一种稳定的含有动物毛皮屑变应原的液体药物组合物的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种稳定的含有动物毛皮屑变应原的液体药物组合物。该液体药物组合物包含治疗有效量或诊断有效量的动物毛皮屑变应原、缓冲有效量的pH5.0～7.0的缓冲液、浓度范围在0.1％～2.0％w/v的氨基己酸、浓度范围在30％～70％v/v的多元醇以及药用防腐剂。该液体药物组合物可以制成口服剂、皮下注射剂、舌下含服剂、气雾剂、鼻腔剂、皮肤点刺剂等剂型，可应用于诊断或治疗由动物毛皮屑变应原诱发的过敏性疾病。
【专利说明】一种稳定的含有动物毛皮屑变应原的液体药物组合物
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物药物【技术领域】，具体涉及一种稳定的含有动物毛皮屑变应原的液 体药物组合物。
【背景技术】
[0002] 过敏性疾病是当今世界上最常见的疾病之一。过敏性疾病的发病率约占人口的 20%。过敏性疾病从新生儿到老年人的各年龄段均可能发生，且有明显的遗传性倾向。过 敏性疾病包括过敏性哮喘、过敏性鼻炎、特应性皮炎、过敏性结膜炎等，严重的甚至会威胁 到人的生命（过敏性休克）。
[0003] 当变应原通过食入、吸入、皮肤接触等方式接触人体后，会诱导B细胞产生特异性 的抗体IgE(SlgE)。SlgE会牢固地结合在肥大细胞、噬碱粒细胞表面。当变应原再次进入 体内时，会与这些SlgE相结合。这种结合会诱导与SlgE结合的肥大细胞和噬碱粒细胞释 放生物活性介质。释放的生物活性介质除了组织胺以外，还可以是前列腺素 D2、白三烯、血 小板活化因子等，它们的作用相似，都可引起平滑肌收缩，毛细血管扩张和通透性增强，腺 体分泌物增多，即导致过敏性疾病的发生。
[0004] 引起过敏的主要变应原之一是动物毛皮屑。狗、猫、牛、羊、兔、鼠等动物的毛皮屑 均可能诱发过敏性哮喘、过敏性鼻炎或特应性皮炎等疾病。研究发现，动物毛皮屑中含有不 同的变应原蛋白。这些变应原蛋白在动物毛皮屑诱发过敏反应中起到了主要的作用。例如， 狗毛皮屑中的变应原蛋白Can Π ，猫毛皮屑中的变应原蛋白Fel dl，马毛皮屑中的变应原 蛋白Equc 1及Equ c2,牛毛皮屑中的变应原蛋白Bos d2及Bos d5,兔毛皮屑中的变应原 蛋白Ory cl,小鼠毛皮屑中的变应原蛋白Mus ml、大鼠毛皮屑中的变应原蛋白Rat nl等均 是主要的变应原蛋白。
[0005] 由于导致过敏性疾病的变应原种类繁多，因此，进行诊断导致患者过敏的变应原 种类的检测显得尤为重要，其中，皮肤点刺试验是目前临床上最常见的变应原体内诊断方 法。当变应原进入过敏性疾病患者皮肤后，与肥大细胞上的特异性IgE抗体结合，导致肥大 细胞脱颗粒释放组胺等炎症介质，使局部血管扩张，渗出增加，引起皮肤表面的风团和红晕 反应。患者机体对变应原刺激的敏感程度与体内组胺的释放量、皮肤表面的风团反应呈正 相关。
[0006] 过敏性疾病的治疗方法主要有对症药物治疗与特异性免疫治疗（脱敏治疗）。现 有的对症药物主要包括抗组胺药物、过敏反应介质阻滞剂、钙剂、免疫抑制剂等。但对症药 物常伴有不同的副作用，且长期或大剂量服用易产生耐药性，因此并不能达到根治的效果。 特异性免疫治疗是在皮肤点刺试验或其他方法验证导致过敏的主要变应原物质后，将主要 变应原制成不同浓度的药物制剂，通过梯度递增的给药方式连续给患者以变应原制剂，并 在较高浓度维持给药，从而使患者对变应原脱敏。特异性免疫治疗是一种对因治疗，世界卫 生组织WHO在其关于免疫脱敏的指导性文件中明确指出："脱敏治疗是唯一可以改变过敏 性疾病自然进程的治疗方法"。
[0007] 过敏性疾病的诊断和治疗上，变应原药物制剂都起到了至关重要的作用，因此，开 发稳定而有效的变应原药物制剂具有重要的意义。
[0008] 由于动物毛皮屑变应原物质本身的组成与结构复杂，易受物理或化学因素的影响 而失去活性、降低效价。因此，目前动物毛皮屑变应原药物制剂较难长期稳定保存，该类药 物的货架寿命一般都较短。
【发明内容】
[0009] 本发明旨在克服含有动物毛皮屑变应原的液体药物组合物货架寿命短的缺陷，提 供一种能长期稳定保存的含有动物毛皮屑变应原的液体药物组合物。
[0010] 为实现上述目的，本发明提供了一种稳定含有动物毛皮屑变应原的液体药物组 合物，其特征在于，包含治疗有效量或诊断有效量的动物毛皮屑变应原、缓冲有效量的 pH5. 0?7. 0的缓冲液、浓度范围在0. 1%?2. 0%w/v的氨基己酸、浓度范围在30%?70% v/v的多元醇以及药用防腐剂。
