检测人巨细胞病毒（hcmv）的试剂盒及方法

检测人巨细胞病毒（hcmv）的试剂盒及方法
【专利摘要】本发明公开了检测人巨细胞病毒（HCMV）的试剂盒及方法。本发明所提供的检测人巨细胞病毒的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含以下引物序列：上游引物FP：5’-CGTCGGGCAAGCAGATGT-3’，下游引物RP：5’-CCGCAGTGCCACGTCCTTG-3’。所述试剂盒还包括以下探针序列：探针PR:5’-FAM-TGGAAAGAGCCCGACGTCTACTACAC–TQ2-3’。采用本发明所提供的试剂盒对人巨细胞病毒（HCMV）进行PCR检测，具有很好的特异性与灵敏度。本发明所提供的PCR检测方法具有操作简单（闭管）、快速、准确等优点，适用于临床分子诊断。
【专利说明】检测人巨细胞病毒(HCMV)的试剂盒及方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物领域，尤其涉及检测人巨细胞病毒(HCMV)的试剂盒及方法。
【背景技术】
[0002]人巨细胞病毒(Human Cytomegalovirus, HCMV),也称人疱疫病毒5型，属于疱疫病毒科β亚科。HCMV感染在人群感染普遍，其抗体阳性率高达40%~100%。HCMV是一种终身感染病毒，一经感染，人体宿主终身携带。在人体的感染过程中，分为原发感染、激活感染和位于两者之间的潜伏感染。HCMV是一个弱致病因子，多以潜伏形式存在于人体多种细胞中，在免疫系统正常的人体中，潜伏感染并不致病。但多种诱因均可使潜伏的病毒被激活，从而引发明显的临床症状和严重危害。
[0003]HCMV感染在孕妇和婴幼儿以及免疫功能低下的人群如器官移植、艾滋病、恶性肿瘤等则可导致包括致死在内的严重后果。妊娠期妇女由于其内分泌及免疫状态的改变而更易发生HCMV的原发感染，也可使既往体内潜伏的病毒被激活，而发生激活感染，通过母婴垂直传播给胎儿，导致死胎、早产、流产、智力低下、生长发育迟缓及多种畸形，严重者可引起胎儿全身性感染综合征。我国的育龄女性HCMV感染率高达95.3%。孕妇HCMV原发感染者，引起胎儿先天性感染的发病率高达40%，先天性HCMV感染胎儿的死亡率为10%-30%，存活者中90%以上可遗留不同程度的神经系统后遗症。此外，自身免疫病病人，免疫抑制治疗，肝、肾、心脏等器官移植，化疗和放疗的肿瘤及骨髓移植，艾滋病人等极易通过感染而发病，产生广泛的HCMV激活感染，引起活动性HCMV致病表现，如移植失败、HCMV相关肝炎甚至肝衰竭、视网膜炎、肺炎、大肠炎等。
[0004]HCMV感染的常用检测方法，有病毒培养法和血清学方法。病毒分离培养法为HCMV实验室诊断的金标准，但因需时过长，一般5-10天，分离培养条件要求严格，不适合临床常规检测。血清学方法检测HCMV-1gG和IgM是临床常用的检测指标，间接证实体内HCMV的存在。IgM阳性表明
[0005]存在近期HCMV原发感染或激活感染；IgG阳性仅能提示机体曾感染HCMV，主要用于流行病学调查。核酸检验法作为一种医学检验技术在临床各领域疾病诊断特别是感染性病原体的诊断中已经体现出了巨大的优势和作用。现有HCMV试剂盒存在灵敏度低、稳定性差等缺点。研发高灵敏度、高特异性、高稳定性的HCMV核酸检测试剂盒对诊断与治疗HCMV感染与在感染造成的严重后果有着迫切的需求。

【发明内容】

[0006]本发明的一个目的是提供一种检测人巨细胞病毒的试剂盒。
[0007]本发明所提供的检测人巨细胞病毒的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒包含以下引物序列:
[0008]上游引物FP: 5 ’ -CGTCGGGCAAGCAGATGT-3，，
[0009]下游引物RP: 5 ’ -CCGCAGTGCCACGTCCTTG-3，。[0010]所述试剂盒还包括以下探针序列:
[0011]探针PR: 5 ’ -FAM-TGGAAAGAGCCCGACGTCTACTACAC - TQ2-3，。
[0012]本发明的另一个目的是提供一种检测人巨细胞病毒的PCR检测方法。
[0013]本发明所提供的检测人巨细胞病毒的PCR检测方法，包括以下步骤:
[0014](I)将待测DNA模板加入到含有特异性引物对和探针的PCR反应液中得到PCR反应体系； [0015](2)进行实时荧光定量PCR检测；
[0016]所述特异性引物对和探针的序列如下:
[0017]上游引物FP: 5 ’ -CGTCGGGCAAGCAGATGT-3，，
