专利名称：化合物、它们的制备及其在细胞中核酸转移的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及细胞中核酸转移的新化合物。更具体地，这些新化合物属于脂多胺家族，它们含有脒官能团。这些化合物可用于不同种类的细胞中目的核酸的转移，在体外、体内或离体均可。
随着生物技术的发展，有效地向细胞中转移核酸越来越必要。可能涉及在体外细胞中的核酸转移，例如生产重组蛋白、或在实验室中研究控制基因表达、基因克隆或任何其他有关DNA的操作。还可能涉及在体内细胞中的核酸转移，例如生产转基因动物、制备疫苗、标记或还有治疗方法的研究。在骨髓移植、免疫治疗或其他有关在从器官抽取的细胞中转移基因的其他方法中，也可能涉及离体细胞中的核酸转移。
为了改善细胞中的核酸转移曾研究了不同种类的合成载体。在这些载体中，阳离子脂类具有有意义的性质。这些载体由与核酸发生相互作用的阳离子极性部分，和有利于细胞渗透的憎水脂类部分构成。特定的阳离子脂类实例具体是单阳离子脂类(DOTMALipofectin)、某些阳离子洗涤剂(DDAB)、脂多胺，特别是双十八烷基酰氨基甘氨酰基精胺(DOGS)或棕榈酰基磷脂酰基乙醇胺的5-羧基精胺酰胺(DPPES)，例如在专利申请EP 394 111中描述了其制备方法。在专利申请WO 97/18185中描述的化合物代表了另一脂多胺家族，该专利申请引于本文中作为参考。
本发明涉及具有特别有利性质的新类型核酸转移试剂。更确切地，本发明的化合物是阳离子脂类，它们带有新颖的阳离子区，因此带给分子更好的性质。更确切地，这阳离子部分以有一个或多个脒官能团的特定多胺为代表。
本发明的第一个目的更确切地涉及具有下述通式(I)的呈D、L或DL形式的化合物，以及它们的盐
式中-R1、R2和R3各自代表氢原子或-(CH2)q-NRR′，其中·q是包括1和6在内的1-6的整数，q值在R1、R2和R3基团之间是彼此不相关的，·R和R′各自代表氢原子或下述化学式(II)基团
式中r是包括0和6在内的0-6的整数，R5各自代表氢原子或烃基残基，其条件是R1、R2和R3基团中至少一个基团含有至少一个化学式(II)基团，-m和n各自代表包括1和6在内的1-6的整数，当n大于1时，m可以取不同的值，而R3可具有通式(I)下不同的含意，-p代表包括1和6在内的1-6的整数，以及-R4代表具有下述通式(III)的基团
式中·R7和R8各自代表氢原子或亲脂基团，R7和R8基团中至少一个基团不是氢原子，·t是包括0和10在内的0-10的整数，当t是大于1的整数时，R6、X、Y和s在不同的结构单元[X-(CHR6)s-Y]中可以具有不同的含意，·X代表氧原子或硫原子，或氨基或烷基氨基，烷基取代基是直链或支链的并含有1-8个碳原子，·Y代表羰基或亚甲基，·R6代表氢原子或任选被取代的天然氨基酸侧链，以及·s代表包括1和10在内的1-10的整数，并且当s等于1时，R6代表任选被取代的天然氨基酸侧链，当s大于1时，R6代表氢原子。
如前面使用的术语“DL形式”表示任何比例的D和L形式的混合物，例如等比例的混合物。
本发明中关于“烃基残基”，应当理解是任选卤化的任何脂族或芳族烷基、氨基甲酸酯基或酰基取代基。在脂族残基中，更具体地可以提到任选卤化的、环状或非环状的、直链或支链的、饱和或未饱和的脂族残基。更优选地，涉及含有1-10个碳原子的脂族残基。具体地，涉及烷酰基、烷基和烷氧羰基取代基，例如像甲酰基、丁基、叔丁基或叔丁氧羰基取代基。根据本发明的一种实施方案，R5代表叔丁氧羰基。
在芳族残基中，更具体地可以列举苄基及其衍生物，如氯代苄基、苄氧羰基或氯代苄氧羰基。
优选地，R5代表叔丁氧羰基、苄氧羰基或氯代苄氧羰基。
在本发明的第一个方案中，R5基团中一个代表氢原子，而另一个代表含有1-10个碳原子的脂族残基。
在本发明的第二个方案中，R5基团中一个代表氢原子，而另一个代表优选地选自苄基及其衍生物的芳族残基。
在本发明的其他方案中，两个R5基团都代表氢原子。
有利地，当R1、R2和/或R3不是氢原子并含有通式(II)时，q取值为2或3，而r为0。
优选地，在通式(I)中，m选自2、3和4。
正如前面所指出的，R7和R8基团中至少一个基团代表亲脂基团。在本发明中，“亲脂基团”应当理解是有利于如本技术领域技术人员已知的细胞渗透的、憎水脂类类型的任何基团。具体地涉及一个或多个脂肪脂族链、类固醇衍生物、天然或合成的脂类，优选能够生成层状相或六方形相的脂类，或任选地这些物质的组合。更具体地可能涉及任选卤化的、直链或支链的、饱和或未饱和的含有5-22个碳原子的脂族基团。还可能涉及类固醇衍生物，或(CH2)u-NH-R9基团，式中u是包括2和6在内的2-6的整数，R9是酰基，例如像氯代胆甾醇甲酸酯基、花生四烯酰基或胆酸。
其他的类固醇衍生物的实例特别有胆固醇、胆甾烷醇、3-α-5-环-5-α-胆甾烷-6-β-醇、胆酸、胆甾醇甲酸酯、胆甾烷醇甲酸酯、3α，5-环-5α-胆甾烷-6-β-基甲酸酯、胆甾烯基胺、6-(1，5-二甲基己基)-3a，5a-二甲基十六氢环戊二烯并[a]环丙并[2，3]环戊二烯并[1，2-f]萘-10-基胺，或胆甾烷基胺。
优选地，亲脂基团是含有10-22个碳原子，优选地14、16、17、18或19个碳原子的脂族基团。具体可以列举亲脂基团(CH2)13CH3、(CH2)15CH3、(CH2)16CH3、(CH2)17CH3、(CH2)18CH3与油基。
在一特定的实施方式中，R7和R8两个基团都代表如上述的亲脂基团。特别地，在优选实施方式中，R7和R8两个基团中的每个基团代表含有5-22个碳原子的脂族链，更优选地含有12-22个碳原子的脂族链。