[0011] 在一个优选的实施方案中，所述的液体药物组合物还包含浓度范围在〇. 1%? 2. 0% w/v的NaCl。在一个更优选的实施方案中，所述的液体药物组合物中含有的NaCl浓 度范围在0.5%?1.0% w/v。
[0012] 在一个优选的实施方案中，所述动物毛皮屑变应原来源于以下动物：猫毛皮屑变 应原、狗毛皮屑变应原、马毛皮屑变应原、牛毛皮屑变应原、兔毛皮屑变应原、鼠毛皮屑变应 原。
[0013] 在一个更加优选的实施方案中，所述猫毛皮屑变应原选自：中华田园猫（包括狸 花猫、三花猫、白猫、黑猫、黑白花猫、黄猫）毛皮屑变应原、美国短毛猫毛皮屑变应原、俄国 蓝猫毛皮屑变应原、英国猫毛皮屑变应原、波斯猫毛皮屑变应原、苏格兰折耳猫毛皮屑变应 原。
[0014] 在另一个更加优选的实施方案中，所述狗毛皮屑变应原选自：中华田园犬毛皮屑 变应原、边境牧羊犬毛皮屑变应原、德国牧羊犬毛皮屑变应原、中国沙皮犬毛皮屑变应原、 阿拉斯加雪橇犬毛皮屑变应原、萨摩耶毛皮屑变应原、拉布拉多寻回犬毛皮屑变应原。
[0015] 在一个优选的实施方案中，所述的动物毛皮屑变应原是动物毛皮屑变应原浸提 液，它是将动物毛皮屑用不导致变应原严重降解或失活的去离子水或缓冲液浸提获得。更 优选地，可以通过将动物毛皮屑脱脂、干燥、浸提、浓缩而获得。
[0016] 在另一个优选的实施方案中，所述的动物毛皮屑变应原是单一成分的动物毛皮屑 变应原蛋白或其组合。所述单一成分的动物毛皮屑变应原蛋白选自：Can fl、Fel dl、Equ cl λ Equ c2、Bos d2、Bos d5、0ry cl、Mus ml、Rat nl〇
[0017] 在一个优选的实施方案中，所述单一成分的动物毛皮屑变应原蛋白获得的方法是 重组载体表达或天然动物毛皮屑变应原蛋白纯化。所述重组载体表达包含以下步骤：克隆、 构建载体、表达、纯化、重组蛋白复性。所述天然动物毛皮屑变应原蛋白纯化包含以下步骤： 粗提动物毛皮屑蛋白、过分子筛、离子交换。在一个更优选的实施方案中，所述天然动物毛 皮屑变应原蛋白纯化方法由以下步骤组成：粗提动物毛皮屑蛋白、过分子筛、离子交换、反 向色谱。
[0018] 在一个优选的实施方案中，所述液体药物组合物中所含有的氨基己酸浓度范围在 0. 3?I. O% w/v。在一个进一步优选的实施方案中，所述液体药物组合物中所含有的氨基 己酸浓度为〇. 65% w/v。
[0019] 在一个优选的实施方案中，所述液体药物组合物中的缓冲液的浓度范围在5mmol/ L ?500mmol/L〇
[0020] 在一个优选的实施方案中，所述的液体药物组合物中的缓冲液的p H的范围为 pH5. 0?6. 5。在另一个优选的实施方案中，所述的液体药物组合物中的缓冲液的pH选自 pH5. 0, pH5. 5, pH6. 0, pH6. 5, pH7. 0。
[0021] 在一个优选的实施方案中，所述pH5. 0?7. 0的缓冲液选自甘氨酸-盐酸缓冲液、 磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、乙 酸-乙酸钠缓冲液、乙酸-EDTA缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、磷酸氢二钠-磷 酸二氢钾缓冲液、磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液、Tris-盐酸缓冲液、硼砂-盐酸缓冲液、硼 酸-硼砂缓冲液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、硼砂-氢氧化钠缓冲液、碳酸钠-碳酸氢钠缓 冲液、碳酸钠-氢氧化钠缓冲液、磷酸氢二钠-氢氧化钠缓冲液、氯化钾-盐酸缓冲液、氯化 钾-氢氧化钠缓冲液。
[0022] 在一个更优选的实施方案中所述pH5. 0?7. 0的的缓冲液选自pH5. 0的乙酸-乙 酸钠缓冲液、PH5. 5的乙酸-EDTA缓冲液、pH6. 0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、pH6. 5的 Tris-盐酸缓冲液、pH7. 0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液。
[0023] 在一个优选的实施方案中，所述液体药物组合物中的多元醇选自丙二醇、甘油、山 梨糖醇、甘露糖醇、聚乙二醇。
