一种酶-菌双联秸秆腐熟剂及其制备方法和使用方法
【技术领域】
[0001]本发明属于农作物秸杆处理技术领域，具体涉及一种酶-菌双联秸杆腐熟剂及其制备方法和使用方法。
【背景技术】
[0002]我国是农业大国，各类农作物秸杆资源十分丰富，秸杆年产量达7亿多吨。随着农村能源问题的解决，秸杆不再作为主要燃料使用，被集中焚烧的现象日益突出，不仅污染环境，危害人们的身体健康，而且烟雾弥漫，影响陆地交通和飞行安全。秸杆的主要成分是纤维素(约含42% )、半纤维素(约含32% )和木质素(约8% )，并含有氮、磷、钾、钙、镁和有机质等。因此，合理的开发利用农作物秸杆显得尤为重要。
[0003]目前，针对秸杆无害化处理，使用秸杆腐熟剂利用微生物发酵代谢作用将秸杆中的纤维素、半纤维素、木质素等分解为葡萄糖等养分后再重新施回土壤是一项简单实用的方法。但是目前的秸杆腐熟剂存在着菌剂混配单一，功能性菌株偏少，腐熟温度低，腐熟效果不良好，周期长，很多要在地下降解几年才能彻底降解，影响下茬作物生长，没有很好的起到促进作物增产增收的良好效果的诸多情况。
[0004]另外，由于纤维素是葡萄糖脱水、通过β_1，4葡萄糖苷键连接而成的直链聚合体，纤维素分子间通过大量的氢键连接在一起形成晶体结构的纤维素束，纤维素束主要被半纤维素包围，其次是被木质素的环鞘包围，由此形成了天然复杂致密的结构。尽管许多微生物能分解单独存在的纤维素，但由于上述原因，利用微生物分解秸杆受到限制。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是为了解决现有技术中存在的技术问题，提供一种绿色环保，秸杆腐熟快速、彻底、高效，能彻底分解秸杆生物大分子，改善土壤质量，减少化肥施用量，同时及时补给接茬作物生长所需多种营养的酶-菌双联秸杆腐熟剂。
[0006]本发明的另一个目的是为了提供一种酶-菌双联秸杆腐熟剂的制备方法和使用方法。
[0007]为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案:一种酶-菌双联秸杆腐熟剂，由重量比为3-4:1的微生物复合菌剂和复合酶剂混合而成，所述微生物复合菌剂包括绿色木霉菌、黑曲霉、米曲霉、侧孢短芽孢杆菌和酵母融合菌，所述绿色木霉菌、黑曲霉、米曲霉、侧孢短芽孢杆菌和酵母融合菌的重量比为1-2:1-2:1-2:2-3:2-3，所述复合酶剂包括发酵里氏木霉产生的纤维素酶、发酵枯草芽孢杆菌产生的半纤维素酶、发酵糙皮侧耳菌产生的木质素酶，所述纤维素酶、半纤维素酶和木质素酶的重量比为1-2:1-2:1-2。
[0008]一种酶-菌双联秸杆腐熟剂的制备方法，该方法包括以下步骤:
Α、制备微生物复合菌剂
a、制备绿色木霉菌原粉:将绿色木霉菌孢子粉与面粉按照重量比1:500混匀后接种到培养基上，然后放入无菌发酵室内，温度控制在30°C，发酵时间为35-40小时，发酵完成后进行干燥，水分重量百分比含量控制在10%以下保存备用，制得绿色木霉菌原粉；
b、制备黑曲霉原粉:将黑曲霉孢子粉与面粉按照重量比1:500混匀后接种到培养基上，然后放入无菌发酵室内，温度控制在30°C，发酵时间为35-40小时，发酵完成后进行干燥，水分重量百分比含量控制在10%以下保存备用，制得黑曲霉原粉；
c、制备米曲霉原粉:将米曲霉孢子粉与面粉按照重量比1:500混匀后接种到培养基上，然后放入无菌发酵室内，温度控制在30°C，发酵时间为35-40小时，发酵完成后进行干燥，水分重量百分比含量控制在10%以下保存备用，制得米曲霉原粉；