[0018]下游引物RP: 5 ’ -CCGCAGTGCCACGTCCTTG-3，，
[0019]探针PR: 5 ’ -FAM-TGGAAAGAGCCCGACGTCTACTACAC - TQ2-3 ’。
[0020]所述实时荧光定量PCR检测的扩增程序为:95°C预变性2分钟；95°C变性15秒，60°C退火35秒，共45循环。
[0021]采用本发明所提供的试剂盒对人巨细胞病毒(HCMV)进行PCR检测，具有很好的特异性与灵敏度。本发明所提供的PCR检测方法具有操作简单(闭管)、快速、准确等优点，适用于临床分子诊断。
【专利附图】

【附图说明】
[0022]图1为荧光强度相对扩增周期图；相邻稀释反应间的Ct值约相差3.3。
[0023]图2拟合曲线；对图1中的每一条扩增曲线确定Ct值，将Ct值与Log模板浓度用直线函数拟合；直线函数的Y轴截距为41.41，斜率为-3.618。
【具体实施方式】
[0024]本发明根据HCMV序列(序列表中序列I)设计引物与探针，采用上下游引物浓度对称方法使PCR反应产生双链DNA ;探针在PCR反应程序中的退火期与PCR扩增的目标互补单链DNA杂交，并被Taq DNA聚合酶的5'核酸外切酶活性水解，水解后FAM荧光素在激发光的作用下产生荧光信号。
[0025]实施例1、标准品的制备
[0026](一)HCMV DNA 的克隆。
[0027]I)人工合成HCMV LA基因，并将合成产物连到载体pUC18 (购自北京奥科鼎盛公司)上进行克隆(委托北京奥科鼎盛公司合成)，制备质粒，利用PUC18通用测序引物验证所合成HCMV LA序列(序列表中序列见2)，并利用微量分光光度计测定质粒溶液浓度，所得到的pUC18-CMVLA质粒作为HCMV病毒核酸的标准品。
[0028]2) HCMV病毒核酸标准品的制备
[0029]将不同摩尔数的pUC18-CMVLA质粒加到高压灭菌TE缓冲液中，分别得到以下浓度的标准品:将克隆的质粒做酶切并进行稀释，其浓度为106copy/UL。用灭菌TE缓冲液准10倍连续稀释样品，即I ；10,1:102，1:103,1:104, 1:105，1:106,每个反应加入IOuL DNA，其DNA 浓度分别为:IO6Copy/ 反应,IO5Copy/ 反应,IO4Copy/ 反应,IO3Copy/ 反应,IO2Copy/ 反应，IO1Copy/反应。再将IO1C0Py/反应进行稀释，其DNA浓度为2 copy/反应用于检测下限值。
[0030]实施例2、人巨细胞病毒(HCMV)核酸基因检测的灵敏度与动态范围
[0031]1) HCMV病毒核酸阳性样品的制备。
[0032]将实施例1中制备的阳性样品作为模板。
[0033]2)用于检测人巨细胞病毒(HCMV)的特异性引物:
[0034]a.上游引物 FP:5’ -CGTCGGGCAAGCAGATGT-3’(序列表中序列 3)，
[0035]b.下游引物 RP:5’ -CCGCAGTGCCACGTCCTTG-3’(序列表中序列 4)，
[0036]c.探针 PR:5’-FAM-TGGAAAGAGCCCGACGTCTACTACAC - TQ2-3’(序列表中序列 5)，
[0037]委托美国Avetra公司合成。
[0038]3)用于检测人巨细胞病毒(HCMV)的反应体系:10XPCR buffer 4 uL,25mMMgCl24.8uL, IOmM dNTPs0.8uL，0.6uM 上游引物 FP 1.2uL，0.6uM 下游引物 RP 1.2uL,0.3uM探针PR 0.6uL，Taq酶5U/uL0.4uL，模板DNAlOuL，其余为无核酸酶的灭菌高纯双蒸水，终体积为40uL。
[0039]4)用于检测人巨细胞病毒(HCMV)的扩增程序:95°C预变性2分钟；95°C变性15秒，60 V退火35秒，共45循环。
[0040]5)实验结果:
[0041]HCMV质粒阳性样品DNA系列稀释后实时扩增结果见图1。由图1可见，阳性样品稀释倍数 1:10,1:102，1:103,1:104, 1:105，1:106稀释样品 DNA样品的 Ct 值分别为 20，23，26，29,32,35。稀释后每个反应的HCMV模板拷贝数分别为:106copy, 105copy, 104copy, IO3Copy,12Copyjo1Copy0如图2所示,将Log模板浓度与相对应Ct值进行直线函数拟合，所得直线函数的Y轴截距为41.41，斜率为-3.618。
[0042]实施例3、患者的血浆病毒检测的对比实验