[0024] 在一个优选的实施方案中，所述液体药物组合物中的多元醇浓度范围在40%? 60% v/v。在一个更优选的实施方案中，所述液体药物组合物中的多元醇浓度范围在 45%?55% v/v。在一个还要优选的实施方案中，所述液体药物组合物中的多元醇为 45 %?55% v/v的甘油。
[0025] 在一个优选的实施方案中，所述液体药物组合物中的药用防腐剂选自但不限于苯 酚、硫柳汞、苯甲酸、山梨酸、山梨酸盐类、对羟基苯甲酸酯类、苯甲醇、苯乙醇或其组合，药 用防腐剂的浓度范围在〇. 1%?3% w/v。在一个进一步优选的实施方案中，所述液体药物 组合物中的药用防腐剂为〇. 1 %?〇. 5% w/v的苯酚。在另一个进一步优选的实施方案中， 所述液体药物组合物中的药用防腐剂为〇. 1 %?〇. 2% w/v的山梨酸钾。
[0026] 从长期稳定性试验可以得知，本发明的含有动物毛皮屑变应原的液体药物组合物 具有很高的稳定性，在2?8°C条件下能稳定保存24个月以上。
[0027] 该液体药物组合物可应用于治疗或诊断由动物毛皮屑变应原引发的过敏性疾病。 所述的液体药物组合物可以制备成各种医学上可接受的液体剂型，包括但不限于：口服剂、 皮下注射剂、舌下含服剂、气雾剂、鼻腔剂、皮肤点刺剂。
【具体实施方式】
[0028] 本发明提供了一种稳定的含有动物毛皮屑变应原的液体药物组合物，其特征在 于，包含治疗有效量或诊断有效量的动物毛皮屑变应原、缓冲有效量的pH5. 0?7. 0的缓冲 液、浓度范围在〇. 1 %?2. 0% w/v的氨基己酸、浓度范围在30%?70% v/v的多元醇以及 药用防腐剂。此处的"包含……"是指该液体药物组合物中还可以含有任何其它组分，这些 组分可以以任何含量存在，只要以该含量存在的该组分是人体可接受的，并对本发明的液 体药物组合物中活性成分的生物活性没有实质性的影响即可。同理，后文中的"包括如下步 骤"是指该项实施步骤除了所列出的必要步骤外，还可以有任何其它的帮助或促进该项实 施方案完成的操作步骤。
[0029] 在一个优选的实施方案中，所述的液体药物组合物是由治疗有效量或诊断有效量 的动物毛皮屑变应原、缓冲有效量的pH5. 0?7. 0的缓冲液、浓度范围在0. 1 %?2. 0% w/ V的氨基己酸、浓度范围在30%?70% v/v的多元醇以及药用防腐剂所组成的。
[0030] 在另一个优选的实施方案中，所述的液体药物组合物包含治疗有效量或诊断有效 量的动物毛皮屑变应原、缓冲有效量的pH5. 0?7. 0的缓冲液、浓度范围在0. 1%?2. 0% w/v的氨基己酸、0. 1%?2. 0% w/v的NaCl、浓度范围在30%?70% v/v的多元醇以及药 用防腐剂。
[0031] 在一个更加优选的实施方案中，所述的液体药物组合物是由治疗有效量或诊断 有效量的动物毛皮屑变应原、缓冲有效量的pH5. 0?7. 0的缓冲液、浓度范围在0. 1%? 2. 0% w/v的氨基己酸、0· 1%?2. 0% w/v的NaCl、浓度范围在30%?70% v/v的多元醇 以及药用防腐剂所组成的。
[0032] 在一个进一步优选的实施方案中，液体药物组合物中含有浓度范围在0.5 %? I. 0% w/v的NaCl。在一个更进一步优选的实施方案中，液体药物组合物中NaCl浓度为 0. 5% w/v〇
[0033] 需要特别说明的是，对于本发明药物组合物中变应原的剂量浓度并没有太多限 制，只要其能够有效治疗（即治疗有效量）、或者有效诊断（即诊断有效量）即可。
[0034] 术语"治疗有效量"是指本发明的药物组合物应用于特异性免疫治疗（脱敏治疗） 时的浓度（剂量）。根据特异性免疫治疗（脱敏治疗）的要求，本发明的药物组合物可以 制备成多个剂量浓度的制剂，先从低剂量浓度给药，剂量再由小到大逐渐递增，至最佳维持 剂量浓度。近年来，也出现了以单一剂量持续给药的脱敏治疗方案。因此，术语"治疗有效 量"是指以单一剂量或者递增剂量服用一次或者反复服用可以导致例如适应性免疫应答并 因此使患者脱敏的剂量。当然，对于不同过敏程度的病人，其最佳的治疗剂量可能不同，本 领域技术人员通过有限次的试验即可确定该浓度。一般而言，"治疗有效量"的动物毛皮屑 变应原（浸提液）总蛋白浓度优选为〇· 01 μ g/ml?10mg/ml，更优选为0· 1 μ g/ml?Img/ ml。"治疗有效量"的动物毛皮屑变应原（单一变应原）浓度优选为0. 001 μ g/ml?lmg/ ml,更优选为 0· 01 μ g/ml ?100 μ g/ml。