d、制备侧孢短芽孢杆菌原粉:将侧孢短芽孢杆菌转接到事先准备好的试管斜面上，28-32°C培养18-24小时后再转入三角瓶培养18-24小时，检查确认无杂菌后用作发酵罐接种，发酵罐培养8小时后，开始取样镜检，当芽孢形成率达到90-95%时培养完成；将发酵液通过离心机进行浓缩，成为浓缩发酵液；将浓缩发酵液打入调配罐内，加入浓缩发酵液重量20-40%的轻质碳酸钙搅拌均匀，然后将其通过喷雾干燥塔进行干燥，保持喷出的侧孢短芽孢杆菌原粉的水分重量百分比含量在5-6% ;将喷雾干燥塔塔底和旋风口处的侧孢短芽孢杆菌原粉进行混合，混合均匀后密封保存备用；
e、制备酵母融合菌原粉:将酵母融合菌转接到事先准备好的试管斜面上，28-32Γ培养24-72小时后再转入三角瓶培养24-72小时，检查确认无杂菌后用作发酵罐接种，发酵罐培养24-72小时后，完成发酵；将发酵液通过离心机进行浓缩，成为浓缩发酵液；将浓缩发酵液打入调配罐内，加入浓缩发酵液重量20-40%的轻质碳酸钙搅拌均匀，然后将其通过喷雾干燥塔进行干燥，保持喷出的酵母融合菌原粉的水分重量百分比含量在5-6% ;将喷雾干燥塔塔底和旋风口处的酵母融合菌原粉进行混合，混合均匀后密封保存备用；
f、复合菌剂组配:将制得的绿色木霉菌原粉、黑曲霉原粉、米曲霉原粉、侧孢短芽孢杆菌原粉和酵母融合菌原粉按重量比1-2:1-2:1-2:2-3:2-3进行复合组配，各组份混合均匀得到复合菌剂；
B、制备复合酶剂
a、制备纤维素酶:
(1)种子的活化:将里氏木霉接种到PDA固体培养基上30°C下培养5-6天备用；
(2)液体种子培养:用孢子接种器在已活化的PDA固体培养基上挑取一环孢子接种于装有液体种子培养基的三角瓶中，于30°C，150r/min摇床上培养2d，作为液体种子；
(3)发酵罐发酵:将液体种子按5-10%的接种量接种于发酵培养基中，发酵罐的装液量为60-80%，于28°C培养，控制通气量为0.2-lvvm,转速为120_150r/mim，发酵液pH值大于4.0，加入消泡剂，待发酵液粘度明显降低时终止发酵，发酵结束后，发酵液经板框分离，得到发酵液，将发酵液经离心机3500r/min离心10_15min，取上清即为纤维素酶粗酶液；
(4)纤维素酶固体粉末:取纤维素酶粗酶液，向其中加入硫酸钠充分溶解，再经过雾化器雾化成细小的雾滴，然后在干燥塔内干燥，制得纤维素酶固体粉末；
b、制备半纤维素酶:
(1)种子的活化:将4°C冷藏的枯草芽孢杆菌接种到斜面培养基上，37°C恒温培养24h，进行菌种活化；
(2)液体种子培养:在已活化的斜面培养基上挑取一环菌体接种于装有液体种子培养基的三角瓶中，于37°C、120-150rmp震荡培养24h，即为种子液； (3)发酵罐发酵:将液体种子按10%的接种量接种于发酵罐，发酵罐的装液量为70%，pH为7.5，温度37°C，控制前期通气量为1:0.8，后期通气量为1: 1，加入消泡剂，培养48小时后收集发酵液，将发酵液经离心机3500r/min离心10_15min，取上清即为半纤维素酶粗酶液；
(4)半纤维素酶固体粉末:取半纤维素酶粗酶液，向其中加入硫酸钠充分溶解，再经过雾化器雾化成细小的雾滴，然后在干燥塔内干燥，制得半纤维素酶固体粉末；
c、制备木质素酶:
(1)种子的活化:将糙皮侧耳菌接种到PDA固体培养基上28°C下培养5-6天；
(2)液体种子培养:在已活化的PDA固体培养基上挑取一环孢子接种于装有液体种子培养基的三角瓶中，于30°C，150r/min摇床上培养2d，作为液体种子；
(3)通气罐发酵:将液体种子按10%的接种量接种于发酵培养基中，发酵罐的装液量为60%-80%，于28°C培养，控制通气量为0.2-lvvm，转速为120_150r/mim，发酵液pH值为4.0，加入消泡剂，待发酵液粘度明显降低时终止发酵，发酵结束后，发酵液经板框分离，得到发酵液，将发酵液经离心机3500r/min离心10_15min，取上清即为木质素酶粗酶液；
