一种秸秆腐熟菌剂及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及腐熟菌剂，特别是涉及能快速、原位腐熟农作物秸杆的一种秸杆腐熟 菌剂及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 农作物秸杆的主要成分是纤维，且富含氮、磷、钾、钙、镁和有机质等，是一种具有 多用途的可再生的生物资源。我国农作物秸杆年均产量有7亿吨，其中三分之一被丢弃或 者焚烧，而秸杆焚烧会增加空气中C0 2的含量和可吸入颗粒物等，不仅造成资源浪费，还导 致严重的环境污染，危害人体健康。
[0003] 我国目前解决大面积秸杆问题的主要方法是直接还田，但还田速度慢且直接导致 土壤温度低，影响作物生长，因此秸杆还田的生物有效性低。通过秸杆堆肥可以在一定程度 上提高秸杆的利用率，然而秸杆纤维结构复杂，单一的微生物对其分解能力弱，造成秸杆自 然堆肥存在分解周期长、堆肥质量较差等问题。腐熟菌剂是多种微生物混合复配的生物菌 剂，且不同微生物可合成不同酶系。在秸杆中添加腐熟菌剂则可通过不同微生物的协同互 补作用有效降解秸杆，增强秸杆的生物利用率，改善土壤肥力，提高农作物产量与质量，同 时有效推进农业的可持续发展，并实现资源的可再生利用。但目前的秸杆腐熟剂中存在着 降解纤维复合酶的酶活不高、原位腐熟效率不佳、评价指标粗放等问题。
[0004] 中国专利201310611671. 7公开农作物秸杆腐熟剂及使用方法，利用该专利制备 腐熟菌剂时，需要在枯草芽孢杆菌、黑曲霉、产朊假丝酵母、绿色木霉、米曲霉的混合菌体物 中额外添加纤维素酶制剂，使秸杆腐熟时间有所缩短；中国专利201310641595. 4公开一种 低温状态下快速启动腐熟的秸杆腐熟剂及其制备方法，同样需要在腐熟菌剂加入额外的酶 制剂，从而提高腐熟菌剂的纤维素酶活。
[0005] 秸杆堆腐发酵后再作为有机肥还田是目前广泛采用的一种方法，中国专利 201010228347. 3、201310666396. 9、201310308892. 7均提供了用于堆腐发酵的秸杆腐熟菌 剂，而秸杆堆腐发酵具有费劳力、成本高的缺点。
【发明内容】
[0006] 鉴于现有腐熟菌剂存在的上述不足，本发明的目的在于提供高纤维复合酶酶活且 能克服自然复杂环境进行原位腐熟，利用微生物和生物酶的协同作用快速降解秸杆，有效 改善土壤肥力，提高农作物产量与质量，保护生态环境的一种秸杆腐熟菌剂及其制备方法 和应用。
[0007] 所述秸杆腐熟菌剂由枯草芽孢杆菌粉剂、长枝木霉粉剂和灰略红链霉菌粉剂复配 组成，按质量百分比的组成为枯草芽孢杆菌粉剂5%~15%、长枝木霉粉剂50%~70%、灰 略红链霉菌粉剂25 %~45% ;
[0008] 枯草芽抱杆菌（Bacillus subtilis)三炬-07、长枝木霉（Trichoderma longibrachiatum)三炬-08 和灰略红链霉菌（Streptomyces griseorubens)三炬-09 均已 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心地址为北京市朝阳区北 辰西路1号院3号中国科学院微生物研宄所，邮编100101，保藏日期均为2014年12月29 日，保藏中心登记入册编号分别为 CGMCC No. 10248、CGMCC No. 10144、CGMCC No. 10247。
[0009] 所述秸杆腐熟菌剂的制备方法，具体步骤如下：