根据本发明的一种方案，R6代表天然氨基酸的侧链。具体地，天然氨基酸侧链可以含有脒基结构单元，例如像精氨酸侧链。如前面所说明的那样，这种侧链R6还可以被含有1-24个碳原子的、支链或直链或环状的、饱和或未饱和的脂族基团取代。作为实例，可以列举被胆甾烯基、花生四烯酰基或视黄酰基、单-或多-芳族基团取代的氨基酸侧链，所述芳族基团例如为取代或未取代的苄氧羰基、苄基酯、若丹明基或生物素基衍生物。
在一种特别有利的实施方式中，要求保护的化合物还含有能够使与其结合的核酸定向转移的靶向元件。优选地，将这种靶向元件加到通式(I)的化合物中用取代基R6表示的氨基酸侧链上。更优选地，靶向元件以共价或非共价方式与本发明的化合物连接。
这可能涉及一种细胞外的靶向元件，该元件能够使核酸转移朝向某些种类的细胞或某些希望的组织(肿瘤细胞、肝细胞、生血细胞等)。关于这一点，可能涉及在靶细胞类型表面上存在的细胞受体的配体，例如像糖、叶酸盐、转铁蛋白、胰岛素、脱唾液酸血清类粘蛋白或被细胞外受体识别的任何生物活性分子。还可能涉及能够使核酸转移朝向某些特定细胞部分(线粒体、细胞核等)的细胞内靶向元件，例如像核定位信号序列(nls)，它有利于在细胞核中积累已转染DNA。
更一般地，在本发明范围内能够使用的靶向元件包括糖、肽、寡核苷酸、类固醇或脂类。优选地，涉及糖和/或肽，如抗体或抗体片段、细胞受体的配体或其片段、受体或其片段等。具体地，可能涉及下列受体的配体生长因子受体、细胞因子受体、细胞凝集素受体或粘合蛋白如整联蛋白的受体。还可以列举转铁蛋白受体、HDL与LDL脂类受体。靶向元件还可以是能够靶向于凝集素的糖，如靶向脱唾液酸糖蛋白受体，或能够靶向于免疫球蛋白片段Fc受体的抗体片段Fab。
同样地，可能想到将通式(I)化合物与生物素、罗丹明、叶酸类的标记试剂通过例如氨基酸侧链R6结合起来。这种标记试剂还可以是直链或环状的肽或假肽序列，该序列含有识别整联蛋白类粘合蛋白一级体和/或次级受体的表位Arg-Gly-Asp。
一个特定的本发明化合物组是R1包括化学式(II)基团，而R2与R3是氢原子的化合物组。
第二个特定的本发明化合物组是R1和R2每个都包括化学式(II)基团，而R3是氢原子的化合物组。
另一个特定的本发明化合物组是R1和R3每个都包括化学式(II)基团，而R2是氢原子的化合物组。
另一个特定的本发明化合物组是其中R1、R2和R3每个都包括化学式(II)基团的化合物组。
本发明通式(I)新化合物可以呈盐形式，优选地呈非毒性的和药学上可接受的盐的形式。这些无毒的盐包括与无机酸(盐酸、硫酸、氢溴酸、磷酸、硝酸)生成的盐、与有机酸(乙酸、丙酸、琥珀酸、马来酸、羟基马来酸、苯甲酸、富马酸、甲磺酸或草酸)生成的盐，或与无机碱(氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂、氢氧化钙)生成的盐，或与有机碱(如三乙胺的叔胺、哌啶、苄基胺)生成的盐。
作为代表，更具体地可以列举采用下述子通式定义的本发明的化合物
R4和R5如前面所定义。
作本发明的核酸转移剂，可以列举下述化学式的化合物
化合物3
化合物5
本发明的化合物可以采用不同的方法进行制备，特别是采用溶液合成和/或采用在聚合物载体上固相合成进行制备。
根据第一种合成方法，本发明通式(I)化合物可以采用下述方法得到让脲的硫代或氧代衍生物(其胺任选地被保护)与具有下述化学式(VIII)的脂多胺作用
式中R′1、R′2、R′3各自代表氢原子或(CH2)q-NR9R10基团，其中q可以是包括1和6在内的1-6的整数，不同的q彼此不相关。
R9和R10各自代表氢原子或化学式(CH2)r-NH3基团，其中r各自是包括1和6在内的1-6的整数，以及m、n、p和R4如前面所定义。
一般地，在碱存在下，在合适的亲质性或非质子性溶剂中，在温度0℃至100℃的条件下进行脲衍生物的这种作用。
使用的碱一般地是非亲核的碱，例如像叔胺、碳酸钠或碳酸氢钠。有利地，使用叔胺，例如三乙胺(TEA)或N-乙基二异丙基胺(DIEA)。
有利地，在如水、醇(甲醇、乙醇、异丙醇等)、二甲基甲酰胺、二氯甲烷、氯仿、甲苯、四氯化碳、苯、乙腈、N-甲基吡咯烷酮等之类的溶剂中进行该反应。优选地，反应温度是20-60℃，更优选地是30-50℃。
更特别有意义的脲衍生物例如是O-甲基异脲(J.Med.Chem.38(1995)16，3053-3061)，S-甲基异硫脲半硫酸盐(Int.J.Pept.Prot.Res.，40(1992)，119-126)，双-Boc-硫脲(Tet.Lett.48(1993)，7677-7680)、N，N′-双(苄氧基羰基)-S-甲基异硫脲或N，N′-双(叔丁氧基羰基)-S-甲基异硫脲(Synth.Commun.26(1996)，2，407-413)。
通式(VIII)脂多胺可根据作为参考文献列于本文的专利申请WO97/18185所描述的方法，或采用本领域技术人员任何已知的类似方法得到。
根据本发明，通式(I)转移剂还可通过下述通式(IX)的酸与脂类分子R4H之间的肽偶合作用得到
式中R1、R2、R3、m、n、p和R4如前面所定义。
根据常规方法(Bodanski M.，肽合成原理与实践(Principlesand Practices of Peptides Synthesis)，Ed.Springe-Verlag)或本领域技术人员已知的任何类似方法进行肽偶合作用。
具体地，一般在合适的非质子性溶剂中，在温度0-100℃下，在非亲核碱存在下进行该反应，同时其pH调节到9-11。
作为实例，氯仿、二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、乙腈、二氯甲烷、甲苯或苯可以用作溶剂。
使用的非亲核碱优选地是叔胺、碳酸钙或碳酸氢钠。更优选地，使用的碱是叔胺，例如三乙胺(TEA)或N-乙基二异丙基胺(DIEA)。
有利地，该反应在温度0-50℃，更优选地在10-30℃下进行。
