一种生物秸秆腐熟剂及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种生物秸秆腐熟剂及其制备方法，具体说，是一种以真菌、细菌为原料的生物秸秆腐熟剂及其生产方法。所述生物秸秆腐熟剂选用长柄木霉、土曲霉、黄孢平革菌、解淀粉类芽孢杆菌、白球拟酵母，作为复合菌种组配，主要产生纤维素分解酶、半纤维素分解酶、木质素分解酶，菌种之间，具有良好的共生、互生作用，没有拮抗作用。使用时，待作物秸秆(小麦、玉米、水稻)粉碎散于地面后，将腐熟剂均匀撒于田间，1hm2用量30kg，然后秸秆和腐熟剂一同翻入地下。
【专利说明】一种生物秸秆腐熟剂及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种有机物料腐熟剂，具体说，是一种以真菌、细菌为原料的生物秸杆腐熟剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002]农业生产中会产生大量农作物秸杆，这些秸杆以玉米、小麦、水稻、棉花等大田作物秸杆为主。上世纪80年代以前，秸杆通常被农民运回家作为生活燃料，或是被用于造纸，田间不会有大量秸杆存在。近年，由于生活水平的提高，农民的生活能源逐渐被电力、天然气和液化石油气所取代，农民不再需要把秸杆运回家作为生活燃料。大量存在于田间的作物秸杆反而成为农民生产生活中的负担。很多农民为节约人力物力直接在田间把作物秸杆进行焚烧，产生大量浓烟，造成大量的环境污染，污染空气，影响附近的机场航班起降、公路尤其是高速公路的正常交通。
[0003]一直以来，国家注重节约与环保，制定各项惠农政策，鼓励群众实施秸杆就地还田，增肥地力。但秸杆就地还田后，由于其自然腐熟慢，影响下一茬作物的播种、生长。所以，群众意愿不高，因此，急需一种促进秸杆加速分解的产品来解决上述问题。
[0004]各类农作物秸杆虽然存在一定差异，但其主要成分都是由纤维素(多糖类大分子物质)、半纤维素和木质素(高分子芳香族化合物)组成，简称为“三素”，“三素”的特点是分子量大(几万至千万)、结构紧密有序(有晶体和非晶体区)、抗分解力强(非常稳定)，又因多数作物秸杆的表面还存在大量蜡质层，更增加了秸杆的分解难度。可见，要使秸杆腐解的确是一件不易之事。需要能够产纤维素酶、半纤维素酶、木质素酶的多种微生物共同参与，进行逐步有序的接力分解过程，才能完成秸杆“三素”的腐解。
[0005]微生物是产生“三素酶”的主要来源，在秸杆腐熟降解过程中发挥巨大的作用。秸杆腐熟的原理就是利用微生物产生的酶来加快分解秸杆中的纤维素、半纤维素、木质素，使其转化为小分子有机物，进而转化成能使作物吸收利用的养分，归还土壤之中，实现土壤养分提升。
[0006]秸杆腐熟剂是筛选出能分解纤维素、半纤维素、木质素的微生物菌株，通过微生物复合技术处理工艺，将这些菌株有效的组合在一起，而形成产品。应用秸杆腐熟剂加速秸杆快速腐解，是实现秸杆直接还田不可或缺的有效措施。
[0007]目前，对于秸杆腐熟剂的研究正在兴起，市场上销售的秸杆腐熟剂和部分已申请的秸杆腐熟剂发明专利因不同原因，不同程度存在着不少欠缺，如:
[0008]1、现在生产的大多数秸杆腐熟剂都是针对畜禽粪便、农家肥、秸杆或是其中两种或三种混合物料在堆置条件下加快其分解而研制的产品，这些腐熟剂产品一是含菌量低、酶活数量少，二是厌氧菌发挥作用大。而就地还田多是秸杆是在有氧条件下进行分解。所以这些腐熟剂用在秸杆直接还田的腐熟，达不到实际生产所需要的标准。
[0009]2、部分产品菌种单一。很多产品为降低成本，只考虑菌株的生产制造成本和生产工艺的简单可操作性，这种情况最常见的是单一使用某一种菌种，如:单一使用枯草芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌是一种细菌，是目前生产工艺最熟练，价格最低，使用最多的可以分解纤维素和木质素的常用菌。但单一使用这种细菌，受外界温度、湿度等条件的影响的作用较大，菌的活性极易降低，造成秸杆分解速度减缓，腐熟效果不理想。
[0010]3、有的产品虽然几个菌种配合，但细菌在其中占的比例较多，真菌相对较少。主要是因为真菌的制造和保存工艺较为复杂，而对于秸杆的有机成分来说，真正起分解作用的主要是真菌类。真菌含量少，会造成秸杆粉碎还田后腐熟的效果差。[0011]4、有的虽然真菌、细菌、放线菌、酵母菌配合，但并没有考虑到各个菌种之间存在的抑制、共生、互生等影响。由于分解秸杆的“三素酶”是多酶体系，酶组分之间存在着明显的协同作用，多菌株的配合、补充、才能促进物质分解，虽然多菌种联合效应高于一个单一菌种，但必须指出的是:多个菌种的作用并不是多个菌种简单效应的算术加和，所以，应该注意各个菌种之间相互的抑制作用的强弱。细菌和真菌之间具有比较强的相互作用，部分放线菌本身就有杀灭真菌和细菌的功能，放到组分中，只能降低组合的分解速度。
【发明内容】
[0012]本发明的目的是，为解决现有秸杆腐熟菌剂技术的不足，而提供一种快速促进农作物秸杆粉碎后还田的生物腐熟剂及制备方法。
[0013]为了解决上述问题，本发明采用的技术方案是:一种生物秸杆腐熟剂，以长柄木霉、土曲霉、黄孢平革菌、解淀粉类芽孢杆菌和白球拟酵母作为复合菌种组配，使腐熟剂的有效活菌数:长柄木霉2~10亿个/g、土曲霉2~10亿个/g、黄孢平革菌2~10亿个/g、解淀粉类芽孢杆菌2~10亿个/g、白球拟酵母2~10亿个/g。
[0014]上述的生物秸杆腐熟剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤:
[0015](I)制备长柄木霉发酵物、土曲霉发酵物、黄孢平革菌发酵物、解淀粉类芽孢杆菌液、白球拟酵母菌液；其中:长柄木霉、土曲霉、黄孢平革菌，先进行液体发酵，再进行固体发酵；解淀粉类芽孢杆菌、白球拟酵母只进行液体发酵；
[0016]所述液体发酵过程:菌种斜面一三角瓶培养一种子罐培养一发酵罐培养；
