(加拿大规定的阈值)。表6:不含杀虫剂的半干燥接种剂产品的应用应用比率*(液体盎司/cwt)种上保质期(70T/2(TC)2.050天2.555天3.065天233.575天4.085天*和水一起达到4.0液体盎司/cwt表7:半干燥接种剂产品和APR0丽AXXRTA(5液体盎司/cwt)的应用<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>表8:半干燥接种剂产品CRUISERMAXX(3液体盎司/cwt)的应用<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>实例7:糖/糖醇的研究半干燥接种剂产品由野生豆科根瘤菌培养基中首次生长的豆科根瘤菌制备。使用两种不同的培养基1XR1和1.5XR1，其分别为豌豆和扁豆发酵培养基。1.5XR1的培养基组分比1XR1多50X。培养3天后，糖或糖醇无菌加入培养基。加入到培养基中的糖或糖醇的量在下表9中以最终的浓度(重量/体积)显示。在培养基持续生长时将培养基进行2天的调节阶段，从而形成半干燥接种剂产品。然后将半干燥接种剂产品以3.1升接种剂产品/1136公斤种子的比率用于豌豆种上。然后将种子在袋子里摇晃、混合，使得接种剂产品均匀分散在种子上。然后在15。C下储存种子。如下表9所示，接种剂用于种子后6天、12天18天和29天，种上的细菌数。细菌数的统计和前述的实例类似。即，将50粒种子放入稀释瓶中100ml的磷酸盐缓冲液。瓶子摇晃5分钟。制备稀释10倍的稀释液，并将0.lml合适的稀释液喷洒到营养培养基孔板上。根据孔板上的菌落数计算种上的或细菌细胞。表9处理剂Cfu/ml@接种后每粒种子的Rz数目T二06，12天'29ftxRJCK1.86E+062-70E+051.65E:057.50E;041.24E+062,4犯葡2.10E+056.40E+04-lxRJ/20%Strb德體53眉E+D52*74E+051,2犯，,J51x腿054Sorb4,50B備2.70E+051.04,63,55E+0S1.64E+051.5xRl/雇SoA6雄+053,2犯爆1J4E+05lxRJ/20%Suc7.66E+056,1,4044.50E德9.14E+057.2犯嶺3,22E+CM1.5xRJ/20%SucL20E雍L03E+055.00E+041.92E404-9.14E+056.30E+04一lxRl/20%Treh4,14,57.30E+042.36E+04lxRI/30WrehS.20E+059.30E+044..{)4:R+041,5xRl/20%Treh5.94E+057.10&KW4.50E+044,38,4-1,StRLG0%Treh2.7犯+054.00E+046.60E+045,4犯+04-结果表明对于豆科根瘤菌种上保质期的延长，山梨醇是所测试的物质中最好的糖或糖醇。实例8-山梨醇的研究(20%山梨醇)接着实例7，在有或没有结冷胶("GG")(低乙酰基KelcogelF)的情况下，选择20%的山梨醇用于进一步评价。步骤如下1.豆科根瘤菌在3CTC、160rpm、1.5XR1培养基中培养2天。2.在30°C、0.lvvm、160rpm、pH=6.6-7.4的1.5XR1培养基中接种1%的所述母培养基。3.培养3天后，在发酵罐中加入20%的山梨醇(最终的浓度w/v)，在成熟前继续进一步进行2天的发酵/调节过程。(83%山梨醇二83g+46ml的水)。4.成熟时向3个袋子中加入结冷胶(0.1%)。5.在4t-5"C储存培养基。6.用于种子前向肉汤中加入1%的S-630，2.7ml/Kg。7.将半干燥接种剂产品用于豌豆，比率为3.1升接种剂产品/1136公斤种子。8.将种子在袋子里摇晃、混合，使得接种剂产品均匀分散在种子上。9.在15。C和20。C下储存种子。测试结果如图11所示。图11中所示的标准制剂为上述所述制备的培养基。图11中所述的浓縮液离心成小球，所述的等体积量的细胞培养基肉汤可以替代上清液。因而，细胞浓度是双倍的一尽管所有其它形式的参数没有变。两种制剂的应用比率都为4.2液体盎司/cwt(没水)。双份准备几种处理剂(即不包括结冷胶的标准制剂)。图12所示的是那些测试结果。根据这些结果，种上稳定性温度是严格的，和2(TC相比，15。C延长了种上保质期。实例9一山梨醇对海藻糖和大豆做试验测试山梨醇或海藻糖是否更适合和慢生大豆根瘤菌用于大豆种子。步骤如下1.慢生大豆根瘤菌株532C在1.5XBJ2(大豆发酵介质)中、30°C、165rpm下培养5天。2.山梨醇(20%w/v)或海藻糖(30。/。w/v)加入到培养基中，培养基在3(TC、165rpm下保持5天。3.2.7ml/kg的山梨醇或海藻糖改性的培养基用于大豆种子。均匀涂覆种子。4.在18-20。C中储存种子。5.7天后，在O时刻监测种上根瘤菌活性。测试结果如图13所示。根据这些结果，海藻糖比山梨醇更适合用于慢生大豆根瘤菌。实例IO—在大豆种子上应用多组分接种剂组合物做试验测试细胞浓度和超低海藻糖改性的根瘤菌接种剂应用对大豆种上存活的影响。步骤如下1.慢生大豆根瘤菌株532C于28C在100升的营养培养基中培养7天。然后将该100升微过滤到5升，通过加入水+30%w/v*海藻糖，1%的S630w/v*和0.05%w/v结冷胶(*w/v最终为10升)补充到10升，形成"高度浓縮液"肉汤。在防腐包装前，高度浓縮液肉汤再发酵7天。