其中R4如前面所定义的通式R4H脂类分子，可以通过市售的通式(X)化合物与化学式NHR7R8胺之间的肽偶合作用得到
式中X、Y、s、t、R6、R7和R8如前面所定义。
根据常规方法(Bodanski M.，肽合成原理与实践，Ed.Springe-Verlag)或采用本领域技术人员已知的任何类似方法进行肽偶合作用。
具体地，如前面所描述的那样，一般在合适的非质子性溶剂中，在温度0-100℃下，在非亲核碱存在下进行该反应，同时其pH调节到9-11。
按照分3步的固相合成方法可以得到通式(IX)酸，其方法如下
-将如下的通式(XI)多胺
式中R′1、R′2、R′3、m和n如前面所定义，接枝在聚合物载体
上，得到下述通式(XII)的接枝化合物
优选地，在例如氯仿、二氯甲烷、二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、乙腈、甲苯、苯等之类的合适的非质子性溶剂存在下，在温度0-100℃下进行该反应。有利地，反应温度是室温。
不同的聚合物载体都适用。有利地选择在市场上可购到的固相肽合成(Merrifield合成)树脂。具体地，可以选择O-氯代三苯甲基型氯化物树脂或HMP树脂，这些树脂提供有游离酸官能团的产物，或Rink型树脂。聚氨基酸可以用在固相上预合成的有溴代烷基官能团或w-醛酸官能团的肽直接合成得到。
根据烷基化方法选择要得到合适树脂所使用的烷基化剂。对于通常的烷基化作用，例如选择溴代乙酸或w-卤代羧酸。对于还原性烷基化作用，例如选择w-醛-羧酸，如乙醛酸、半-醛琥珀酸等，或酮-酸，如乙酰乙酸或丙酮酸等。
为了得到支化多胺，通式(XI)的原料多胺可以从市场上购卖，例如亚精胺、精铵、三-(2-氨基乙基)胺、苯二胺、二氨基乙烷(丙烷、丁烷、戊烷、己烷等)，或者可以采用通常的方法合成，例如用在市场上可购买到的胺如二氨基乙烷(丙烷、丁烷、戊烷、己烷等)胺、亚精胺、精铵经氰乙基化作用合成得到。
-在第二个步骤中，让通式(XII)接枝化合物与脲的硫代衍生物或氧代衍生物进行反应，该脲衍生物中的胺任选地被保护，得到具有下述通式(XIII)的接枝多氨基脒化合物
式中R1、R2、R3、m、n和p如前面所定义。
根据本领域技术人员已知的方法(Bergeron，R.J.和McManis，15-Deoxyspergualin的全合成，有机化学杂志，1987，52，1700-1703)或根据类似的方法进行该反应。
具体地在质子或非质子性溶剂存在下，在温度-20℃至100℃下进行该反应。
作为实例，可使用水、醇(甲醇、乙醇、异丙醇等)、二甲基甲酰胺、二氯甲烷、氯仿、芳族溶剂(甲苯、苯等)、四氯化碳、乙腈、N-甲基吡咯烷酮等作为溶剂。
更特别有意义的脲衍生物例如是O-甲基异脲(J.Med.Chem.38(1995)16，3053-3061)、S-甲基异硫脲半硫酸盐(Int.J.Pept.Prot.Res.，40(1992)，119-126)，双-Boc-硫脲(Tet.Lett.48(1993)，7677-7680)、N，N′-双(苄氧基羰基)-S-甲基异硫脲或N，N′-双(叔丁氧基羰基)-S-甲基异硫脲(Synth.Commun.26(1996)，2，407-413)。
-最后，在最后的步骤中，从聚合物载体解离出通式(XIII)接枝多氨基脒，以便得到如前面定义的通式(IX)的酸。根据本领域技术人员已知的通常方法进行解离。具体地，通过不使分子残基降解的弱酸作用进行操作。优选的弱酸例如是含氟的醇，更特别是1，1，1-三氟乙-2-醇。
因为通式(XIII)多氨基脒含有酸、氨基、烷基氨基和/或脒官能团，如果必要的话，优选在解离聚合物载体时预先保护它们。这种保护可以使用其加入和除去都不会改变分子残基的任何相容的基团。具体地，根据在T.W.GREENE，有机合成中的保护基团，A.Wiley-护基团，Plenum Press(1973)中描述的方法进行操作。
如果必要的话，根据本领域技术人员已知的通常方法，在解离聚合物载体之后所得到的通式(IX)酸与化学式R4H化合物之间肽偶合之前除去保护基团。
作为实例，保护基团可以选自三甲基甲硅烷基、二苯甲基、四氢吡喃基、甲酰基、乙酰基、氯代乙酰基、三氯代乙酰基、三氟乙酰基、乙氧基羰基、叔丁氧基羰基、三氯乙氧基羰基、苄氧基羰基、芴氧基羰基等。
本领域技术人员已知的可得到本发明核酸转移剂的任何其他方法，特别是在Bodanski M.，肽合成的原理与实践，Ed.Springe-Verlag中描述的方法，也都属于本发明的范围。
本发明另外一个目的涉及一种含有如上述定义的转移剂和核酸的组合物。优选地，该化合物与核酸的量是该化合物正电荷与核酸负电荷的比R应为0.1-50，更优选地为0.1-20。本领域技术人员根据使用的化合物、核酸和所要求的应用(具体待转移细胞类型)，可以很容易地调整这个比例。
在本发明中，“核酸”应当理解是脱氧核糖核酸和核糖核酸。可能涉及天然或人工序列，具体地如基因组DNA(gDNA)、互补DNA(cDNA)、信使RNA(mRNA)、转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)的序列，杂合序列或合成或半合成的序列，修饰或未修饰的寡核苷酸。这些核酸可以来自人、动物、植物、细菌、病毒等。它们可以采用本领域技术人员已知的任何技术得到，具体地采用筛选文库、化学合成得到，或采用包括化学或酶修饰由筛选文库所得到序列的混合方法得到。它们可以采用化学方法修饰。
特别地，脱氧核糖核酸可以是短的寡核苷酸或较长的序列，可以是单链或双链。具体地，这些核酸有利地由质粒、载体、附加体、表达盒等构成。这些脱氧核糖核酸可以带有在其靶细胞中有功能或否的复制起点、一个或多个标记基因、转录或复制的调节序列、有治疗意义的目的基因、修饰或未修饰的反义序列、其他细胞组分连接区等。