[0035] 术语"诊断有效量"是指本发明的液体药物组合物应用于皮肤点刺诊断时的浓度 (剂量）。一般而言，"诊断有效量"的动物毛皮屑变应原（浸提液）总蛋白浓度优选为1 μ g/ ml?10mg/ml，更优选为10μ g/ml?lmg/ml。"诊断有效量"的动物毛皮屑变应原（单一 变应原）浓度优选为〇. 1 μ g/ml?lmg/ml，更优选为1 μ g/ml?100 μ g/ml。最佳的诊断 浓度，本领域技术人员通过有限次的试验也可以方便地确定。
[0036] 在一个优选的实施方案中，所述的动物毛皮屑变应原来源于以下动物：猫毛皮屑 变应原、狗毛皮屑变应原、马毛皮屑变应原、牛毛皮屑变应原、兔毛皮屑变应原、鼠毛皮屑变 应原。所述的变应原可以是通过商业途径购买的，也可以是采用现有的任何不使变应原蛋 白成分失活或降解的提取方法提取的，还可以通过基因工程手段获得任何种类的具有生物 活性（变应原活性）的"重组变应原"（单一变应原蛋白）。
[0037] 在一个更加优选的实施方案中，所述猫毛皮屑变应原选自：中华田园猫（包括狸 花猫、三花猫、白猫、黑猫、黑白花猫、黄猫）毛皮屑变应原、美国短毛猫毛皮屑变应原、俄国 蓝猫毛皮屑变应原、英国猫毛皮屑变应原、波斯猫毛皮屑变应原、苏格兰折耳猫毛皮屑变应 原。
[0038] 在另一个更加优选的实施方案中，所述狗毛皮屑变应原选自：中华田园犬毛皮屑 变应原、边境牧羊犬毛皮屑变应原、德国牧羊犬毛皮屑变应原、中国沙皮犬毛皮屑变应原、 阿拉斯加雪橇犬毛皮屑变应原、萨摩耶毛皮屑变应原、拉布拉多寻回犬毛皮屑变应原。
[0039] 在一个优选的实施方案中，所述的动物毛皮屑变应原是动物毛皮屑变应原浸提 液。它是将动物毛皮屑用不导致变应原严重降解或失活的去离子水或缓冲液浸提获得。进 行动物毛皮屑变应原浸提前，应先将毛皮屑材料进行粉碎。为保证变应原蛋白的活性，粉碎 过程优选在低温下进行。粉碎可选用液氮粉碎方法。
[0040] 在一个优选的实施方案中，动物毛皮屑变应原浸提液可以通过将动物毛皮屑脱 月旨、干燥、浸提、浓缩而获得。其中，脱脂所使用的有机溶剂选自但不限于：乙醚、丙酮、无水 乙醇、甲苯。浸提时所使用的缓冲液可以选自但不限于：PH7. 6的磷酸盐缓冲液、pH8. 0的 硼酸盐缓冲液、PH8. 2的磷酸盐缓冲液、pH8. 5的硼酸盐缓冲液、pH8. 9的Tris-盐酸缓冲液 等。实验证实，当缓冲液的pH为pH7. 5?10. 0,浸提的效果较好。在一个较佳的实施方案 中，选用的是PH8. 2的磷酸盐缓冲液。
[0041] 在一个更优选的实施方案中，所述的浸提过程可在低温下（优选2?8°C )进行。 低温下进行浸提可以保护蛋白的活性，减少蛋白失活的比例，同时避免浸提过程中微生物 繁殖、减少毛皮屑自身酶系的作用。在一个还要优选的实施方案中，所述的浸提液中可加入 0· 1%?5% NaCl (更佳 0.5%?2%，最佳 1% )。
[0042] 浓缩方法包括但不限于：超滤、透析。所选用膜的截流孔径可以根据需要确定，要 求在尽可能保留变应原活性的前提下除去无活性的小分子色素等杂质。同时，在浓缩过程 中，可以使用所述液体药物组合物中的缓冲液替代原浸提缓冲液。
[0043] 在一个具体的实施方案中，提取动物毛皮屑变应原浸提液包括如下步骤：
[0044] 脱脂及干燥：可连续用有机溶剂（如丙酮）浸泡干燥的动物毛皮屑（优选的，脱脂 前先将动物毛皮屑进行粉碎，更优选为液氮粉碎），每次按质量体积比1 : 5?1 : 50加 入丙酮，脱脂2?6次，每次1?24小时（优选1?12小时，更佳1?6小时），至脱脂后 的有机溶剂（如丙酮）为无色，将脱脂后的固体物自然干燥至无有机溶剂自有气味后称重。 实验室操作应在通风橱内完成，中试采用真空浓缩提取罐。
[0045] 浸提：使经脱脂干燥后的动物毛皮屑与ρΗ7· 5?10. 0 (优选pH8. 0?9. 0)的缓 冲液以一定比例（较佳1 : 5?I : 50w/v，更佳I : 10?I : 40w/v，还要佳1 : 20? I : 30w/v)提取（优选在低温条件下进行，更优选为2?8°C条件下进行），充分接触浸提 1?72小时（优选进行10?70小时，更优选48?60小时），离心或/并过滤，收集粗浸 提液。
[0046] 浓缩：选用超滤作为浓缩方法，将上述得到得到的粗浸提液使用截流分子量为 3?20kD (优选5kD)的超滤膜进行超滤，反复加入pH5. 0?7. 0的缓冲液（即所述液体药 物组合物中的缓冲液）更换缓冲体系。超滤可除去小分子色素等杂质，最终使粗浸提液体 积浓缩至原体积的1/5?1/200 (优选1/10?1/150)，得到动物毛皮屑变应原浸提液。在 一个优选的实施方案中，超滤重复多次（更优选进行2?5次）。