高度浓縮液肉汤中的慢生大豆根瘤菌的浓度为2.7xl011cfu/ml。2.对90升的混合物海藻糖(30%w/v)、S630(1%w/v)和结冷胶(0.05%w/v)灭菌，然后防腐包装成"调节剂"。应用前，成熟的调节剂单元在2(TC储存。3.将0.2液体盎司的高度浓縮液、1.8液体盎司的调节剂和3液体盎司的水混合。混合物中慢生大豆根瘤菌的浓度为7.4x109cfu/ml。该混合物按比例用于IOOlbs的大豆种子。4.在15'C和2(TC储存接种的种子，然后用上述的方法每周进行评价。测试的结果列于表10和图14。27表io<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>本领域的技术人员应当清楚，本发明可以根据情况以各种形式和方式予以实施。以上对实施例的详细说明只是为了理解起来更清楚，而非对本发明的限制。权利要求1.一种处理种子的方法，该方法包括将半干燥接种剂产品用于种子，半干燥接种剂的比率约为1.5液体盎司/百磅种子至4.0液体盎司/百磅种子，其中半干燥液体接种剂含有基本在静态生长的细菌，干燥剂处理包括干燥剂。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述的半干燥接种剂一混合物的形式用于种子，所述的混合物含有半干燥剂产品、水和致死化合物。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述的半干燥接种剂产品和水一起用于种子的比率约为3.5液体盎司/百磅种子至6.0液体盎司/百磅种子。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述的半干燥接种剂产品的应用比率约为2.0液体盎司/百磅种子至3.2液体盎司/百磅种子。5.根据权利要求2所述的方法，其中所述的混合物含有半干燥接种剂产品和至少一种至少化合物，该混合物用于种子的比率约小于9.2液体盎司/百磅种子。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述的致死化合物包括一种或多种杀昆虫剂、除真菌剂、除草剂、杀菌剂、除害虫剂、杀病毒剂、杀螨剂、杀线虫剂、灭鼠剂或其组合。7.根据权利要求5所述的方法，其中所述的半干燥接种剂产品用于种子的比率约为2.0液体盎司/百磅种子至3.2液体盎司/百磅种子。8.根据权利要求1所述的方法，其中所述的细菌是选自形态根瘤菌、大豆根瘤菌、费氏中华根瘤菌、华癸根瘤菌、假单胞菌属、沙雷氏菌属、杆菌属、巴斯德氏菌属、固氮菌属、肠杆菌属、固氮螺菌属和蓝细菌中的一种或多种细菌。9.根据权利要求1所述的方法，其中所述的干燥剂是一种或多种非还原糖和糖醇的物质。10.根据权利要求1所述的方法，其中所述的干燥剂是海藻糖、蔗糖、甘油、三乙撑乙二醇和甘露醇中的一种或多种物质。11.根据权利要求1所述的方法，其中所述的干燥剂的重量约占所述半干燥接种剂体积的5-50%。12.根据权利要求10所述的方法，其中所述的干燥剂为海藻糖。13.根据权利要求12所述的方法，其中所述的海藻糖约占所述半干燥接种剂的重量/体积10-40%。14.根据权利要求13所述的方法，其中所述的海藻糖约占所述半干燥接种剂的重量/体积20-30%。15.根据权利要求1所述的方法，其中所述的种子包含豆科植物的种子。16.根据权利要求1所述的方法，其中，约10周后，所述的种上细菌的数目约超过lx105。17.根据权利要求1所述的方法，其中，半干燥接种剂产品用于种子后，所述的方法进一步包括施用补充剂。18.根据权利要求1所述的方法，其中所述的种子选自大豆、苜蓿、豌豆、花生、扁豆和黄豆。19.根据权利要求1所述的方法，其中所述的半干燥液体接种剂产品在用于种子前，进入调节状态。20.根据权利要求19所述的方法，其中所述的调节状态约为1-10天。21.根据权利要求20所述的方法，其中所述的调节状态约为2-3天。22.—种处理种子的方法，该方法包括在种子上施用高度浓縮液，高度浓縮液包含细菌、水、至少一种干燥剂和至少一种聚合物；在种子上施用调节剂；其中，高度浓縮液的施用比率约为0.1液体盎司/百磅种子至0.5液体盎司/百磅种子，调节剂的施用比率约为1.2液体盎司/百磅种子至2.5液体盎司/百磅种子。23.根据权利要求22所述的方法，其中高度浓縮液中细菌的浓度约为Ix1011cfu/ml至lx1012cfu/ml。24.根据权利要求22所述的方法，其中所述的调节剂包含至少一种干燥剂和至少一种聚合物。25.根据权利要求24所述的方法，其中所述的调节剂进一步含有水。26.根据权利要求24所述的方法，其中所述的高度浓縮液的施用比率约为0.2液体盎司/百磅种子，调节剂的施用比率约为1.8液体盎司/百磅种子。全文摘要本发明包括一种制备含有干燥剂的液体接种剂的方法。该方法能提高液体接种剂中细菌在包装容器内和施用于种上之后的存活和稳定性。该方法包括提供细菌生长已达到近稳定期的液体接种剂，以及将含有干燥剂的干燥处理剂加到上述液体接种剂中制得半干燥接种剂。该半干燥接种剂可进行包装和储存。它还可施用到种子上。文档编号A01C1/06GK101505584SQ200780030889公开日2009年8月12日申请日期2007年5月23日优先权日2006年6月23日发明者R.D.·P·卡吉格,杨国平,杰里米·大卫·皮尔斯,玛丽·安娜·卡彭特申请人:贝克安德伍德有限公司