pm冷冻离心10min，收集沉淀菌 体，用无菌水清洗菌体后，加入无菌水制成浓度为l〇 8CFU/ml的菌悬液配；
[0075] 2)步骤1)制备的菌悬液与无菌水按照1 :4的体积比复配，即得所述的促小麦幼 苗生长的菌剂。
[0076] 实施例6
[0077] 实施例3本实施例促小麦幼苗生长的菌剂，其制备方法的具体操作步骤为：
[0078] 1)将实施例1制备的大豆根瘤内生菌DEntl302菌株在YM液体培养基中29°C条 件下恒温130rpm震荡培养4天得混合液，将混合液在8000rpm冷冻离心10min，收集沉淀菌 体，用无菌水清洗菌体后，加入无菌水制成浓度为l〇 8CFU/ml的菌悬液；
[0079] 2)步骤1)制备的菌悬液与无菌水按照1 :5的体积比复配，即得所述的促小麦幼 苗生长的菌剂。
[0080] 实施例7
[0081] 实施例3本实施例促小麦幼苗生长的菌剂，其制备方法的具体操作步骤为：
[0082] 1)将实施例1制备的大豆根瘤内生菌DEntl302菌株在YM液体培养基中29°C条 件下恒温130rpm震荡培养4天得混合液，将混合液在8000rpm冷冻离心10min，收集沉淀菌 体，用无菌水清洗菌体后，加入无菌水制成浓度为l〇 8CFU/ml的菌悬液；
[0083] 2)步骤1)制备的菌悬液与无菌水按照2 :1的体积比复配，即得所述的促小麦幼 苗生长的菌剂。
[0084] 试验例1实施例1制备的大豆根瘤内生菌DEntl302培养特征和生长特性试验
[0085] A :培养特征：将实施例1制备的大豆根瘤内生菌DEntl302在牛肉膏蛋白胨培养 基上28°C条件下培养3天，菌落呈乳白色，稍带黄色，经36小时培养菌落大小在3-5mm，菌 落边缘有缺刻，表面无光泽、无突起，无皱褶，如图1所示；
[0086] 将实施例1制备的大豆根瘤内生菌DEntl302用革兰氏进行染色，观察菌体经染色 后呈紫色，杆状，菌体大小为（0. 6-1. 1) X (1. 2-2. 5) y m，无芽孢，生殖方式为二分裂，如图 2所示。
[0087] B :生长特性：将实施例1制备的大豆根瘤内生菌DEntl302在牛肉膏蛋白胨液体 培养基上130rpm振荡培养48h，在600nm波长下测定OD值，以培养时间为以培养时间为横 坐标，OD值为纵坐标，测定菌株的生长曲线，如图3所示，当菌株接种至培养基上培养2h(潜 伏期），开始进入对数生长期，持续12h ;到14h菌体进入平稳期生长（大约为30个小时）， 培养至44h菌株开始进入衰亡期。
[0088] 试验例2对实施例1制备的大豆根瘤内生菌DEntl302进行分子鉴定
[0089] 将实施例1制备的大豆根瘤内生菌DEntl302接种到牛肉膏琼脂液体培养基，培养 3-5天，12000rpm离心10min收集菌体。采用细菌基因组DNA试剂盒0SR-M502 (天根生化 科技有限公司）提取细菌基因组DNA，进行16S rRNA基因的扩增，（具体给出所用引物、扩 增体系、反应条件），对扩增产物进行测序，，根据测序结果，将扩增得到的序列在GenBank 中进行BLAST分析，用DNAMAN6. 0进行序列相似性分析，结果表明实施例1制备的大豆根瘤 内生菌 DEntl302 与 Enterobacter ludwigii EN-119T(AJ853891)的相似率为 98.3%。16S rRNA基因扩增序列如序列表SEQ ID N0:1所示。
[0090] 试验例3实施例1制备的大豆根瘤内生菌DEntl302的促生长特性
[0091] A :溶解无机磷特性：
[0092] 1)菌悬液制备
[0093] 将实施例1制备的大豆根瘤内生菌DEntl302在YM液体培养基（甘露醇10g， K 2HP040. 5g，MgS04. 7H20 0? 2g，NaCl 0? 10g，酵母粉 3. 0g，H20 1000mL，pH 6. 8-7. 0)培养 24h 得混合液，将混合液倒入2mL离心管中，8000r/min离心10min，收集沉淀菌体，用无菌水清 洗菌体后加入无菌水，涡旋振荡制成菌悬液，调节OD值为0. 8 (约108~10 9CFU/mL)以备 用；
[0094] 2)溶磷性大豆根瘤内生菌初筛