优选地，该核酸包括一个表达盒，它由靶细胞中有活性的一个或多个启动子和转录终止子控制下的一个或多个具有治疗意义的目的基因构成。
在本发明的意义上，具有治疗意义的目的基因应当特别地理解是编码具有治疗作用的蛋白质产品的任何基因。如此编码的蛋白质产品具体地可以是蛋白质或肤。这种蛋白质产品对靶细胞可以是同源性外源的或内源的，即当靶细胞没有任何疾病时在该细胞中正常被表达的产物。在这种情况下，蛋白质表达例如可缓解该细胞中表达不充分，或由于修饰而失活的或低活性蛋白的表达，或能够过表达所述的蛋白质。具有治疗意义的目的基因还可编码稳定性提高的、活性改变的细胞蛋白突变体。蛋白产品对靶细胞还可以是异源的。在这种情况下，表达的蛋白例如可以补充或提供细胞中的缺失活性，使它能够抵御疾病，或刺激免疫反应。
在本发明意义上的治疗产品中，更具体地可以列举酶、血液衍生物、激素、淋巴因子白介素、干扰素、TNF等(FR 92/03120)、生长因子、神经递质或它们的前体或合成酶、营养因子(BDNF、CNTF、NGF、IGF、GMF、aFGF、bFGF、NT3、NT5、HARP/多效营养因子等)、原脂蛋白(ApoAI、ApoAIV、ApoE等，FR93/05125)、肌营养不良蛋白或小肌营养不良蛋白(FR 91/11947)、与先天性粘液稠厚症相关的CFTR蛋白质、肿瘤抑制基因(p53，Rb，RaplA，DCC，k-rev等，FR 93/04745)、编码凝血相关因子的基因(因子VII、VIII、IX)、参与DNA修复的基因、自杀基因(胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶)、血红蛋白或其他蛋白载体的基因、代谢酶、分解代谢酶等。
具有治疗意义的核酸还可能是一种基因或一种反义序列，其在靶细胞中的表达能够控制基因表达或细胞mRNA转录。根据在专利EP 140308中描述的技术，这样一些序列例如能够在靶细胞中转录成细胞mRNA的互补RNA，并因此阻断其转译成蛋白。治疗基因还包括核酶的编码序列，它能够选择性地破坏靶RNA(EP 321 201)。
核酸还包括一个或多个编码能够在人体或动物中产生免疫反应的核酸还包括一个或多个编码能够在人体或动物中产生免疫反应的抗原性肽的基因。在这种特定的实施方式下，本发明可用于制备疫苗，或者用于人或动物的免疫治疗，特别是抗微生物、病毒或癌的免疫治疗。具体地涉及EB病毒、HIV病毒、B型肝炎病毒(EP 185 573)、假狂犬病病毒、“合胞体形成病毒”、其他病毒的特定抗原性肽，或特定的肿瘤抗原性肽(EP 259 212)。
优选地，核酸还含有支持具有治疗意义的目的基因和/或编码抗原性肽的基因在所希望的细胞或器官中表达的序列。当它们在感染细胞中能够发生作用时，可能涉及天然地负责表达所考虑基因的序列。还可能涉及不同来源的序列(负责表达其他蛋白，或甚至合成的序列)。具体地，可能涉及真核生物或病毒基因的启动子序列。例如，可能涉及来自希望感染细胞的基因组的启动子序列。同样地，可能涉及来自病毒基因组的启动子序列。在这方面例如可以列举E1A、MLP、CMV、RSV等基因的启动子。另外，这些表达序列可以通过加入激活、调节等序列修饰。还可能涉及可诱导或可阻抑性启动子。
另外，核酸特别在具有治疗意义的目的基因上游还可能包括一种引导合成的治疗产品在靶细胞分泌道中的信号序列。这种信号序列可能是治疗产品的自然信号序列，但也可能涉及任何其他的功能信号序列，或人工的信号序列。该核酸还可能包括将合成的治疗产品引向特定胞腔的信号序列。
在另外一种实施方式中，本发明还涉及含有核酸、如前面定义的转染剂(I)和一种或多种添加剂的组合物，该添加剂能够与转染剂/核酸复合物结合，并能够改善转染能力。这类添加剂(例如脂类、肽或蛋白)能够很有利地增加化合物的转染能力。
从这点来看，本发明组合物可以含有一种或多种中性脂类作为添加剂。这样一些组合物是特别有利的，核酸脂复合物电荷比R低时尤其如此。申请人事实上已表明加入中性脂类能够改善核酸脂类颗粒的生成，还有利于颗粒渗透到细胞中，其使细胞膜不稳定。
更优选地，在本发明范围内使用的中性脂类是具有2个脂肪链的脂类。特别有利地，使用在生理条件下两性离子的或没有离子电荷的天然或合成的脂类。更具体地，它可以选自二油酰基磷脂酰基乙醇胺(DOPE)、油酰基棕榈酰基磷脂酰基乙醇胺(POPE)、二-硬脂酰基、二-棕榈酰基、二-肉豆蔻酰基磷脂酰基乙醇胺以及它们的1-3次N-甲基化衍生物、磷脂酰基甘油、二酰基甘油、糖基二酰基甘油、脑苷脂类(具体如半乳糖脑苷脂类)、鞘脂类(例如鞘磷脂)，或脱唾液酸神经节苷脂类(具体例如是脱唾液酸GM1与GM2)。
这些不同的脂类可以采用本领域技术人员熟知的方法，或者通过合成，或者通过从器官(例如脑)或卵提取得到。具体地，可以采用有机溶剂提取天然脂类(还可参见Lehninger，生物化学)。
最近，申请人证实使用一种直接或非直接地参与所述核酸凝集的化合物作为添加剂也是特别有利的(WO 96/25508)。在本发明组合物中，这种化合物的存在能够降低转染化合物的量，由此得到在毒理学方面有益的结果，而不会对转染活性带来任何损害。关于参与核酸凝集的化合物，应当定义为一种直接地或非直接地压缩核酸的化合物。更确切地，这种化合物或者可以在待转染核酸中直接地起作用，或者在一种直接参与核酸凝集的附加化合物中起作用。优选地，直接地在核酸中起作用。例如，预压缩剂可以是任何多阳离子物，例如聚赖氨酸。根据一种优选实施方式，这种参与核酸凝集的压缩剂全部或部分地由鱼精蛋白、组蛋白或核仁素和/或一种它们的衍生物衍生得到。这种压缩剂还可以全部或部分由肽结构单元(KTPKKAKKP)和/或(ATPAKKAA)构成，结构单元数可以是2-10。在本发明化合物的结构中，这些结构单元可以连续地或非连续地重复。也就是说它们可以通过生物化学性质的连接物，例如通过一种或多种氨基酸，或通过化学性质的连接物被分隔。