[0047] 在另一个优选的实施方案中，所述的动物毛皮屑变应原是单一成分的动物毛皮屑 变应原蛋白或其组合。动物毛皮屑变应原蛋白选自但不限于：Can fl、Fel dl、Equ cl、Equ c2、Bos d2、Bos d5、Ory cl、Mus ml、Rat nl〇
[0048] 在一个优选的实施方案中，所述的动物毛皮屑单一成分的变应原蛋白是通过重组 载体表达蛋白得到的，重组载体表达为本领域技术人员所熟知的技术，是将目的基因克隆 到特定的表达载体上，然后转入原核或真核生物细胞中进行表达，通过提取、分离、纯化、复 性而得到单一成分的蛋白的技术。在本发明中，可以使用任何能够成功分离出具有变应原 活性的单一成分的动物毛皮屑变应原蛋白的重组载体技术。
[0049] 在一个实施方案中，所选用的重组载体表达包含以下步骤：克隆、构建载体、表达、 纯化、重组蛋白复性。在一个具体的实施方案中，重组载体表达方法包含以下步骤：
[0050] 1)克隆动物变应原蛋白基因并构建融合表达的质粒载体：融合表达是指将目的 基因和标签蛋白（tag)基因拼接在一起并克隆到载体上并同时表达，表达后可以通过识别 和筛选标签蛋白的方式使得目的蛋白被分离和纯化出来。通过文献调研或NCBI网站上的 序列搜索得到特定的动物变应原蛋白cDNA序列，将该序列加上tag，克隆后连接到原核表 达载体上，并转化入用于表达蛋白的大肠杆菌中；其中，所使用的tag可以选自但不限于： His-tag、T7_tag、HSV-tag、S-tag、HA-tag、Flag-tag、Myc-tag 等多种。表达载体可以选自 但不限于：pET系列、pQE系列等。表达菌株可以选自但不限于：BL21、M25等。
[0051] 2)蛋白表达：诱导蛋白表达；诱导方式选自但不限于：IPTG诱导、高温诱导、阿拉 伯糖诱导。
[0052] 3)蛋白纯化：离心菌体并溶于浓度范围在一定浓度的PBS缓冲液（优选10? 50mM)中，破碎大肠杆菌细胞收集蛋白包涵体。将收集到的溶液通过特殊的可以特异性结合 tag的结合柱（例如连上的tag为His-tag，则使用的结合柱为镍柱）。洗涤以除去包涵体 上粘附的杂质，如膜蛋白或核酸。洗涤后，通过加入强的变性剂使包涵体溶解，洗涤溶液可 以是但不限于：2M尿素与ImM EDTA溶于50mM PBS的洗脱液。变性剂选自但不限于：4? 8M的尿素、2?6M的盐酸胍。
[0053] 4)蛋白的复性：复性方式选自但不限于：稀释复性、透析复性、超滤复性等。
[0054] 在上述步骤中，标签蛋白，表达载体，表达菌株、IPTG、EDTA、Tris均为本领域技术 人员所熟知的实验材料。克隆、转化、稀释复性、透析复性、超滤复性均为本领域技术人员所 熟知的技术。
[0055] 在另一个具体的实施方案中，参考专利US 7, 667, 009 B2,重组载体表达包含以下 步骤：
[0056] 1)克隆动物变应原蛋白基因并构建质粒载体；2)蛋白表达：诱导蛋白表达；3)洗 涤和回收包涵体；4)溶解包涵体，然后复性；5)通过超滤膜滤过小分子，收集变应原蛋白； 6)用弱阴离子交换收集非吸收片断中的蛋白；7)疏水凝胶层析收集吸收片断里的变应原； 8)用强阴离子交换回收变应原蛋白。详细步骤可以在参考的专利说明书中查到。
[0057] 在另一个优选的实施方案中，所选的单一成分的动物毛皮屑变应原蛋白获得 的方法是天然动物毛皮屑变应原蛋白纯化。参考L.Mattsson的文章 Molecular and immunological characterization of Can f 4 ：a dog dander allergen cross-reactive with a 23 kDa odorant-binding protein in cow dander(Clinical&Experimental Allergy，Volume 40，Issue 8，pages 1276-1287，August 2010)及专利 US 5747047A 中 的蛋白纯化方法，包括如下步骤：粗提动物毛皮屑蛋白、过分子筛、离子交换层析，更优选的 可以进一步将纯化的蛋白溶液进行反向色谱以获得纯度更高的变应原蛋白。其中，粗提动 物毛皮屑变应原所用的缓冲液以及过分子筛后所溶于的缓冲液选自但不限于：生理盐水、 pH5. 0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、pH6. 0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、pH7. 5的磷酸 氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、pH8. 