[0017]所述固体发酵过程:清洁发酵室一备料一投料混合一保温培养；
[0018](2)按比混合:根据混合罐的容积，以麦麸为载体,加入步骤(1)制备的长柄木霉发酵物，土曲霉发酵物，黄孢平革菌发酵物，解淀粉类芽孢杆菌液，白球拟酵母菌液，加入蒸馏水，混合后搅拌，使腐熟剂的有效活菌数:长柄木霉2~10亿个/g、土曲霉2~10亿个/g、黄孢平革菌2~10亿个/g、解淀粉类芽孢杆菌2~10亿个/g、白球拟酵母2~10亿个/g ;
[0019](3)链条粉碎，分级过筛，机械包装，成品入库。
[0020]具体说明如下:
[0021]所述制备长柄木霉发酵物:长柄木霉一菌种斜面一三角瓶培养一种子罐培养一发酵罐培养一清洁发酵室一备料一投料混合一保温培养，具体地步骤如下:
[0022]I)菌种斜面
[0023]将冻干的长柄木霉菌种在无菌环境中转接到事先准备好的试管斜面上，将温度控制在28~30°C，培养36~40h ；
[0024]2)三角瓶培养[0025]培养基制备:将琼脂加热溶化后，用0.lmol/L氢氧化钠或0.lmol/L盐酸调pH值5.0~5.2，然后分装三角瓶，置于灭菌锅内，在0.1 IMPa压力下灭菌30min，冷却后制成斜面备用;
[0026]菌种活化和扩大培养:在无菌条件下从原菌菌种斜面上挑选少许菌苔,置放三角瓶斜面内进行“之”字画线，然后置于25~26°C温箱内培养24h，经检查无杂菌，菌体生长整齐，再置于28~30°C温箱内培养48~72h，肉眼观察，菌苔丰满，涂片，染色检查无杂菌，分生孢子大小一致的，放置于冰箱中存放备用；
[0027]3)种子罐培养
[0028]培养基配方:玉米粉食品级，120目，1.0%;淀粉食品级，120目，2.0%;中温豆柏粉食品级，120目，2.0%;鱼粉食品级，120目，0.6%;玉米浆生物级，120目，0.5%;玉米秸杆饲料级120目，3.0%;硫酸亚铁分析级，0.1%;硫酸锰分析级，0.1%;磷酸二氢钾分析级，0.1%；硫酸镁分析级，0.05%;硫酸铜分析级，0.05%;硫酸铵分析级，0.05%;泡敌食品级，0.05%;pH值5.0~5.2，所述百分比为质量体积百分比，溶剂为蒸馏水；
[0029]空种子罐灭菌:发酵罐在应用前清洗干净，排除污物，并在0.1lMPa压力下灭菌30min ；
[0030]种子罐装料:参照培养基配方按比例装料，投料量不得超过罐容积的70% ；
[0031]种子罐灭菌:装好料后，在0.1lMPa压力下，温度达到121°C，灭菌30min，冷却至25°C即可接种；
[0032]种子罐接种:在无菌条件下将每个三角瓶斜面菌种加100ml无菌水，把菌苔刮下制成孢子悬浮液，含菌量为IOX 150CFU/ml，将制备好的孢子悬浮液，在无菌条件下接种后，按质量比1%的比例接种于冷却至25°C的种子罐内进行培养；
[0033]种子罐培养条件控制:接种后在温度为25~26°C，压力在0.05MPa，通气量1: 0.8和搅拌速度120r/min条件下，培养18~24h，所述通气量为每min进出空气体积比V/V/min ；
[0034]种子罐培养条件检测:接种后4h开始，每隔2h取样一次检测，检测内容包括菌体生长情况，含菌量，PH值，达到指标即可移到发酵罐内发酵；
[0035]合格指标:菌体生长整齐，菌丝成簇或多数为菌丝团；
[0036]4)发酵罐培养
[0037]发酵罐空消:发酵罐在接种前严格灭菌处理，洗净后在0.1lMPa压力下灭菌30min ；
[0038]发酵罐投料:配比同种子发酵液，投料量不超过罐容积的70% ；
[0039]发酵罐灭菌实消:装好料后，在0.1lMPa压力下，温度达到121°C，灭菌30min，冷却至25°C即可接种； [0040]发酵罐培养:搅拌速度100~120r/min，罐压0.05MPa,移种4h内通气量为1:0.4~0.5，以后逐渐增大至1:0.8。一般发酵周期为72~96h，在厚垣孢子大量形成时，符合放罐指标，即可放罐；所述通气量为每min进出空气体积比V/V/min ；
[0041]发酵罐检测:投料后6h开始，每隔4h取样一次检测，至48h后，间隔期缩短为2h ；
[0042]放罐标准:厚垣孢子含量≥4X150CFU/ml;杂菌量≥0.3% ；
[0043]5)清洁发酵室[0044]将发酵室地面及空间清理干净，拌料场内拌料机、链条、皮带输送机清洗干净，晾干；拌料场周围打扫干净，工器具清洗晾干；将场地、设备用漂白粉上清剂喷洒消毒，静置30min ；
[0045]6)备料
[0046]将种液运入拌料场，按质量比麦麸:种液=10:3的比例运入麦麸；
[0047]7)投料混合
[0048]根据拌料机的生产能力，按照生产工艺要求和配料比，把菌种和麦麸加入到拌料机，搅拌5min ;把混匀的原料放于皮带传送机,进入同时开启的链条粉碎机粉碎；粉碎均匀的湿料经皮带传送机进入装袋程序，扎口 ；
[0049]8)保温培养
[0050]预先将发酵室及地面温度保持在25°C以上，料袋单排码放，平躺于地面，隔4h，倒垛，料袋揉搓，保证发酵均匀。
[0051]所述制备土曲霉发酵物:土曲霉一菌种斜面一三角瓶培养一种子罐培养一发酵罐培养一清洁发酵室一备料一投料混合一保温培养，具体地步骤如下:
[0052]I)菌种斜面
[0053]将冻干的土霉菌种在无菌环境中转接到事先准备好的试管斜面上，将温度控制在28 ~30°C，培养 36 ~40h ；
[0054]2)三角瓶培养
[0055]培养基制备:去皮的马铃薯200g，切成小块，加水1000ml煮沸30min滤去马铃薯块，将滤液补足至1000ml，加`葡萄糖20g，溶化后分装三角瓶，置于灭菌锅内，在0.1IMPa压力下灭菌30min,冷却后制成斜面备用；
[0056]菌种活化和扩大培养:在无菌条件下从原菌菌种斜面上挑选少许菌苔,置放三角瓶斜面内进行“之”字画线，然后置于25~26°C温箱内培养24h，经检查无杂菌，菌体生长整齐，再置于26~28 °C温箱内培养48~72h，肉眼观察，菌苔丰满，涂片，染色检查无杂菌，分生孢子大小一致的，放置于冰箱中存放备用；