[0010] 通过固态发酵法分别制备枯草芽孢杆菌、长枝木霉、灰略红链霉菌的发酵菌体及 其产物，干燥后粉碎成枯草芽孢杆菌粉剂、长枝木霉粉剂和灰略红链霉菌粉剂，混合后即得 秸杆腐熟菌剂。
[0011] 通过固态发酵法制备枯草芽孢杆菌的发酵菌体及其产物所采用的液体种子培养 基的组成可为：葡萄糖20.0g/L、蛋白胨16.7g/L、NaCl 5.3g/L、牛肉膏5.3g/L，pH 7.0; 固态培养基按质量百分比的组成为麸皮93. 97%、豆柏粉4.94%、MgS04 ? 7H20 0.05%、 NH4S040. 05%、CaC030 . 99%，加入培养料总质量50%的水后混匀121°C灭菌lh。
[0012] 通过固态发酵法制备长枝木霉的发酵菌体及其产物所采用的液体种子培养基的 组成可为：马铃薯葡萄糖培养基粉剂33. 3g/L，pH自然；固态培养基按质量百分比的组成为 麸皮 93. 97 %、豆柏粉 4. 94%、MgS04 ? 7H20 0? 05 %、NH4S040. 05 %、CaC030 . 99 %，加入培养 料总质量50%的水后混匀121°C灭菌lh。
[0013] 通过固态发酵法制备灰略红链霉菌的发酵菌体及其产物所采用的液体种子培养 基的组成可为：小米 20. 0g/L、KN03l. 0g/L、K2HP040. 5g/L、MgS04 ? 7H20 0? 5g/L、NaCl 0? 5g/ L，pH 7. 2 ;固态培养基按质量百分比的组成为小米99.42%、KN030. 1 %、K2HP040.05%、 MgS04 ? 7H20 0? 05%、NaCl 0? 05%、CaC030. 33%，pH 为 7. 2,小米按 1. 8mL/g 的比例加水浸 泡24h后121°C灭菌20min再与其它成分混合。
[0014] 固态发酵的条件及其要求如下：
[0015] 枯草芽孢杆菌液体种子以100mL/kg的比例接种至固态培养基中，于30°C恒温发 酵4~8d，发酵结束时发酵物水分< 21 %，有效活菌数为多50亿/g ;
[0016] 长枝木霉液体种子以100mL/kg的比例接种至固态培养基中，于30°C恒温发酵4~ 9d，发酵结束时发酵物水分< 20 %，有效活菌数为多1. 5亿/g ;
[0017] 灰略红链霉菌液体种子以100mL/kg的比例接种至固态培养基中，于50°C发酵2~ 5d，发酵结束时发酵物水分< 15 %，有效活菌数为多0. 2亿/g。
[0018] 所述秸杆腐熟菌剂可在制备秸杆腐熟降解剂中应用。
[0019] 本发明所述秸杆腐熟菌剂，以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)、长枝木霉 (Trichoderma longibrachiatum)、灰略红链霉菌（Streptomyces griseorubens)菌为制备 菌种，将三种菌株分别接种到液体种子培养基中制成种子液，然后再分别按一定比例接种 到固态培养基中。
[0020] 本发明具有以下突出优点：
[0021] 本发明采用的枯草芽孢杆菌、长枝木霉、灰略红链霉菌互不拮抗，且能分泌合成降 解纤维的复合酶系，三种菌及其分泌的生物酶形成一个高效的协同体系，能快速地腐熟秸 杆。枯草芽孢杆菌具有较高的木质素酶、半纤维素酶、纤维素酶的酶活，能有效分解秸杆，提 高秸杆腐熟效果，且枯草芽孢杆菌在生长繁殖过程中可合成短杆菌肽、枯草菌素、多粘菌素 等活性物，能够有效抑制作物致病菌的生长。长枝木霉是产纤维素酶能力较强的菌株之一， 能明显促进以降解纤维素为主的秸杆腐熟过程。灰略红链霉菌可产生多种代谢产物，除了 具有纤维素酶活性外，同时具有多种木质纤维素酶活性，可进一步加快腐熟速度。