0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、pH8. 2的coca' s 液、pH8. 9的Tris-盐酸缓冲液等。在一个较佳的实施方案中，选用的是pH8. 0的磷酸氢二 钠-磷酸二氢钠缓冲液。以上所述的分子筛，离子交换层析，反向色谱均是该领域技术人员 所熟知的技术，其中分子筛所使用的大小，离子交换层析中洗脱所用的盐溶液浓度及梯度， 反向色谱所选用的洗脱液等具体方式均可以因实验对象的不同（即所需纯化的蛋白的性 质及大小不同）而进行调整，只要这些参数的选择有利于特定蛋白的纯化，则均可以被采 用。
[0058] 在一个具体的实施方案中，制备该单一成分的动物变应原蛋白的方法包括如下步 骤：
[0059] 1)粗提动物毛皮屑蛋白：将动物毛皮屑在缓冲液中破碎收集后，用纤维脂膜过滤 器过滤。
[0060] 2)过分子筛：根据不同蛋白的分子量大小，选择不同大小的分子筛。将筛到的一 定大小的蛋白收集后，利用脱盐柱进行脱盐后溶于缓冲液中。
[0061] 3)离子交换层析：将上一步过分子筛收集到的蛋白溶液进一步进行离子交换层 析，并用一定浓度范围（优选浓度范围在〇?lrnol/L)的NaCl溶液进行洗脱，人工收集各 峰流出液。再根据洗脱结果重新用递进式洗脱，将各峰进一步拉开。收集正确的峰处的流 出液。进行透析以将溶液置换成PH5. 0?7. 0的缓冲液（即前述的液体药物组合物中的缓 冲液），得到纯化后的动物变应原蛋白。在一个优化的实施方案中，可在透析前先将离子交 换层析分离出的蛋白溶液进行反向色谱以分离出纯度更高的变应原。
[0062] 在一个优选的实施方案中，所述的液体药物组合物中所含有的氨基己酸浓度范围 在0. 3 %?1. 0% w/v。在一个进一步优选的实施方案中，液体药物组合物中所含有的氨基 己酸浓度为〇. 65% w/v。
[0063] 本发明中所述的"缓冲液"是本【技术领域】人员所熟知的，包括但不限于：甘氨 酸-盐酸缓冲液、邻苯二甲酸-盐酸缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、柠檬酸-氢氧化 钠-盐酸缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液、乙酸-EDTA缓冲液、邻 苯二甲酸氢钾-氢氧化钠缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二 氢钾缓冲液、磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液、Tris-盐酸缓冲液、硼 砂-盐酸缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、硼砂-氢氧化钠缓冲液、 碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液、碳酸钠-氢氧化钠缓冲液、磷酸氢二钠-氢氧化钠缓冲液、氯化 钾-盐酸缓冲液、氯化钾-氢氧化钠缓冲液等。本领域技术人员可以通过市售获得以上缓 冲液，也可根据需要配制一定PH值的缓冲液。除非另有所述，本发明中所述的"pH值"都是 在25 °C条件下所测的pH值。
[0064] 术语"缓冲有效量"是指所述缓冲液的浓度足以使所述液体药物组合物的pH维持 在一个特定pH值（优选pH5.0?7.0) ±0.5 (更佳±0.3,还要佳±0.2,最佳±0. 1)个pH 单位内。例如但不限于,ρΗ6· 0 ± 0· 2 (即ρΗ5· 8?6. 2)，或者ρΗ5· 0 ± 0· 3 (即ρΗ4· 7?5. 3) 等。具体所述缓冲液的浓度与缓冲液的种类、PH值、整个药物组合物的具体组成等因素有 关，其可由本领域技术人员根据有限次的常规实验来方便地确定。一般，所述的液体药物组 合物中的缓冲液的浓度范围在5mmol/L?500mmol/L，更优选为20?200mmol/L。
[0065] 在一个优选的实施方案中，所述的液体药物组合物中的缓冲液的pH的范围为 pH5. 0?6. 5。在另一个优选的实施方案中，所述的液体药物组合物中的缓冲液的pH选自 ρΗ5· 0, ρΗ5· 5, ρΗ6· 0, ρΗ6· 5, ρΗ7· 0。在一个进一步优选的实施方案中，所述的缓冲液选自 pH5. 0的乙酸-乙酸钠缓冲液、ρΗ5. 5的乙酸-EDTA缓冲液、pH6. 0的磷酸氢二钠-柠檬酸 缓冲液、ΡΗ6. 5的Tris-盐酸缓冲液、pH7. 0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液。