[0057]3)种子罐培养:
[0058]培养基配方:蔗糖2%，地瓜汁2%，蛋白胨2%，硫酸铵0.6%，磷酸二氢钾0.3%，硫酸镁0.3%，pH值5.0~5.2 ;所述百分比为质量体积百分比，溶剂为蒸馏水；
[0059]空种子罐灭菌:发酵罐在应用前清洗干净，排除污物，并在0.1lMPa压力下灭菌30min ；
[0060]种子罐装料:参照培养基配方按比例装料，投料量不得超过罐容积的70% ；
[0061]种子罐灭菌:装好料后，在0.1lMPa压力下，温度达到121°C，灭菌30min，冷却至25°C即可接种；
[0062]种子罐接种:在无菌条件下将每个三角瓶斜面菌种加100ml无菌水，把菌苔刮下制成孢子悬浮液，含菌量为10X150CFU/ml ;将制备好的孢子悬浮液，在无菌条件下接种后，按质量比1%的比例接种于冷却至25°C的种子罐内进行培养；
[0063]种子罐培养条件控制:接种后在温度为25~26°C，压力在0.05MPa，通气量1: 0.8和搅拌速度120r/min条件下，培养18~24h，所述通气量为每min进出空气体积比V/V/min ；[0064]种子罐培养条件检测:接种后4h开始，每隔2h取样一次检测，检测内容包括菌体生长情况，含菌量，PH值，达到指标即可移到发酵罐内发酵；
[0065]合格指标:菌体生长整齐，菌丝成簇或多数为菌丝团；
[0066]4)发酵罐培养
[0067]发酵罐空消:发酵罐在接种前严格灭菌处理，洗净后在0.1lMPa压力下灭菌30min ；
[0068]发酵罐投料:配比同种子发酵液，投料量不超过罐容积的70% ；
[0069]发酵罐灭菌:装好料后，在0.1lMPa压力下，温度达到121°C，灭菌30min，冷却至25°C即可接种；
[0070]发酵罐培养:搅拌速度100~120r/min，罐压0.05MPa,移种4h内通气量为1: (0.4~0.5);以后逐渐增大至1: 0.8，一般发酵周期为72~96h，在厚垣孢子大量形成时，符合放罐指标，即可放罐；所述通气量为每min进出空气体积比V/V/min ；
[0071]发酵罐检测:投料后6h开始，每隔4h取样一次检测，至48h后，间隔期缩短为2h ；
[0072]放罐标准:厚垣孢子含量≥4X150CFU/ml;杂菌量≤0.3% ；
[0073]5)清洁发酵室
[0074]将发酵室地面及空间清理干净，拌料场内拌料机、链条、皮带输送机清洗干净，晾干；拌料场周围打扫干净，工器具清洗晾干；将场地、设备用漂白粉上清剂喷洒消毒，静置30min ；
[0075]6)备料
[0076]将种液运入拌料场，按麦麸:种液=10:3的比例运入麦麸；
[0077]7)投料混合
[0078]根据拌料机的生产能力，按照生产工艺要求和配料比，把菌种和麦麸加入到拌料机，搅拌5min ;把混匀的原料放于皮带传送机,进入同时开户的链条粉碎机粉碎,粉碎均匀的湿料经皮带传送机进入装袋程序，扎口 ；
[0079]8)保温培养
[0080]预先将发酵室及地面温度保持在25°C以上；将料袋单排码放，平躺于地面，隔4h，倒垛，料袋揉搓，保证发酵均匀。
[0081]所述制备黄孢平革菌发酵物:黄孢平革菌一菌种斜面一三角瓶培养一种子罐培养一发酵罐培养一清洁发酵室一备料一投料混合一保温培养，具体地步骤如下:
[0082]I)菌种斜面
[0083]将冻干的黄孢平革菌菌种在无菌环境中转接到事先准备好的试管斜面上，将温度控制在28~30°C，培养36~40h ；
[0084]2)三角瓶培养
[0085]培养基:去皮的马铃薯200g，切成小块，加水1000ml煮沸30min滤去马铃薯块，将滤液补足至1000ml，加葡萄糖20g，溶化后分装三角瓶，置于灭菌锅内，在0.1 IMPa压力下灭菌30min,冷却后制成斜面备用；
[0086]菌种活化和扩大培养:在无菌条件下从原菌菌种斜面上挑选少许菌苔,置放三角瓶斜面内进行“之”字画线，然后置于25~26°C温箱内培养24h，经检查无杂菌，菌体生长整齐，再置于27~28 °C温箱内培养48~72h，肉眼观察，菌苔丰满，涂片，染色检查无杂菌，分生孢子大小一致的，放置于冰箱中存放备用；
[0087]3)种子罐培养:
[0088]培养基配方:葡萄糖1%，磷酸二氢钾0.2%，酒石酸铵0.02%,氯化钙0.001%,硫酸镁0.025%,维生素B10.0001%,七水硫酸铜0.008%,七水硫酸锌0.004%, pH值5.0~5.2 ;所述百分比为质量体积百分比，溶剂为蒸馏水；
[0089]空种子罐灭菌:发酵罐在应用前清洗干净，排除污物，并在0.1lMPa压力下灭菌30min ；
[0090]种子罐装料:参照培养基配方按比例装料，投料量不得超过罐容积的70% ；
[0091]种子罐灭菌:装好料后，在0.1lMPa压力下，温度达到121°C，灭菌30min，冷却至25°C即可接种；
[0092]种子罐接种:在无菌条件下将每个三角瓶斜面菌种加100ml无菌水，把菌苔刮下制成孢子悬浮液，含菌量为IOX 150CFU/ml，将制备好的孢子悬浮液，在无菌条件下接种后，按质量比1%的比例接种于冷却至25°C的种子罐内进行培养；
[0093]种子罐培养条件控制:接种后在温度为25~26°C，压力在0.05MPa，通气量1: 0.8和搅拌速度120r/min条件下，培养18~24h，所述通气量为每min进出空气体积比V/V/min ；
[0094]种子罐培养条件检测:接种后4h开始，每隔2h取样一次检测，检测内容包括菌体生长情况，含菌量，PH值，达到指标即可移到发酵罐内发酵；
[0095]合格指标:菌 体生 长整齐，菌丝成簇或多数为菌丝团；
[0096]4)发酵罐培养
[0097]发酵罐空消:发酵罐在接种前严格灭菌处理，洗净后在0.1lMPa压力下灭菌30min ；
[0098]发酵罐投料:配比同种子发酵液。投料量不超过罐容积的70% ；