(4)木质素酶固体粉末:取木质素酶粗酶液，向其中加入硫酸钠充分溶解，再经过雾化器雾化成细小的雾滴，然后在干燥塔内干燥，制得木质素酶固体粉末；
d、复合酶剂组配:将上述纤维素酶固体粉末、半纤维素酶固体粉末、木质素酶固体粉末按重量比1-2:1-2:1-2进行混合，制成复合酶剂；
C、腐熟剂组配:将制得的微生物复合菌剂和复合酶剂按重量比3-4:1混合，制成酶-菌双联秸杆腐熟剂。
[0009]进一步地，所述步骤A中制备绿色木霉菌原粉、黑曲霉原粉和米曲霉原粉时的培养基制备方法为:将以下各原料按重量比混合均匀:麸皮66%、豆柏粉15%、玉米皮15%、硫酸镁0.3%、硫酸铵3.5%、磷酸二氢钾0.2%，加入混合物料重量30-40%的水搅拌均匀。
[0010]进一步地，所述步骤A中制备侧孢短芽孢杆菌原粉时的斜面培养基为:每升蒸馏水中加入牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、琼脂20g ;三角瓶培养基为:每升蒸馏水中加入牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g ;发酵罐培养基为:每升蒸馏水中加入玉米粉15g、黄豆饼粉
11.5g、玉米浆 10g、酵母膏 0.7g、K2HP04 lg、CaC03 0.5g。。
[0011]进一步地，所述步骤A中制备酵母融合菌原粉时的斜面培养基为:每升蒸馏水中加入酵母膏10g、蛋白胨20g、葡萄糖20g、琼脂20g ;三角瓶培养基为:每升蒸馏水中加入酵母膏10g、蛋白胨20g、葡萄糖20g ;发酵罐培养基为:发酵罐培养基为:每升蒸馏水中加入酵母粉 10g、蛋白胨 10g、葡萄糖 20g、KH2P04 lg、MgS04*7H20 0.5g、NaCl 5g，pH值 7.0~7.2。
[0012]进一步地，所述步骤Β中制备纤维素酶时PDA固体培养基的制备方法为:将200g马铃薯去皮切碎，煮沸30min，然后用双层纱布过滤，加入20g葡萄糖，加入琼脂15_20g，加水至 1000mL，121°C 灭菌；
液体种子培养基:每升蒸馏水中加入葡萄糖20g、蛋白胨lg、Mandels营养盐浓缩液100mL、Mandels微量元素浓缩液lmL、lmol/L柠檬酸缓冲液50mL，PH为5.5-6.0 ;其中:Mandels营养盐浓缩液为:每升蒸馏水中加入(NH4)2S04 14 g、尿素3 g、ΚΗ2Ρ04 20g、CaCl2.2H20 4 g、MgS04.7H20 3 g ;Mandels微量元素浓缩液为:每升蒸馈水中加入FeS04.7H20 5 g、ZnS04.7H20 1.4 g、CoCl2.6H20 3.7 g、MnS04.H20 1.6 g ； 发酵罐产酶培养基:每升蒸馏水中加入蛋白胨3g、酵母膏0.5g、(NH4) 2S04 2g、ΚΗ2Ρ044g、CaCl2.2Η20 0.3g、MgS04.7H20 0.3g、Tween- 80 0.2mL、微晶纤维素 20g、小麦麸皮 30g，121 °C灭菌20 min后使用。
[0013]进一步地，所述步骤B中制备半纤维素酶时斜面培养基:每升蒸馏水中加入牛肉膏 3g、蛋白陈 10g、NaCl 58、琼脂2(^，？!17.0-7.2，121°(:灭菌201^11 ；
液体种子培养基:每升蒸馏水中加入牛肉膏3g、蛋白陈10g、NaCl 5g，pH7.0_7.2，121°C 灭菌 20min ；
发酵培养基:每升蒸馈水中加入糖蜜10g、鱼粉10g、NaCl 2.