[0066] 多元醇的作用是赋予变应原药物适宜的渗透张力。在一个实施方案中，所述的液 体药物组合物中的多元醇选自但不限于丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇、聚乙二醇，多元 醇的浓度范围在30%?70% ν/ν。在一个优选的实施方案中，所述的液体药物组合物中多 元醇的浓度范围在40%?60% ν/ν。在一个进一步优选的实施方案中，所述的液体药物组 合物中的多元醇的浓度范围在45%?55% ν/ν。在一个更进一步优选的实施方案中，所述 的液体药物组合物中的多元醇为45%?55% ν/ν的甘油。在一个最优选的实施方案中，所 述液体药物组合物中的多元醇为50% ν/ν的甘油。
[0067] 药用防腐剂是本领域技术人员所熟知的，它的作用是抑制病原微生物的生长。在 一个优选的实施方案中，所述的液体药物组合物中的药用防腐剂选自但不限于苯酚、硫柳 汞、苯甲酸、山梨酸、山梨酸盐类、对羟基苯甲酸酯类、苯甲醇、苯乙醇或其组合。一般，药用 防腐剂的浓度范围在〇. 1%?3% w/v。在一个优选的实施方案中，所述的液体药物组合物 中的药用防腐剂为〇. 1 %?0.5% w/v的苯酚。在另一个优选的实施方案中，所述的液体药 物组合物中的药用防腐剂为0. 1 %?0. 2% w/v的山梨酸钾。在一个更优选的实施方案中， 所述的液体药物组合物中的药用防腐剂为〇. 4% w/v的苯酚。
[0068] 制备上述液体药物组合物毛皮屑包括如下步骤：将治疗有效量的动物毛皮屑变应 原、缓冲有效量的pH5. 0?7. 0的缓冲液、浓度范围在0. 1 %?2. 0% w/v的氨基己酸、多元 醇以及药用防腐剂混合。在一个优选的实施方案中，所述方法还包括将〇. 1%?2. 0% w/v 的NaCl加入混合。
[0069] 在一个具体的实施方案中，制备该药物组合物包含如下步骤：
[0070] 1)将得到的动物毛皮屑变应原蛋白（可以选自动物毛皮屑变应原浸提液或单一 成分的动物毛皮屑变应原蛋白或其组合）进行检测，检测项目包括：总蛋白浓度，主要变应 原蛋白浓度。
[0071] 药物组合物中的总蛋白浓度可以通过Brandford蛋白浓度测定法或BCA蛋白浓度 测定法测定得到。药物组合物中主要变应原蛋白的浓度通过酶联免疫吸附（ELISA)方法测 定得到。Brandford蛋白浓度测定法、BCA蛋白浓度测定法、ELISA检测法都是本领域技术 人员所熟知的技术。
[0072] 2)将制备得到的动物毛皮屑变应原（可以选自动物毛皮屑变应原浸提液或单一 成分的动物毛皮屑变应原蛋白或其组合）用缓冲有效量的pH5. 0?7. 0的缓冲液混合稀 释；再加入浓度范围在0. 1%?2. 0% w/v的氨基己酸、多元醇以及药用防腐剂（更优选的 再加入0. 1 %?2. 0 % w/v的NaCl)。进一步优选地，可以将得到的药物组合物进行过滤除 菌。所述过滤除菌用的滤膜选自孔径为3 μ m、0. 8 μ m、0. 45 μ m、0. 22 μ m的滤膜或其组合。 若使用不同孔径滤膜组合，则按照孔径由大至小的顺序原则进行使用。将药物组合物进行 过滤除菌，有利于该药物组合物的长期保存。
[0073] 从长期稳定性试验可以得知，本发明的含有动物毛皮屑变应原的液体药物组合物 具有很高的稳定性，在2?8°C条件下能稳定保存24个月以上。
[0074] 本发明所述的液体药物组合物可用于诊断由动物毛皮屑引起的过敏性疾病。所述 的诊断可以是皮肤点刺试验，其方法为，将含有诊断有效量的动物毛皮屑变应原的药物滴 于患者前臂，再用点刺针轻轻刺入皮肤表层。如患者对该变应原过敏，则会于十五分钟内在 点刺部位出现风团与红晕。
[0075] 本发明所述的液体药物组合物可用于由动物毛皮屑引起的过敏性疾病的特异性 免疫治疗（脱敏治疗）。分别配制浓度由低到高的动物毛皮屑变应原的液体药物组合物，给 药浓度逐渐递增，至维持浓度长期治疗，使患者对所述变应原脱敏，从而达到治疗的目的。
[0076] 下面将结合实施例进一步详细地描述本发明。应当理解，列举这些实施例只是为 了起说明作用，而并不是用来限制本发明的范围。
[0077] 实施例一：制备含有猫毛皮屑变应原的液体药物组合物
[0078] 选择猫毛皮屑变应原浸提物作为变应原，制备稳定的液体药物组合物，其具体步 骤如下：
[0079] 1、粉碎：液氮粉碎中华田园猫毛皮屑原材料；