[0095] 采用多点接种法，分别吸取1)中制备的菌悬液100ml加入多点接菌器每个槽内， 接种至预先制备的无机磷培养基（葡萄糖l〇g，Ca 3 (P04) 25g，MgCl25g，MgS04. 7H200. 25g，KC1 0? 2g，（NH4)2S040. lg，琼脂15g，去离子水1000mL，pH7. 0)平板上，每个平板接种5个菌样， 28°C~30°C下培养4-7d，观察有无溶磷圈形成，测定溶磷圈直径（D)、菌落直径（d)，根据能 否产生溶磷圈和D/d值大小来判断菌株有无溶磷能力及溶磷能力大小；
[0096] 3)溶磷性大豆根瘤内生菌复筛
[0097] 对初筛获得的溶磷能力较强菌株采用与初筛相同的方法进行复筛，复筛3次后置 于28°C条件下恒温培养4~7d，观察并测定溶磷圈直径和菌落直径大小，结果如下表1所 示：
[0098] 表1大豆根瘤内生菌DEnt 1302溶磷性复筛结果
[0099]
【主权项】
1. 一种大豆根瘤内生菌DEntl302,其特征在于，所述大豆根瘤内生菌DEntl302为肠杆 菌（Enterobacter ludwigi)DEntl302,其保藏编号为 CCTCC NO :M2013621〇
2. -种如权利要求1所述的大豆根瘤内生菌DEntl302的制备方法，其特征在于，包括 以下操作步骤： 1) 对大豆根瘤进行表面消毒处理； 2) 在无菌条件下，取表面消毒处理后的大豆根瘤汁液涂抹在牛肉膏蛋白胨培养基平板 上进行培养； 3) 步骤2)培养获得的单菌落分别转移到牛肉膏蛋白胨培养基上进行划线分离，筛选 获得菌体大小均一，形状一致的菌株，即得所述的大豆根瘤内生菌DEntl302。
3. 如权利要求2所述的大豆根瘤内生菌DEntl302的制备方法，其特征在于，所述牛肉 膏蛋白胨培养基的组成为：每1000 ml水中含有牛肉膏2~4g，蛋白胨8~12g，NaC13~ 6g，琼脂15~20g。
4. 一种促小麦幼苗生长的菌剂，其特征在于，由含有如权利要求1所述的大豆根瘤内 生菌DEntl302的菌悬液与无菌水复配而成；其中菌悬液的浓度为10 8CFU/ml，菌悬液与无 菌水的体积比为（1~2) : (1~5)。
5. -种如权利要求4所述的促小麦幼苗生长的菌剂的制备方法，其特征在于，包括采 用YM液体培养基对如权利要求1所述的大豆根瘤内生菌DEntl302进行活化培养后，收集 菌体，制成浓度为l〇 8CFU/ml的菌悬液，将菌悬液与无菌水复配，即得所述的促小麦幼苗生 长的菌剂。
6. -种如权利要求1所述的大豆根瘤内生菌DEntl302在促进小麦生长方面的应用。
7. -种如权利要求1所述的大豆根瘤内生菌DEntl302在制备纤维素酶方面的应用。
8. -种如权利要求1所述的大豆根瘤内生菌DEntl302在制备果胶酶方面的应用。
9. 一种如权利要求1所述的大豆根瘤内生菌DEntl302在制备ACC脱氨酶方面的应用。
10. -种如权利要求1所述的大豆根瘤内生菌DEntl302在制备吲哚乙酸方面的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种大豆根瘤内生菌DEnt1302及其制备方法和应用，菌剂及其制备方法，属于微生物技术领域。本发明大豆根瘤内生菌DEnet1302，为肠杆菌(Enterobacter ludwigi)DEnt1302，其保藏编号为CCTCC NO：M2013621，具有溶解无机磷的能力，能够产生果胶酶和纤维素酶，ACC脱氨酶、吲哚乙酸，促进小麦幼苗生长。本发明大豆根瘤内生菌的制备方法，采用牛肉膏蛋白胨培养基，并采用单菌落划线分离纯化培养的方式，分离得到大豆根瘤内生菌，操作简便，易于控制，纯度高。本发明采用大豆根瘤内生菌的菌悬液与无菌水复配制备的菌剂具有促小麦幼苗生长的作用。CCTCC NO：M201362120131201
【IPC分类】C12N9-26, C12N9-42, A01N63-00, C12N9-88, C12R1-19, C12P17-10, C12N9-18, C12N1-20, A01P21-00
【公开号】CN104651286
【申请号】CN201510119822
【发明人】赵龙飞, 徐亚军
【申请人】商丘师范学院
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2015年3月18日