[0043]血衆游离DNA采用Qiagen (中国)公司的QIAamp DNA Blood Mini Kit。每份样品使用0.2mL血浆，最终产物DNA溶于50uL灭菌TE缓冲液_20°C冰箱保存。用上述方法分别得到待测样品1、2和3(样品来源于北京协和医院)。对每一样品采用本发明方法与文献报道(《中华泌尿外科杂志》2005年8月第26卷第8期)HCMV方法同时检测。
[0044]I、本发明检测条件:
[0045]1)用于检测HCMV病毒的特异性引物:
[0046]a)上游引物 FP: 5 '-CGTCGGGCAAGCAGATGT-3 ’
[0047]b)下游引物 RP: 5 ’-CCGCAGTGCCACGTCCTTG-3 ’
[0048]c)探针 PR:5，-FAM-TGGAAAGAGCCCGACGTCTACTACAC - TQ2-3，
[0049]委托美国Avetra公司合成。
[0050]2)用于检测人 CMV 病毒的反应体系为:10XPCR buffer 4uL, 25mM MgCl24.8uL,1OmM dNTPs0.8uL,0.6uM 上游引物 FP 1.2uL,0.6uM 下游引物 RP 1.2uL,0.3uM 探针PR0.6uL，Taq酶5U/uL 0.4uL，模板DNA 10ul，其余为无核酸酶的灭菌高纯水，终体积为40uLo
[0051]3)用于检测人CMV病毒的扩增程序:95°C预变性2min ;95°C变性15秒，60°C退火35秒，共45循环。本发明使用实时荧光定量PCR仪进行检测。
[0052]11、文献报道HCMV检测方法条件:[0053]1、用于检测人CMV病毒的引物:
[0054]a)上游引物 FP: 5 ’ -TGCAACGAGAACCCCGAGAA-3 ’
[0055]b)下游引物 RP: 5，-ATCAATGTGCGTGAGCACCT-3 ’
[0056]2、用于检测人 CMV 病毒的反应体系为:10XPCR buffer 4uL, 25mM MgCl24.8uL,IOmM dNTPs0.8uL，(X6uM 上游引物 FP L 2uL，(λ 6uM 下游引物 RP 1.2uL, 40uMSYBRGreenl染料luL，Taq酶5U/uL 0.4uL，模板DNA IOul,其余为无核酸酶的灭菌高纯水，终体积为40uL。
[0057]3、用于检测人CMV病毒的扩增程序:95°C预变性2min ;95°C变性15秒，60°C退火35秒，共45循环。使用实时荧光定量PCR仪进行检测。
[0058]II1、实验结果:
[0059]利用HCMV特异引物与探针对人CMV病毒DNA实时扩增结果见表1。由表1可见，HCMV病毒样品1、2和3的Ct值为24、35和35 ;其病毒载量为3.2X 105copy/mL，817.5copy/mL, 747.5copy/mL0对样品2与3，文献报道方法无法定量，表明本方法较报道方法在检测灵密度方面有优越性。
[0060]表1本发明方法与文献报道检测方法比较
【权利要求】
1.一种检测人巨细胞病毒的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒包含以下引物序列: 上游引物 FP:5’ -CGTCGGGCAAGCAGATGT-3’， 下游引物 RP:5’ -CCGCAGTGCCACGTCCTTG-3’。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒还包括以下探针序列: 探针 PR:5’ -FAM-TGGAAAGAGCCCGACGTCTACTACAC - TQ2-3’。
3.一种检测人巨细胞病毒的PCR检测方法，包括以下步骤:(1)将待测DNA模板加入到含有特异性引物对和探针的PCR反应液中得到PCR反应体系; (2)进行实时荧光定量PCR检测； 其特征在于:所述特异性引物对和探针的序列如下: 上游引物 FP:5’ -CGTCGGGCAAGCAGATGT-3’， 下游引物 RP:5’ -CCGCAGTGCCACGTCCTTG-3’，
探针 PR:5’ -FAM-TGGAAAGAGCCCGACGTCTACTACAC - TQ2-3’。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于: 所述实时荧光定量PCR检测 的扩增程序为:95°C预变性2分钟；95°C变性15秒，60°C退火35秒，共45循环。
【文档编号】C12Q1/68GK103555863SQ201310578891
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年11月18日 优先权日:2013年11月18日
【发明者】谭晓利, 张建东, 窦亚玲, 李志新 申请人:瀚吉康生物科技（北京）有限公司