[0022] 本发明的腐熟菌剂的菌种组合简单，制备方法简易，三株菌复配可有效提高秸杆 腐熟全过程的降解效率，利用三株菌的优化组合可使秸杆腐熟的时间大大缩短，无需额外 添加酶制剂，最快约可使秸杆腐熟完成提前30d。此外，添加了腐熟菌剂的秸杆在原位腐熟 后，可改善土壤结构与肥力，抑制土壤土传病害，提高作物的产量与质量，具有重要的经济 价值和深远的生态意义。因此本发明制备的所述秸杆腐熟菌剂可在制备秸杆腐熟降解剂中 应用。
【具体实施方式】
[0023] 为使本领域的技术人员能进一步了解本发明，下面列举本发明的具体实施例，详 细说明本发明的技术方案。实施例中所述试验方法、试剂及材料，如无特殊说明，均可从商 业途径获得或以常规方法制备。需强调的是实施例并非本发明技术方案所有可能实施方式 的穷举，故不用于限制本发明的保护范围。
[0024] 本发明所述秸杆腐熟菌剂的制备方法和田间试验实施方式如下。
[0025] 实施例1枯草芽孢杆菌粉剂的制备
[0026] 1、将储存于4°C冰箱内的枯草芽孢杆菌活化，并用接种环刮取菌落接种至营养液 体种子培养基中，30°C、180rpm摇瓶培养2d。液体种子培养基配方（g/L)为葡萄糖20.0、蛋 白胨 16. 7、NaCl 5. 3、牛肉膏 5. 3, pH 7. 0。
[0027] 2、将制备的液体种子液以100mL/kg的比例接种至固态发酵培养基中，搅拌均 匀，于30°C恒温发酵8d。固态发酵培养基配方（W% )为麸皮93. 97%、豆柏粉4. 94%、 1^04,71120 0.05%、順45040 . 05%、0&0)30.99%，加入培养料重量的50%水后，搅拌均匀， 121°C 灭菌 20min。
[0028] 3、枯草芽孢杆菌经摇瓶扩大培养、固态发酵8d后其有效活菌数达约67亿/g，芽孢 数约50亿/g，芽孢率约为83 %，纤维素酶活102U/g，pH 6. 9,水分21 %。
[0029] 4、收集枯草芽孢杆菌菌体及其发酵产物，用粉碎机粉碎成粉剂（不超过10s)，将 粉剂密封备用。
[0030] 实施例2长枝木霉粉剂的制备
[0031] 1、将储存于4°C冰箱内的长枝木霉活化，制备孢子悬浮液，将lmL长枝木霉的孢子 悬液接种至200mL的营养液体种子培养基中，30°C、180rpm摇瓶培养2d。营养液体种子培 养基配方为马铃薯葡萄糖培养基粉剂33. 3g/L，自然pH，121°C灭菌20min。
[0032] 2、将制备的液体种子以为100mL/kg的比例接种至固态发酵培养基中，搅拌均 匀，于30°C恒温发酵8d。固态发酵培养基配方（W% )为麸皮93. 97%、豆柏粉4. 94%、 1^04,71120 0.05%、順45040.05%、03〇)30 . 99%，加入培养料重量的50%水后搅拌均匀， 121°C 灭菌 lh。
[0033] 3、长枝木霉经摇瓶扩大培养、固态发酵8d后其有效活菌数达约2. 1亿/g，纤维素 酶活达 94U/g，pH 6. 8,水分 20%。
[0034] 4、收集长枝木霉菌体及其发酵产物，用粉碎机粉碎成粉剂（不超过10s)，将粉剂 密封备用。
[0035] 实施例3灰略红链霉菌粉剂的制备
[0036] 1、将储存于4°C冰箱内的灰略红链霉菌活化，用接种环刮取灰略红链霉菌孢子接 种于200mL营养液体种子液摇瓶培养基中，50°C、180rpm培养2d。灰略红链霉菌的液体种 子培养基配方&/1)为小米20.0、謂0 31.0、1(2册040.5，]\%504.711 20 0.5、恥(：10.54117.2。
[0037] 2、将制备的液