[0099]发酵罐灭菌:装好料后，在0.1lMPa压力下，温度达到121°C，灭菌30min，冷却至25°C即可接种；
[0100]发酵罐培养:搅拌速度100~120r/min，罐压0.05MPa,移种4h内通气量为1: (0.4~0.5)，以后逐渐增大至1: 0.8，一般发酵周期为72~96h，在厚垣孢子大量形成时，符合放罐指标，即可放罐；所述通气量为每min进出空气体积比V/V/min ；
[0101]发酵罐检测:投料后6h开始，每隔4h取样一次检测，至48h后，间隔期缩短为2h ；
[0102]放罐标准:厚垣孢子含量≤4X150CFU/ml;杂菌量≤0.3% ；
[0103]5)清洁发酵室
[0104]将发酵室地面及空间清理干净，拌料场内拌料机、链条、皮带输送机清洗干净，晾干；拌料场周围打扫干净，工器具清洗晾干；将场地、设备用漂白粉上清剂喷洒消毒，静置30min ；
[0105]6)备料
[0106]将种液运入拌料场，按麦麸:种液=10:3的比例运入麦麸；
[0107]7)投料混合
[0108]根据拌料机的生产能 力，按照生产工艺要求和配料比，把菌种和麦麸加入到拌料机，搅拌5min ;把混匀的原料放于皮带传送机,进入同时开户的链条粉碎机粉碎,粉碎均匀的湿料经皮带传送机进入装袋程序，扎口 ；
[0109]8)保温培养
[0110]预先将发酵室及地面温度保持在25°C以上；将料袋平躺于地面，单排码放；隔4h，倒垛，料袋揉搓，保证发酵均匀。
[0111]所述制备解淀粉类芽孢杆菌液:解淀粉类芽孢杆菌一菌种斜面一三角瓶培养一种子罐培养一发酵罐培养，具体地步骤如下:
[0112]I)菌种斜面
[0113]将冻干的解淀粉类芽孢杆菌菌种在无菌环境中转接到事先准备好的试管斜面上，将温度控制在28~30°C，培养36~40h ；
[0114]2)三角瓶培养
[0115]培养基制备:LB培养基，酵母膏5g;琼脂2%;NACL10g;蛋白胨IOg;蒸馏水1000ml ；PH7.0 ;分装三角瓶，置于灭菌锅内，在0.1lMPa压力下灭菌30min，冷却后制成斜面备用；
[0116]菌种活化和扩大培养:在无菌条件下从原菌菌种斜面上挑选少许菌苔,置放三角瓶斜面内进行“之”字画线，然后置于20°C温箱内培养24h，经检查无杂菌，菌体生长整齐，再置于20°C温箱内培养48~72h，肉眼观察，菌苔丰满，涂片，染色检查无杂菌，分生孢子大小一致的，放置于冰箱中存放备用；
[0117]3)种子罐培养
[0118]培养基配方:花生饼粉0.5%，鱼粉0.3%，玉米浆0.5%，葡萄糖0.3%，泡敌0.3% ;所述百分比为质量体积百分比，溶剂为`蒸馏水；
[0119]空种子罐灭菌:发酵罐在应用前清洗干净，排除污物，并在0.1lMPa压力下灭菌30min ；
[0120]种子罐装料:参照培养基配方按比例装料，投料量不得超过罐容积的70% ；
[0121]种子罐灭菌:装好料后，在0.1lMPa压力下，温度达到121°C，灭菌30min，冷却至30°C即可接种；
[0122]种子罐接种:在无菌条件下将每个三角瓶斜面菌种加100ml无菌水，把菌苔刮下制成孢子悬浮液，含菌量为10X150CFU/ml ;并在80°C恒温水浴中处理30min ;将制备好的孢子悬浮液，在无菌条件下接种后，按质量比1%的比例接种于冷却至30°C的种子罐内进行
培养；
[0123]种子罐培养条件控制:接种后在温度为28~301:，压力在0.0510^，通气量1:1和搅拌速度220r/min条件下，培养8~IOh,所述通气量为每min进出空气体积比V/V/min ；
[0124]种子罐培养条件检测:接种后4h开始，每隔2h取样一次检测，检测内容包括菌体生长情况，含菌量，PH值，达到指标即可移到发酵罐内发酵；
[0125]合格指标:菌体生长整齐，处于对数生长期，含菌量2X 150CFU/ml，无杂菌污染；
[0126]4)发酵罐培养
[0127]发酵罐空消:发酵罐在接种前严格灭菌处理，洗净后在0.1lMPa压力下灭菌30min ；
[0128]发酵罐投料:花生饼粉2.0%，鱼粉0.3%，玉米浆1.8%，糊精0.5%，硫酸镁0.075%,碳酸钙0.5%，磷酸二氢钾0.04%，泡敌0.05%, pH值7.0~7.5，所述百分比为质量体积百分t匕，溶剂为蒸馏水；投料量不超过罐容积的70% ；[0129]发酵罐灭菌:装好料后，在0.1lMPa压力下，温度达到121°C，灭菌30min，冷却至30°C即可接种；
[0130]发酵罐培养:搅拌速度180~200r/min，罐压0.05MPa,移种4h内通气量为1: (0.7~0.8);以后逐渐增大至1:1 ;一般发酵周期为18~24h，在芽孢大量形成、个别芽孢大量脱落时，符合放罐指标，即可放罐；所述通气量为每min进出空气体积比V/V/min ；
[0131]发酵罐检测:投料后4h开始，每隔2h取样一次检测，至18h后，间隔期缩短为Ih ；
[0132]放罐标准:芽孢含量≥70% ;含菌量≥50X150CFU/ml;杂菌量≥0.3%。
[0133]所述制备白球拟酵母菌液:白球拟酵母一菌种斜面一三角瓶培养一种子罐培养—发酵罐培养，具体地步骤如下:
[0134]I)菌种斜面
[0135]将冻干的白球拟酵母菌种在无菌环境中转接到事先准备好的试管斜面上，将温度控制在28~30°C，培养36~40h ；
[0136]2)三角瓶培养
[0137]培养基制备:12波美度麦芽技100ml，琼脂2.0%:将琼脂加热溶化后，用0.lmol/1氢氧化钠或0.l%mol/l盐酸调pH值5.0~6.0 ;然后分装三角瓶，置于灭菌锅内，在0.1lMPa压力下灭菌30min,冷却后制成斜面备用；
[0138]菌种活化和扩大培养:在无菌条件下从原菌菌种斜面上挑选少许菌苔,置放三角瓶斜面内进行“之”字画线，然后置于26~28°C温箱内培养24h，经检查无杂菌，菌体生长整齐，再置于26~28 °C温箱内培养24~28h，肉眼观察，菌苔丰满，涂片，染色检查无杂菌，菌体大小一致的，放置于冰箱中存放备用；