[0080] 2、脱脂：按质量体积比约I : 10加入丙酮脱脂，搅拌约2小时，过滤，弃丙酮溶液， 脱脂共3次。至脱脂液目测基本无色。脱脂粉末干燥不少于36小时，至无丙酮味。
[0081] 3、浸提：2?8°C，以I : 20(w/v)的浸提比例加入含有L 0% NaCl的50mM ρΗ8· 2 的磷酸盐缓冲液，浸提48?60小时。离心及逐级过滤，直至0. 22 μ m滤膜滤过顺畅。
[0082] 4、浓缩：将步骤3得到的粗浸提液分成a、b、c、d四组，2?8°C，使用孔径为5kD 的超滤装置超滤，a组在超滤过程中连续加入200mM的pH5. 0的乙酸-乙酸钠缓冲液代替 原浸提缓冲液，b组在超滤过程中连续加入50mM的pH6. 0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液代 替原浸提缓冲液，c组在超滤过程中连续加入50mM的pH6. 0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液 代替原浸提缓冲液。d组在超滤过程中连续加入生理盐水代替原浸提缓冲液。超滤过程使 得溶液浓缩至原体积的约1/30。
[0083] 5、将步骤4得到的四组浓缩液使用每组对应的溶液（缓冲液或生理盐水）稀释4 倍，得到猫毛皮屑浸提液，然后各组分别按照以下步骤进行配制：
[0084] a组：每600mL猫毛皮屑浸提液（ρΗ5· 0)中加入20g NaCl、Ig氨基己酸、400mL甘 油、4g苯酚，混勻；
[0085] b组：每500mL猫毛皮屑浸提液（pH6. 0)中加入IOg NaCl、6. 5g氨基己酸、500mL 甘油、4g苯酚，混勻；
[0086] c组：每500mL猫毛皮屑浸提液（ρΗ6· 0)中加入IOg NaCl、500mL甘油、4g苯酚，混 匀；
[0087] d组：每500mL猫毛皮屑浸提液（生理盐水）中加入500mL甘油、4g苯酚，混匀；
[0088] 6、用0. 22 μ m孔径的滤器过滤除菌。
[0089] 实施例二：含有猫毛皮屑变应原的液体药物组合物在2_8°C条件下的长期稳定性 试验
[0090] 按照本发明实施例一中a、b、c、d四种配比分别制备得到四组含有猫毛皮屑变应 原的液体药物组合物，将其于2-8 °C条件下放置，分别于第0个月、3个月、6个月、9个月、12 个月、24个月末进行检测。通过Brandford法检测总蛋白浓度、ELISA法检测主要变应原蛋 白Fel d 1浓度。结果如表1所示：
[0091] 表 1
[0092]
[0093]
【权利要求】
1. 一种稳定的含有动物毛皮屑变应原的液体药物组合物，其特征在于，该液体药物组 合物包含治疗有效量或诊断有效量的动物毛皮屑变应原、缓冲有效量的PH5. 0?7. 0的缓 冲液、浓度范围在〇. 1 %?2. 0% w/v的氨基己酸、浓度范围在30%?70% v/v的多元醇以 及药用防腐剂。
2. 根据权利要求1所述的液体药物组合物，其特征在于，该液体药物组合物还包含浓 度范围在〇? 1%?2. 0% w/v的NaCl。
3. 根据权利要求1或2所述的液体药物组合物，其特征在于，所述动物毛皮屑变应原选 自猫毛皮屑变应原、狗毛皮屑变应原、马毛皮屑变应原、牛毛皮屑变应原、兔毛皮屑变应原、 鼠毛皮屑变应原。
4. 根据权利要求1或2所述的液体药物组合物，其特征在于，所述动物毛皮屑变应原为 动物毛皮屑变应原浸提液。
5. 根据权利要求1或2所述的液体药物组合物，其特征在于，所述动物毛皮屑变应原为 单一成分的动物毛皮屑变应原蛋白或其组合。
6. 根据权利要求1或2所述的液体药物组合物，其特征在于，氨基己酸浓度范围在 CU^nLO^w/v。
7. 根据权利要求1或2所述的液体药物组合物，其特征在于，所述缓冲液的pH值范围 为 pH5. 0 ?6. 5。
8. 根据权利要求1或2所述的液体药物组合物，其特征在于，所述多元醇选自丙二醇、 甘油、山梨糖醇、甘露糖醇、聚乙二醇。
9. 根据权利要求1或2所述的液体药物组合物，其特征在于，所述药用防腐剂选自苯 酚、硫柳汞、苯甲酸、山梨酸、山梨酸盐类、对羟基苯甲酸酯类、苯甲醇、苯乙醇或其组合。
10. 根据权利要求1或2所述的液体药物组合物，其特征在于，所述液体药物组合物的 剂型选自：口服剂、皮下注射剂、舌下含服剂、气雾剂、鼻腔剂、皮肤点刺剂。
【文档编号】A61K39/35GK104491858SQ201410719332
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年11月21日 优先权日:2014年11月21日
【发明者】李勤 申请人:浙江我武生物科技股份有限公司