优选地，本发明的组合物含有每当量核酸为0.01-20当量的添加剂(摩尔/摩尔)，更优选地是0.5-5。
在特别有利的实施方式中，本发明组合物还含有能够使核酸转移定向的靶向元件。这种靶向元件可以是能够使DNA转移定向到某些细胞类型或某些所希望的组织(肿瘤细胞、肝细胞、生血细胞)的细胞外靶向元件。还可能涉及能够使核酸转移定向到某些特定的细胞区(线粒体、核等)的细胞内靶向元件。靶向元件可以与本发明的核酸转移剂连接，或还可以与如前面所提到的核酸连接。
在本发明范围内可使用的靶向元件中，可以列举糖、肽、蛋白、寡核苷酸、脂类、神经介质、激素、维生素或它们的衍生物。优选地，涉及糖、肽或蛋白质，如抗体或抗体片段、细胞受体配体或它们的片段、受体或受体片段等。具体地，可能涉及生长因子受体的配体、细胞因子受体的配件、细胞凝集素类受体的配体，或具有RGD序列且对如整联蛋白之类的粘合蛋白受体有亲合性的配体。还可以列举转铁蛋白、HDL和LDL的受体，或叶酸转运载体。靶向元件还可以是能够靶向于凝集素如脱唾液酸糖蛋白受体或syalydes受体的糖，像sialydeLewis X，或为抗体的片段Fab、或单链抗体(ScFv)。
可以采用本领域技术人员已知的任何技术，例如采用与憎水部分偶合，或与本发明转移剂与核酸相互作用的部分偶合，或者与本发明转移剂或与核酸相互作用的基团偶合，使靶向元件与核酸脂类复合物结合。根据优选方式，上述相互作用可以是离子性的或共价性的。
本发明还有一个目的是如上述定义的化合物用于细胞中核酸(更一般地多阴离子)转移的用途。
对于体内应用，例如研究基因调节、建立动物疾病模型或在治疗中，本发明的组合物可以根据局部、皮肤、口服、直肠、阴道、胃肠外、鼻内、静脉内、肌肉内、皮下、眼内、经皮的、气管内、腹膜内等用药途径而配制。优选地，本发明组合物含有在注射剂中、具体地直接注射到所要求器官中时、或采用局部方法(在皮肤和/或粘膜上)用药时在药学上可接受的赋形剂。具体地可能涉及灭菌的等渗溶液，或干组合物，特别是冻干组合物，根据情况通过添加无菌水或生理血清，上述组合物能够制成可注射溶液。注射时所使用核酸的剂量以及用药次数可以根据不同的参数进行调整，特别是根据所使用的用药方式、涉及的疾病、待表达基因、或寻求的治疗时间。更具体地关于用药方式，可能是直接注入组织中，例如注入肿瘤中或血液循环途径中，或者处理培养细胞接着采用注射或移植术再植入体内。在本发明范围内有关组织与血液循环途径例如是肌肉、皮肤、脑、肺、肝、脾、骨髓、胸腺、心、淋巴、血液、骨、软骨、胰、肾、膀胱、胃、肠、睾丸、卵巢、直肠、神经系统、眼、腺、结缔组织等。
本发明还涉及向细胞中转移核酸的方法，该方法包括下述步骤(1)让核酸与如前面定义的转移剂接触形成复合物，和(2)让细胞与(1)中生成的复合物接触。
可以通过与所述的复合物一起培养细胞(对于体外或离体的应用)或通过在器官中注射复合物(对于体内的应用)使细胞与复合物进行接触。优选地，在例如每106细胞为0.01-1000微克的核酸存在下进行培养。对于体内用药，例如可以使用的核酸剂量是0.01-10毫克。
在本发明的组合物还含有一种或多种如前面定义的添加剂和/或靶向元件的情况下，这一种或多种添加剂和/或靶向元件预先与本发明转移剂混合或与核酸混合。
本发明因此提供一种核酸转移、特别是治疗疾病的特别有利的方法，该方法包括在体外、体内或离体下在上述定义的条件下施用与通式(I)转移剂结合的能减轻所述疾病的核酸。更具体地，这种方法可用于因缺少蛋白质或核酸产品而造成的疾病，使用的核酸编码所述的蛋白质产品，或转录成核酸产品，或构成所述的核酸产品。
本发明还涉及本发明通式(I)转移剂在体内、离体或体外转染细胞方面的任何应用。
本发明的化合物特别地可用于核酸向初级细胞中或向稳定细胞系中的转移。可能涉及成纤维细胞、肌肉细胞、神经细胞(神经元、星形细胞、神经胶质细胞)、肝细胞、造血细胞系(淋巴细胞、CD34、树状细胞等)、上皮细胞等，它们呈分化或多能(前体)形式。
除了前面说明的方案外，本发明还包括由下面实施例与附图得出的其他特征与优点，而这些实施例应认为是说明本发明而不限制其保护范围。
图1/15本发明化合物1的合成流程图。
图2/15在没有血清蛋白的情况下，测定了在NIH3T3，HepG2和HeLa细胞中本发明化合物1在体外的转染效率，还与其胺同系物(RPR120535)作了比较。
关于“胺同系物”，应当理解是除脒官能和/或胍官能团被氨基官能团取代之外相同的阳离子脂类。
在横轴上的不同电荷比下进行了测定。纵轴为荧光素酶的表达，以每个孔的RLU(相对光单位)表示。
图3/15没有(白色条)与有(黑色条)血清蛋白的情况下，测定了在NIH3T3，HepG2和HeLa细胞中本发明化合物1在体外的转染效率，还与其胺同系物(RPR120535)作了比较。
在横轴上的不同电荷比下测定。纵轴为荧光素酶的表达，以每个孔的RLU(相对光单位)表示。
图4/15在没有血清蛋白的情况下，测定了在HeLa细胞中本发明化合物2在体外的转染效率。对呈微团形式和与中性辅脂类(DOPE与胆固醇)结合的化合物2进行了测定。
横轴表示阳离子脂类与DNA所生成复合物的电荷比。纵轴是以pg/孔表示的荧光素酶的表达。每个孔有100 000个细胞。
图5/15在没有血清蛋白的情况下，测定了在HeLa细胞中本发明化合物3在体外的转染效率。对呈微团形式和与中性辅脂类(DOPE与胆固醇)结合的化合物3进行了测定。
横轴表示阳离子脂类与DNA所生成复合物的电荷比。纵轴是以pg/孔表示的荧光素酶的表达。每个孔有100 000个细胞。
图6/15在没有血清蛋白的情况下，测定了在HeLa细胞中本发明化合物5在体外的转染效率。对呈微团形式和并与中性辅脂类(DOPE与胆固醇)结合的化合物5进行了测定。