[0139]3)种子罐培养
[0140]培养基配方:葡萄糖食品级，5.0% ;蛋白胨生物级，0.5% ;酵母膏生物级0.5% ;硫酸镁化学级，0.1% ;磷酸二氢钾化学级，0.1% ;消泡剂生物级，0.05%，pH6.0~6.5 ;所述百分比为质量体积百分比，溶剂为蒸馏水；
[0141]空种子罐灭菌:发酵罐在应用前清洗干净，排除污物，并在0.1lMPa压力下灭菌30min ；
[0142]种子罐装料:参照培养基配方按比例装料，投料量不得超过罐容积的70% ；
[0143]种子罐灭菌:装好料后，在0.1lMPa压力下，温度达到121°C，灭菌30min，冷却至30°C即可接种；
[0144]种子罐接种:在无菌条件下将每个三角瓶斜面菌种加100ml无菌水，把菌苔刮下制成孢子悬浮液，含菌量为10X150CFU/m ;将制备好的孢子悬浮液，在无菌条件下接种后，按质量比1%的比例接种于冷却至30°C的种子罐内进行培养；
[0145]种子罐培养条件控制:接种后在温度为26~28°C，压力在0.05MPa，通气量1: 0.6和搅拌速度220r/min条件下，培养8~10h，所述通气量为每min进出空气体积比V/V/min ；
[0146]种子罐培养条件检测:接种后4h开始，每隔2h取样一次检测，检测内容包括菌体生长情况，含菌量，PH值，达到指标即可移到发酵罐内发酵；
[0147]合格指标:菌体生长整齐，出芽率≥30%，含菌量2X 150CFU/ml，无杂菌污染；
[0148]4)发酵罐培养[0149]发酵罐空消:发酵罐在接种前严格灭菌处理，洗净后在0.1lMPa压力下灭菌30min ；
[0150]发酵罐投料:葡萄糖食品级，5.0% ;蛋白胨生物级，0.5% ;酵母膏生物级0.5% ;硫酸镁化学级，0.1% ;磷酸二氢钾化学级，0.1% ;消泡剂生物级，0.05%，pH6.0~6.5，所述百分比为质量体积百分比，溶剂为蒸馏水；投料量不超过罐容积的70% ；
[0151]发酵罐灭菌:装好料后，在0.1lMPa压力下，温度达到121°C，灭菌30min，冷却至30°C即可接种；
[0152]发酵罐培养:搅拌速度180~200r/min，罐压0.05MPa,移种4h内通气量为1: (0.4~0.5);以后逐渐增大至1: 0.6，一般发酵周期为18~24h，检验结果符合放罐指标，即可放罐；所述通气量为每min进出空气体积比V/V/min ；
[0153]发酵罐检测:投料后4h开始，每隔2h取样一次检测，至12h后，间隔期缩短为Ih ；
[0154]放罐标准:芽孢含量≥70% ;含菌量≥10X150CFU/ml;杂菌量≤0.3%。
[0155]发明具有如下积极效果:
[0156]1、本发明最后筛选出产“三素酶”(纤维素酶、半纤维素酶、木质素酶)能力较强的长柄木霉、土曲霉、黄孢平革菌、解淀粉类芽孢杆菌、白球拟酵母微生物菌种，通过试验发现这些菌种之间，具有良好的共生、互生作用，没有拮抗作用，从而最终确定将:“长柄木霉、土曲霉、黄孢平革菌、解淀粉类芽孢杆菌、白球拟酵母”作为生物秸杆腐熟剂的复合组配。
[0157]2、本发明的生物秸杆腐熟剂主要技术指标均同于或优于国标:
[0158]本发明的生物秸杆腐熟剂严格按照GB20287 — 2006《农用微生物菌剂》生产，主要指标均优于国标要求，(具体指标详见产品质量检测报告)，酶活等参数的测定方法按照NY/T2321-2013《微生物肥料产品检测规程》。
[0159]
【权利要求】
1. 一种生物秸杆腐熟剂，其特征在于，以长柄木霉、土曲霉、黄孢平革菌、解淀粉类芽孢杆菌和白球拟酵母作为复合菌种组配，使腐熟剂的有效活菌数:长柄木霉2~10亿个/g、土曲霉2~10亿个/g、黄孢平革菌2~10亿个/g、解淀粉类芽孢杆菌2~10亿个/g、白球拟酵母2~10亿个/g。
2.一种如权利要求1所述的生物秸杆腐熟剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)制备长柄木霉发酵物、土曲霉发酵物、黄孢平革菌发酵物、解淀粉类芽孢杆菌菌液、白球拟酵母菌液；其中:长柄木霉、土曲霉、黄孢平革菌，先进行液体发酵，再进行固体发酵；解淀粉类芽孢杆菌、白球拟酵母只进行液体发酵； 所述液体发酵过程:菌种斜面一三角瓶培养一种子罐培养一发酵罐培养； 所述固体发酵过程:清洁发酵室一备料一投料混合一保温培养； (2)按比混合:根据混合罐的容积，以麦麸为载体,加入步骤(1)制备的长柄木霉发酵物，土曲霉发酵物，黄孢平革菌发酵物，解淀粉类芽孢杆菌菌液，白球拟酵母菌液，加入蒸馏水，混合后搅拌，使腐熟剂的有效活菌数:长柄木霉2~10亿个/g、土曲霉2~10亿个/g、黄孢平革菌2~10亿个/g、解淀粉类芽孢杆菌2~10亿个/g、白球拟酵母2~10亿个/g ; (3 )链条粉碎，分级过筛，机械包装，成品入库。
3.根据权利要求2所述的生物秸杆腐熟剂的制备方法，其特征在于， 所述制备长柄木霉发酵物:长柄木霉一菌种斜面一三角瓶培养一种子罐培养一发酵罐培养一清洁发酵室一备料一投料混合一保温培养，具体地步骤如下: 1)菌种斜面 将冻干的长柄木霉菌种在无菌环境中转接到事先准备好的试管斜面上，将温度控制在.28 ~30°C，培养 36 ~40h ； 2)三角瓶培养 培养基制备:将琼脂加热溶化后，用0.lmol/L氢氧化钠或0.lmol/L盐酸调pH值5.0~.5.2，然后分装三角瓶，置于灭菌锅内，在0.1lMPa压力下灭菌30min，冷却后制成斜面备用； 菌种活化和扩大培养:在无菌条件下从原菌菌种斜面上挑选少许菌苔，置放三角瓶斜面内进行“之”字画线，然后置于25~26°C温箱内培养24h，经检查无杂菌，菌体生长整齐，再置于28~30°C温箱内培养48~72h，肉眼观察，菌苔丰满，涂片，染色检查无杂菌，分生孢子大小一致的，放置于冰箱中存放备用； 3)种子罐培养 