横轴表示阳离子脂类与DNA所生成复合物的电荷比。纵轴是以pg/孔表示的荧光素酶的表达。每个孔有100 000个细胞。
图7/15在没有血清蛋白的情况下，测定了在HeLa细胞中本发明化合物6在体外的转染效率。对呈微团形式和与中性辅脂类(DOPE与胆固醇)结合的化合物6进行了测定。
横轴表示阳离子脂类与DNA所生成复合物的电荷比。纵轴是以pg/孔表示的荧光素酶表达。每个孔有100 000个细胞。
图8/15这些表表明了根据电荷比与化合物2生成的核酸脂类复合物所处的物理-化学相(A、B或C相)，与其胺化类似物比较。
测定了呈微团形式和与中性辅脂类(DOPE与胆固醇)结合的化合物2及其胺同系物的相。
比较2个表后，观察到在化合物2的情况下不稳定相B向较低电荷比的方向移动。
图9/15这些表表明了根据电荷比与化合物3生成的核酸脂类复合物所处的物理-化学相(A、B或C相)，与其胺类似物比较。
测定了呈微团形式和与中性辅脂类(DOPE与胆固醇)结合的化合物3及其胺同系物的相。
比较2个表后，观察到在化合物3的情况下不稳定相B向较低电荷比的方向移动。
图10/15这些表表明了根据电荷比与化合物5生成的核酸脂类复合物所处的物理-化学相(A、B或C相)，与其胺化类似物比较。
测定了呈微团形式和与中性辅脂类(DOPE与胆固醇)结合的化合物5及其胺同系物的相。
比较2个表后，观察到在化合物5的情况下不稳定相B向较低电荷比的方向移动。
图11/15这些表表明了根据电荷比与化合物6生成的核酸脂类复合物所处的物理-化学相(A、B或C相)，与其胺化类似物比较。
测定了呈微团形式和与中性辅脂类(DOPE与胆固醇)结合的化合物6及其胺同系物的相。
经比较2个表后，观察到在化合物6的情况下不稳定相B向较低电荷比的方向移动。
图12/15这些表说明了呈微团形式的化合物2、3、5和6在加溴图12/15这些表说明了呈微团形式的化合物2、3、5和6在加溴化乙锭之后的荧光降低。被脂类取代的DNA的溴化乙锭是与DNA连结的指示。只有DNA时所得到的荧光定为100％。
图13/15这些表说明了在胆固醇存在下，化合物2、3、5和6在加溴化乙锭之后荧光降低。被脂类取代的DNA的溴化乙锭是与DNA连结的指示。只有DNA时所得到的荧光定为100％。
图14/15这些表说明了在DOPE存在下，化合物2、3、5和6在加溴化乙锭之后荧光降低。被脂类取代的DNA的溴化乙锭是与DNA连结的指示。只有DNA时所得到的荧光定为100％。
图15/15表示质粒pXL3031。
缩写与符号AcOEt乙酸乙酯BOC叔丁氧羰基BOP苯并三唑-1-氧基三(二甲基氨基)鏻六氟磷酸盐DDC二环己基碳化二亚胺DCU二环己基脲DIEAN-乙基二异丙胺DMAP4-二甲基氨基吡啶DMF二甲基甲酰胺DMSO二甲亚砜DODA双十八烷基胺EP石油醚EtOH乙醇NEt3三乙胺Rf保留系数TEA三乙胺TFA三氟乙酸THF四氢呋喃
UV紫外SPPS固相肽合成HPLC高压液相色谱Z苄氧基羰基CIZ对氯苄氧基羰基化学合成用的材料与方法a)化合物-为了获得支化多胺，其原料多胺可从市场上购买到，例如亚精胺、精胺、三-(2-氨基乙基)胺、苯二胺、二氨基乙烷(丙烷、丁烷、戊烷、己烷等)，或可以采用通常的方法合成得到，例如在市场上购买到的胺经氰乙基化作用得到，所述的胺为如二氨基乙烷(丙烷、丁烷、戊烷、己烷等)胺、亚精胺、精胺。
-使用的聚合物是市场上可购买到的固相肽合成(Merrifield合成)用的树脂，特别是O-氯代三苯甲基氯化物树脂、HMP树脂，它们提供有游离酸官能团的产品，或Rink类树脂。多氨基酸可以直接地用在固相上预合成的、带溴烷基官能团或w-醛酸的肽合成得到。
-双十八烷基胺、三乙胺、三氟乙酸、BOP、DMAP、氯代甲酸苄基酯是市售的产品。NaCl与NaHCO3溶液是饱和溶液，KHSO4溶液是0.5M。
b)物理测定质子NMR谱用Bruker 400与600MHZ光谱仪记录。
用API-MS/II测定质谱(MS)。
c)纯化与分析技术a)正相色谱条件-用厚度为0.2毫米的Merck硅胶板进行了薄层色谱分析(TLC)。
在UV(254nm)下显示，或对于胺或酰胺使用茚三酮显色，即在150℃加热蒸去(轻微喷洒)茚三酮乙醇溶液(40毫克/100毫升EtOH)，对于伯胺使用荧光胺显色，即蒸发溶液(40毫克/100毫升丙酮)，或在碘中通过形成碘粉斑而显色。
-用粒度0.063-0.200毫米的60 Merck硅胶进行了正相柱色谱分析。
b)分析性色谱技术使用Merck-Hitachi仪进行了分析性HPLC(高效液相色谱)，该仪器配置了D 2500 HITACHI积分-计算器、AS-2000A自动取样器、L-6200A智能泵和分析性分离时可调节波长至220 nm的L-4000紫外-可见光检测器。用于分析性分离的柱是Perkin-Elmer的BU-300 aquaporeButyl 7m，300×4.6mm柱。流动相是含有0.1％TFA的去离子水和含有0.1％TFA的乙腈。在100微升的环形阀中约1毫克/毫升溶液注入量是20微升。分析流量调节到1毫升/分。
分离条件溶剂A溶剂B去离子水 2500毫升HPLC用的乙腈2500毫升三氟乙酸2毫升三氟乙酸2.5毫升梯度
c)制备性色谱技术设备是一种能够进行UV测定的以梯度方式进行液相色谱的组合装置。该制备链由下述部分组成泵A配置50 SC头的GILSON 305型。
泵B配置50 SC头的GILSON 303型。
注射环配置25 SC头的GILSON 303型。
注射环配置25 SC头的GILSON 303型。
压力组件GILSON 806型。
混合器配置23毫升头的GILSON 811C型。
UV检测器配置制备室的GILSON 119型。
级份收集器配置21号架的GILSON 202型。
积分仪SHIMADZU C-R6A型。
柱长为25厘米、直径为2.2厘米的不锈钢C4柱(10毫米)，由VYDAC公司以214 TP 1022型号销售。
用注射泵以流量15毫升/分往柱中装待纯化产品的溶液。每30秒用一支管子收集洗脱液。将检测器的波长调节为220nm和235nm。
流动相以下述方式确定溶剂A 溶剂B去离子水 2500毫升HPLC用的乙腈2500毫升三氟乙酸2毫升 三氟乙酸2.5毫升梯度
d)固相肽合成技术(SPPS)在手工生产型SPPS肽合成手动反应器中进行固相合成，搅拌器是Flask Shaker A5-6021型搅拌器。采用Kaiser[Kaiser，E.，Colescolt，D.L.Bossinger，C.D.和Cook，P.I.Anal.Biochem.34(2)，595(1970)]试验跟踪多胺与固相连接过程及在SPPS中多胺的保护过程。在SPPS实施例中使用的树脂是NOVABIOCHEM的“Chlorotrityl chloride Resin”(氯代三苯甲基氯化物树脂)。
实施例实施例1从化合物RPR 120535(其制备方法在作为参考文献列出的WO 97/18185专利申请中描述过)合成化合物1(N-双十八烷基氨基甲酰基甲基-2-{3-[4-(3-胍基-丙基氨基)-丁基氨基]-丙基氨基}-乙酰胺)。
在附图的图1/15中列出了合成步骤。
将0.784毫摩尔RPR 120535溶解于25毫升甲醇中，该甲醇装在配有磁棒的烧杯中。往这种溶液添加10.21毫摩尔三乙胺TEA。然后，缓慢地(5分钟)往这种混合物倒入1.173毫摩尔O-甲基异脲/硫酸(H2SO4)在9毫升水中的溶液。在倒完之后，出现混浊。该混合物保持在40℃达16小时，然后将溶液蒸发至干。得到的产物再用制备性HPLC进行纯化。将有用的级份合并并冻干。
得到0.157毫摩尔成盐的化合物1，即产率为20.1％。
HPLC分析Rt＝14.94分。
1H NMR谱(400MHz，(CD3)2SO d6，δ以ppm为单位)0.86(t，J＝7Hz，6H脂肪链的CH3)，1.24(mt，60H脂肪链中心的(CH2)15)；1.43和1.53(2mt，每个2H每个脂肪链的1CH2)；1.63(mt，4H丁基中心的(CH2)2)；1.81和1.96(2mt，每个2H丙基中心的CH2)；2.85-3.10与3.22(2mt，共16H丁基的NCH2-丙基NCH2与脂肪链的NCH2)；3.81(宽s，2HNCH2CON)；4.03(d，J＝4.5Hz，2H甘氨酰的CONCH2CON)；7.32-7.97-8.62-8.75和9.02(分别为mf-t-t-mf与mf；H相应于可交换的质子)。
MH+＝863。
实施例2从化合物RPR 120527(其制备方法在作为参考文献列出的WO 97/18185专利中请中描述过)合成化合物2(2-{2-[双-(2-胍基-乙基)-氨基]-乙基氨基}-N，N-双十八烷基-乙酰胺)。
将48微摩尔RPR 120527溶解于10毫升甲醇中，然后，添加85微升DIEA(10当量)和32毫克1，3-双-(叔丁氧基羰基)-2-甲基-2-硫代假脲(2.3当量)。采用HPLC跟踪该反应。在24小时之后，蒸去溶剂，往得到的残余物添加20毫升TFA/二氯甲烷溶液(以体积计为1∶1)。在真空下蒸发之后，其残余物用制备/性HPLC进行纯化。将有用的级份混合，在液氮中冷冻，再冻干。
这样得到0.035毫摩尔化合物2，即产率为73％。
分析性HPLCRt＝16.20分。
1H NMR谱(400MHz，(CD3)2SO d6，δ以ppm为单位)0.9(m∶6H∶CH3)，1.2(m∶60H∶CH2)，1.6(m∶4H∶CH2CH2N)，2.7-2.9(m∶6H∶CH2N(CH2)2)，3.0(m∶2H∶CH2CH2N(CH2)2)，3.2(m∶8H∶CH2N)，3.8(m∶4H∶CH2NCOCH2N)。
MH+＝793。
实施例3从化合物RPR 122766(其制备方法在作为参考文献列出的WO 97/18185专利申请中描述过)合成化合物3(N-双十四烷基氨基甲酰基甲基-2-{3-[4-(3-胍基-丙基氨基)-丁基氨基]-丙基氨基}-乙酰胺))。
将0.784毫摩尔RPR 122766溶解于25毫升甲醇中，该甲醇装在配有磁棒的烧杯中。往这种溶液添加10.21毫摩尔三乙胺TEA。然后，缓慢地(5分钟)往这种混合物倒入1.173毫摩尔O-甲基异脲/硫酸(H2SO4)在9毫升水中的溶液。在倒完之后，出现混浊。该混合物保持在40℃达16小时，然后将溶液蒸发至于。得到的产物再用制备性HPLC进行纯化。将有用的级份合并并冻干。
这样得到0.2289毫摩尔化合物3，即产率为29％。
分析性HPLCRt＝9.8分。
1H NMR谱(400MHz，(CD3)2SO d6，δ以ppm为单位)0.87(t，J＝7Hz，6H脂肪链的CH3)，1.15-1.40(mt，44H脂肪链中心的(CH2)11)；1.46和1.55(2mt，每个2H每个脂肪链的1CH2)；1.63(mt，4H丁基中心的(CH2)2)；1.81和1.95(2mt，每个2H丙基中心的CH2)；2.85-3.10(mt，10H丁基的2NCH2-2个丙基之一的2NCH2-另一个丙基的2NCH2中的一个)；3.15-3.25(mt，6H另一个丙基的另一NCH2和脂肪链的NCH2)；3.82(mf，2HNCH2CON)；4.04(d，J＝5Hz，2H甘氨酰的CONCH2CON)；7.00-7.60-8.60-8.75和9.00(分别为扁平的mf与2mf，3H-5H与2HNH3+CF3COO--NH2+CFCOO-与＝NH)；7.78(宽t，J＝5.5Hz，1HN＝CNH)；8.65(mf相应于CONH的1H).