培养基配方:玉米粉食品级，120目，1.0%;淀粉食品级，120目，2.0%;中温豆柏粉食品级，120目，2.0%;鱼粉食品级，120目，0.6%;玉米浆生物级，120目，0.5%;玉米秸杆饲料级.120目，3.0%;硫酸亚铁分析级，0.1%;硫酸锰分析级，0.1%;磷酸二氢钾分析级，0.1%；硫酸镁分析级，0.05%;硫酸铜分析级，0.05%;硫酸铵分析级，0.05%;泡敌食品级，0.05%;pH值.5.0~5.2，所述百分比为质量体积百分比，溶剂为蒸馏水； 空种子罐灭菌:发酵罐在应用前清洗干净，排除污物，并在0.1lMPa压力下灭菌.30min ； 种子罐装料:参照培养基配方按比例装料，投料量不得超过罐容积的70% ； 种子罐灭菌:装好料后，在0.1lMPa压力下，温度达到121°C，灭菌30min，冷却至25°C即可接种； 种子罐接种:在无菌条件下将每个三角瓶斜面菌种加100ml无菌水，把菌苔刮下制成孢子悬浮液，含菌量为10 X 150CFU/ml，将制备好的孢子悬浮液，在无菌条件下接种后，按质量比1%的比例接种于冷却至25°C的种子罐内进行培养； 种子罐培养条件控制:接种后在温度为25~26°C，压力在0.05MPa,通气量1: 0.8和搅拌速度120r/min条件下，培养18~24h,所述通气量为每min进出空气体积比V/V/min ；种子罐培养条件检测:接种后4h开始，每隔2h取样一次检测，检测内容包括菌体生长情况，含菌量，PH值，达到指标即可移到发酵罐内发酵； 合格指标:菌体生长整齐，菌丝成簇或多数为菌丝团； .4)发酵罐培养 发酵罐空消:发酵罐在接种前严格灭菌处理，洗净后在0.1lMPa压力下灭菌30min ； 发酵罐投料:配比同种子发酵液，投料量不超过罐容积的70% ； 发酵罐灭菌实消:装好料后，在0.1lMPa压力下，温度达到121°C，灭菌30min，冷却至.25°C即可接种； 发酵罐培养:搅拌速度100~120r/min，罐压0.05MPa，移种4h内通气量为1:0.4~.0.5，以后逐渐增大至1:0.8。一般发酵周期为72~96h，在厚垣孢子大量形成时，符合放罐指标，即可放罐；所述通气量为每min进出空气体积比V/V/min ； 发酵罐检测:投料后6h开始，每隔4h取样一次检测，至48h后，间隔期缩短为2h ； 放罐标准:厚垣孢子含量≥4X150CFU/ml;杂菌量≤0.3% ；.5)清洁发酵室 将发酵室地面及空间清理干净，拌料场内拌料机、链条、皮带输送机清洗干净，晾干；拌料场周围打扫干净，工器具清洗晾干；将场地、设备用漂白粉上清剂喷洒消毒，静置30min ； . 6)备料 将种液运入拌料场，按质量比麦麸:种液=10:3的比例运入麦麸； .7)投料混合 根据拌料机的生产能力，按照生产工艺要求和配料比,把菌种和麦麸加入到拌料机,搅拌5min ;把混匀的原料放于皮带传送机,进入同时开启的链条粉碎机粉碎；粉碎均匀的湿料经皮带传送机进入装袋程序，扎口 ； .8)保温培养 预先将发酵室及地面温度保持在25°C以上，料袋单排码放，平躺于地面，隔4h，倒垛，料袋揉搓，保证发酵均匀。
4.根据权利要求2所述的生物秸杆腐熟剂的制备方法，其特征在于， 所述制备土曲霉发酵物:土曲霉一菌种斜面一三角瓶培养一种子罐培养一发酵罐培养—清洁发酵室一备料一投料混合一保温培养，具体地步骤如下: .1)菌种斜面 将冻干的土霉菌种在无菌环境中转接到事先准备好的试管斜面上，将温度控制在.28 ~30°C，培养 36 ~40h ； .2)三角瓶培养 培养基制备:去皮的马铃薯200g，切成小块，加水1000ml煮沸30min滤去马铃薯块，将滤液补足至1000ml，加葡萄糖20g，溶化后分装三角瓶，置于灭菌锅内，在0.1 IMPa压力下灭菌30min,冷却后制成斜面备用； 菌种活化和扩大培养:在无菌条件下从原菌菌种斜面上挑选少许菌苔，置放三角瓶斜面内进行“之”字画线，然后置于25~26°C温箱内培养24h，经检查无杂菌，菌体生长整齐，再置于26~28°C温箱内培养48~72h，肉眼观察，菌苔丰满，涂片，染色检查无杂菌，分生孢子大小一致的，放置于冰箱中存放备用； 3)种子罐培养: 培养基配方:蔗糖2%，地瓜汁2%，蛋白胨2%，硫酸铵0.6%，磷酸二氢钾0.3%，硫酸镁.0.3%，pH值5.0~5.2 ;所述百分比为质量体积百分比，溶剂为蒸馏水； 空种子罐灭菌:发酵罐在应用前清洗干净，排除污物，并在0.1lMPa压力下灭菌.30min ； 种子罐装料:参照培养基配方按比例装料，投料量不得超过罐容积的70% ； 种子罐灭菌:装好料后，在0.1lMPa压力下，温度达到121°C，灭菌30min，冷却至25°C即可接种； 种子罐接种:在无菌条件下将每个三角瓶斜面菌种加100ml无菌水，把菌苔刮下制成孢子悬浮液，含菌量为10X150CFU/ml ;将制备好的孢子悬浮液，在无菌条件下接种后，按质量比1%的比例接种于冷却至25°C的种子罐内进行培养； 种子罐培养条件控制:接种后在温度为25~26°C，压力在0.05MPa,通气量1: 0.8和搅拌速度120r/min条件下,培养18~24h,所述通气量为每min进出空气体积比V/V/min ；种子罐培养条件检测:接种后4h开始，每隔2h取样一次检测，检测内容包括菌体生长情况，含菌量，PH值，达到指标即可移到发酵罐内发酵； 合格指标:菌体生长整齐，菌丝成簇或多数为菌丝团； 4)发酵罐培养 发酵罐空消:发酵罐在接种前严格灭菌处理，洗净后在0.1lMPa压力下灭菌30min ； 发酵罐投料:配比同种子发酵液，投料量不超过罐容积的70% ； 发酵罐灭菌:装好料后，在0.1lMPa压力下，温度达到121°C，灭菌30min，冷却至25°C即可接种； 发酵罐培养:搅拌速度100~120r/min,罐压0.05MPa,移种4h内通气量为1: (0.4~.0.5)；以后逐渐增大至1: 0.8，一般发酵周期为72~96h，在厚垣孢子大量形成时，符合放罐指标，即可放罐；所述通气量为每min进出空气体积比V/V/min ； 发酵罐检测:投料后6h开始，每隔4h取样一次检测，至48h后，间隔期缩短为2h ； 放罐标准:厚垣孢子含量≥4X150CFU/ml;杂菌量≤0.3% ； 5)清洁发酵室 将发酵室地面及空间清理干净，拌料场内拌料机、链条、皮带输送机清洗干净，晾干；拌料场周围打扫干净，工器具清洗晾干；将场地、设备用漂白粉上清剂喷洒消毒，静置30min ； 6)备料 将种液运入拌料场，按麦麸:种液=10:3的比例运入麦麸； 7)投料混合 根据拌料机的生产能力，按照生产工艺要求和配料比，把菌种和麦麸加入到拌料机，搅拌5min ;把混匀的原料放于皮带传送机,进入同时开户的链条粉碎机粉碎,粉碎均匀的湿料经皮带传送机进入装袋程序，扎口 ； . 8)保温培养 预先将发酵室及地面温度保持在25V以上；将料袋单排码放，平躺于地面，隔4h，倒垛，料袋揉搓，保证发酵均匀。
5.根据权利要求2所述的生物秸杆腐熟剂的制备方法，其特征在于， 所述制备黄孢平革菌发酵物:黄孢平革菌一菌种斜面一三角瓶培养一种子罐培养一发酵罐培养一清洁发酵室一备料一投料混合一保温培养，具体地步骤如下: . 1)菌种斜面 将冻干的黄孢平革菌菌种在无菌环境中转接到事先准备好的试管斜面上，将温度控制在28~30°C，培养36~40h ； . 2)三角瓶培养 培养基:去皮的马铃薯200g，切成小块，加水1000ml煮沸30min滤去马铃薯块，将滤液补足至1000ml，加葡萄糖20g，溶化后分装三角瓶，置于灭菌锅内，在0.1lMPa压力下灭菌.30min,冷却后制成斜面备用； 菌种活化和扩大培养:在无菌条件下从原菌菌种斜面上挑选少许菌苔，置放三角瓶斜面内进行“之”字画线，然后置于25~26°C温箱内培养24h，经检查无杂菌，菌体生长整齐，再置于27~28°C温箱内培养48~72h，肉眼观察，菌苔丰满，涂片，染色检查无杂菌，分生孢子大小一致的，放置于冰箱中存放备用； . 3)种子罐培养: 培养基配方:葡萄糖1%，磷酸二氢钾0.2%，酒石酸铵0.02%，氯化钙0.001%，硫酸镁.0.025%，维生素B10.0001%,七水硫酸铜0.008%,七水硫酸锌0.004%, pH值5.0~5.2 ;所述百分比为质量体积百分比，溶剂为蒸馏水； 空种子罐灭菌:发酵罐在应用前清洗干净，排除污物，并在0.1lMPa压力下灭菌.30min ； 种子罐装料:参照培养基配方按比例装料，投料量不得超过罐容积的70% ； 种子罐灭菌:装好料后，在0.1lMPa压力下，温度达到121°C，灭菌30min，冷却至25V即可接种； 种子罐接种:在无菌条件下将每个三角瓶斜面菌种加100ml无菌水，把菌苔刮下制成孢子悬浮液，含菌量为10 X 150CFU/ml，将制备好的孢子悬浮液，在无菌条件下接种后，按质量比1%的比例接种于冷却至25°C的种子罐内进行培养； 种子罐培养条件控制:接种后在温度为25~26°C，压力在0.05MPa,通气量1: 0.8和搅拌速度120r/min条件下，培养18~24h,所述通气量为每min进出空气体积比V/V/min ；种子罐培养条件检测:接种后4h开始，每隔2h取样一次检测，检测内容包括菌体生长情况，含菌量，PH值，达到指标即可移到发酵罐内发酵； 合格指标:菌体生长整齐，菌丝成簇或多数为菌丝团； . 4)发酵罐培养 发酵罐空消:发酵罐在接种前严格灭菌处理，洗净后在0.1lMPa压力下灭菌30min ； 发酵罐投料:配比同种子发酵液。投料量不超过罐容积的70% ；发酵罐灭菌:装好料后，在0.1lMPa压力下，温度达到121°C，灭菌30min，冷却至25°C即可接种； 发酵罐培养:搅拌速度100~120r/min,罐压0.05MPa,移种4h内通气量为1: (0.4~.0.5)，以后逐渐增大至1:0.8，一般发酵周期为72~96h，在厚垣孢子大量形成时，符合放罐指标，即可放罐；所述通气量为每min进出空气体积比V/V/min ； 发酵罐检测:投料后6h开始，每隔4h取样一次检测，至48h后，间隔期缩短为2h ； 放罐标准:厚垣孢子含量≥4X150CFU/ml;杂菌量≤0.3% ； 5)清洁发酵室 将发酵室地面及空间清理干净，拌料场内拌料机、链条、皮带输送机清洗干净，晾干；拌料场周围打扫干净，工器具清洗晾干；将场地、设备用漂白粉上清剂喷洒消毒，静置30min ； 6)备料 将种液运入拌料场，按麦麸:种液=10:3的比例运入麦麸； 7)投料混合 根据拌料机的生产能力，按照生产工艺要求和配料比，把菌种和麦麸加入到拌料机，搅拌5min ;把混匀的原料放于皮带传送机,进入同时开户的链条粉碎机粉碎,粉碎均匀的湿料经皮带传送机进入装袋程序，扎口 ； 8)保温培养 预先将发酵室及地面温度保持在25°C以上；将料袋平躺于地面，单排码放；隔4h，倒垛，料袋揉搓，保证发酵均匀。
6.根据权利要求2所述的生物秸杆腐熟剂的制备方法，其特征在于， 所述制备解淀粉类芽孢杆菌液:解淀粉类芽孢杆菌一菌种斜面一三角瓶培养一种子罐培养一发酵罐培养，具体地步骤如下: 1)菌种斜面 将冻干的解淀粉类芽孢杆菌菌种在无菌环境中转接到事先准备好的试管斜面上，将温度控制在28~30°C，培养36~40h ； 2)三角瓶培养 培养基制备:LB培养基，酵母膏5g;琼脂2%;NACL10g;蛋白胨IOg;蒸馏水1000ml ；PH7.0 ;分装三角瓶，置于灭菌锅内，在0.1lMPa压力下灭菌30min，冷却后制成斜面备用； 菌种活化和扩大培养:在无菌条件下从原菌菌种斜面上挑选少许菌苔，置放三角瓶斜面内进行“之”字画线，然后置于20°C温箱内培养24h，经检查无杂菌，菌体生长整齐，再置于20°C温箱内培养48~72h，肉眼观察，菌苔丰满，涂片，染色检查无杂菌，分生孢子大小一致的，放置于冰箱中存放备用； 3)种子罐培养 培养基配方:花生饼粉0.5%，鱼粉0.3%，玉米浆0.5%，葡萄糖0.3%，泡敌0.3% ;所述百分比为质量体积百分比，溶剂为蒸馏水； 空种子罐灭菌:发酵罐在应用前清洗干净，排除污物，并在0.1lMPa压力下灭菌.30min ； 种子罐装料:参照培养基配方按比例装料，投料量不得超过罐容积的70% ； 种子罐灭菌:装好料后，在0.1lMPa压力下，温度达到121°C，灭菌30min，冷却至30°C即可接种； 种子罐接种:在无菌条件下将每个三角瓶斜面菌种加100ml无菌水，把菌苔刮下制成孢子悬浮液，含菌量为10X150CFU/ml ;并在80°C恒温水浴中处理30min ;将制备好的孢子悬浮液，在无菌条件下接种后，按质量比1%的比例接种于冷却至30°C的种子罐内进行培养; 种子罐培养条件控制:接种后在温度为28~30°C，压力在0.05MPa,通气量1:1和搅拌速度220r/min条件下,培养8~IOh,所述通气量为每min进出空气体积比V/V/min ； 种子罐培养条件检测:接种后4h开始，每隔2h取样一次检测，检测内容包括菌体生长情况，含菌量，PH值，达到指标即可移到发酵罐内发酵； 合格指标:菌体生长整齐，处于对数生长期，含菌量2X150CFU/ml，无杂菌污染； . 4)发酵罐培养 发酵罐空消:发酵罐在接种前严格灭菌处理，洗净后在0.1lMPa压力下灭菌30min ；发酵罐投料:花生饼粉2.0%，鱼粉0.3%，玉米浆1.8%，糊精0.5%，硫酸镁0.075%,碳酸钙0.5%，磷酸二氢钾0.04%，泡敌0.05%, pH值7.0~7.5，所述百分比为质量体积百分比，溶剂为蒸馏水；投料量不超过罐容积的70% ； 发酵罐灭菌:装好料后，在0.1lMPa压力下，温度达到121°C，灭菌30min，冷却至30°C即可接种； 发酵罐培养:搅拌速度180~200r/min，罐压0.05MPa,移种4h内通气量为1: (0.7~.0.8);以后逐渐增大至1:1 ;一般发酵周期为18~24h，在芽孢大量形成、个别芽孢大量脱落时，符合放罐指标，即可放罐；所述通气量为每min进出空气体积比V/V/min ； 发酵罐检测:投料后4h开始，每隔2h取样一次检测，至18h后，间隔期缩短为Ih ； 放罐标准:芽孢含量≥70% ;含菌量≥50X150CFU/ml;杂菌量≥0.3%。
7.根据权利要求2所述的生物秸杆腐熟剂的制备方法，其特征在于， 所述制备白球拟酵母菌液:白球拟酵母一菌种斜面一三角瓶培养一种子罐培养一发酵罐培养，具体地步骤如下: .1)菌种斜面 将冻干的白球拟酵母菌种在无菌环境中转接到事先准备好的试管斜面上，将温度控制在28~30°C，培养36~40h ； . 2)三角瓶培养 培养基制备:12波美度麦芽技100ml，琼脂2.0%:将琼脂加热溶化后，用0.lmol/1氢氧化钠或0.l%mol/l盐酸调pH值5.0~6.0 ;然后分装三角瓶，置于灭菌锅内，在0.1IMPa压力下灭菌30min,冷却后制成斜面备用； 菌种活化和扩大培养 :在无菌条件下从原菌菌种斜面上挑选少许菌苔，置放三角瓶斜面内进行“之”字画线，然后置于26~28°C温箱内培养24h，经检查无杂菌，菌体生长整齐，再置于26~28 °C温箱内培养24~28h，肉眼观察，菌苔丰满，涂片，染色检查无杂菌，菌体大小一致的，放置于冰箱中存放备用； . 3)种子罐培养 培养基配方:葡萄糖食品级，5.0% ;蛋白胨生物级，0.5% ;酵母膏生物级0.5% ;硫酸镁化学级，0.1% ;磷酸二氢钾化学级，0.1% ;消泡剂生物级，0.05%，pH6.0~6.5 ;所述百分比为质量体积百分比，溶剂为蒸馏水； 空种子罐灭菌:发酵罐在应用前清洗干净，排除污物，并在0.1lMPa压力下灭菌30min ； 种子罐装料:参照培养基配方按比例装料，投料量不得超过罐容积的70% ； 种子罐灭菌:装好料后，在0.1lMPa压力下，温度达到121°C，灭菌30min，冷却至30°C即可接种； 种子罐接种:在无菌条件下将每个三角瓶斜面菌种加100ml无菌水，把菌苔刮下制成孢子悬浮液，含菌量为IOX 150CFU/m;将制备好的孢子悬浮液，在无菌条件下接种后，按质量比1%的比例接种于冷却至30°C的种子罐内进行培养； 种子罐培养条件控制:接种后在温度为26~28°C，压力在0.05MPa,通气量1: 0.6和搅拌速度220r/min条件下,培养8~IOh,所述通气量为每min进出空气体积比V/V/min ；种子罐培养条件检测:接种后4h开始，每隔2h取样一次检测，检测内容包括菌体生长情况，含菌量，PH值，达到指标即可移到发酵罐内发酵； 合格指标:菌体生长整齐，出芽率≥30%，含菌量2X150CFU/ml，无杂菌污染； 4)发酵罐培养 发酵罐空消:发酵罐在接种前严格灭菌处理，洗净后在0.1lMPa压力下灭菌30min ；发酵罐投料:葡萄糖食品级，5.0% ;蛋白胨生物级，0.5% ;酵母膏生物级0.5% ;硫酸镁化学级，0.1% ;磷酸二氢钾化学级，0.1% ;消泡剂生物级，0.05%，pH6.0~6.5，所述百分比为质量体积百分比，溶剂为蒸馏水；投料量不超过罐容积的70% ； 发酵罐灭菌:装好料后，在0.1lMPa压力下，温度达到121°C，灭菌30min，冷却至30°C即可接种； 发酵罐培养:搅拌速度180~200r/min，罐压0.05MPa,移种4h内通气量为1: (0.4~.0.5)；以后逐渐增大至1: 0.6，一般发酵周期为18~24h，检验结果符合放罐指标，即可放罐；所述通气量为每min进出空气体积比V/V/min ； 发酵罐检测:投料后4h开始，每隔2h取样一次检测，至12h后，间隔期缩短为Ih ； 放罐标准:芽孢含量≥70% ;含菌量≥10X150CFU/ml;杂菌量≤0.3%。
【文档编号】C12R1/885GK103614321SQ201310579323
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年11月15日 优先权日:2013年11月15日
【发明者】邵凤成, 刘淑君, 蒋涛, 韩利红, 张雪梅, 赵金胜, 王淑君, 李洪云, 顾永海 申请人:天津市武清区植保植检站