MH+＝751。
实施例4化合物4(2-{2-[双-(2-胍基-乙基)-氨基]-乙基氨基}-N-双十四烷基氨基甲酰基甲基-乙酰胺)的合成步骤A将过量10摩尔的三(氨基乙基)胺溶于50毫升二氯甲烷中，再将这种溶液加到装有溴代乙酰(氯)三苯甲基树脂(预先通过溴代乙酸与氯代三苯甲基树脂反应得到)的反应器中。该反应器在室温下搅拌2小时，过滤溶剂，树脂每次用50毫升二氯甲烷和异丙醇洗涤10次。Kaiser试验是阳性的。
步骤B得到的树脂与溶于二氯甲烷的过量10当量的1，3-双-(叔丁氧基羰基)-2-甲基-e-硫代假脲在搅拌下接触24小时，过滤掉溶剂，树脂每次用50毫升二氯甲烷和异丙醇洗涤10次。冷却3分钟的Kaiser试验是阴性的。
步骤C将50毫摩尔DIEA溶于50毫升二氯甲烷中，再将混合物加到装有在步骤B所得到的产物的反应器中。然后，倒入48毫摩尔二碳酸二叔丁酯。反应器搅拌一夜。次日，Kaiser试验是阴性的。过滤掉溶剂，树脂每次用50毫升二氯甲烷和异丙醇洗涤10次，50毫升甲醇2次和50毫升醚2次，树脂再在氮气流下干燥。Kaiser试验总是阴性的。
步骤D将在步骤C所得到的树脂加到配有磁棒的250毫升烧瓶中。往其加入由50毫升二氯甲烷与25毫升1，1，1-三氟乙-2-醇组成的溶液，将该混合物搅拌2小时。过滤溶液，树脂每次用10毫升二氯甲烷洗涤2次。合并这样得到的有机相，并在真空下蒸发。产物再采用硅胶纯化(洗脱剂∶氯仿/甲醇，以体积计为8∶2)。合并有用的级份，然后在真空下蒸发得到168毫克具有下述结构的产物
即产率为20％。
TLCRf＝0.9MH+＝789。
步骤E将9毫摩尔Boc-甘氨酰-二-十四烷基胺加入有磁棒的烧瓶中。加入温度为4℃的30毫升三氟乙酸。将该溶液搅拌一小时，在真空下蒸去TFA。所得到的产物重新用70毫升DMF溶解，然后加入30毫摩尔TEA与9毫摩尔前面所得到的酸。将其pH调节到10，添加33毫摩尔BOP。搅拌该溶液2小时，并采用TLC跟踪。当完成连接时，添加700毫升硫酸钾溶液，再每次用100毫升乙酸乙酯提取产物3次。有机相每次用50毫升硫酸钾洗涤3次，50毫升碳酸钠3次，及50毫升氯化钠3次。然后有机相用硫酸镁进行干燥，过滤与真空蒸发。所得到的产物用NMR、TLC及MS进行分析，并用50毫升TFA去保护，TFA添加到没有预先纯化的所得到的产物中。然后搅拌该溶液1.5小时。最后，蒸去TFA，最后的产物用半制备性HPLC进行纯化。
最后得到8.1毫摩尔化合物4，即这个最后步骤的产率为90％。
分析性HPLCRt＝11.4分1H NMR谱(400MHz，(CD3)2SO d6，δ以ppm为单位)0.89(t，J＝7Hz，6H脂肪链的CH3)，1.15-1.35(mt，44H脂肪链中心的(CH2)11)；1.45和1.54(2mts，每个2H每个脂肪链的1CH2)；2.65-2.78-3.06与3.23(分别t，J＝6.5Hz-宽t，J＝6,5Hz-mf与mt，分别4H-2H-2H与8HNCH2CH2N-2NCH2CH2NC＝N与脂肪链的NCH2)；3.83(宽s，2HNCH2CON)；4.04(d，J＝5Hz，2H甘氨酰的CONCH2CON)；7.34(扁平mf，＝NH与NH2)；7.61(t，J＝5.5Hz，2HNH)；8.65(t，J＝5Hz，1HNH)；8.75(mfNH)。
MH+＝737。
步骤E中使用的甘氨酰-二-十四烷基胺预先由下述方法得到将10毫摩尔用取代基Boc保护的甘氨酸与10毫摩尔二-十四烷基胺加到250毫升烧瓶中。往其加入100毫升氯仿，搅拌混合物直到完全溶解。然后加入30毫摩尔TEA与33毫摩尔BOP。借助三乙胺将pH保持在10。搅拌反应2小时。当用TLC跟踪反应完成时，蒸去氯仿。得到的固体再溶于300毫升乙酸乙酯中，有机相再每次用100毫升硫酸钾洗涤4次，100毫升碳酸钠4次及100毫升氯化钠4次。然后有机相用硫酸镁干燥，过滤与真空蒸发。所得到的产物采用TLC、NMR与MS分析，不经其他纯化便可使用。
实施例5化合物5(N-双十四烷基氨基甲酰基甲基-2-{(3-胍基-丙基)-[4-(3-胍基-丙基氨基)-丁基]-氨基}-乙酰胺)的合成与前面化合物4的同样方法进行操作，但是用精胺作为原料多胺得到具有下述结构的酸
在从树脂上裂解之后，这种残留物用硅胶进行纯化(洗脱剂∶氯仿/甲醇，以体积计为8∶2)。将有用的级份混合起来，然后在真空下蒸发，得到0.69毫摩尔所述的分子，即产率为50％。
TLCRf＝0.5。
MH+＝845。
将前面合成的酸与根据与实施例4描述的同样方法得到的甘氨酰-双十四烷基胺连接得到化合物5。甘氨酰-双十四烷基胺还可以用与前面同样的方法得到。
这样得到0.65毫摩尔化合物5，即这个步骤的产率为94％。
分析性HPLCRt＝10.1分。
1H NMR谱(400MHz，(CD3)2SO d6，温度为393K，δ以ppm为单位)0.92(t，J＝7Hz，6H脂肪链的CH3)；1.25-1.45(mt，44H脂肪链中心的(CH2)11)；1.57(mt，4H丁基中心的2CH2)；1.57与1.67(2mt，每个2H每个脂肪链的1CH2)；1.74与1.91(2mt，每个2H丙基中心的CH2)；2.62-2.85与3.20-3.35(3mt，共16HNCH2-、CH2NC＝N与脂肪链的NCH2)；3.17(s，2HNCH2CON)；4.02(d，J＝5Hz，2H甘氨酰的CONCH2CON)；6.89与7.30-7.55和7.65(分别mf-扁平的mf与mf可交换的H)。
MH+＝845。
实施例6化合物6(2-{(3-[{4-[双-(3-胍基-丙基)-氨基]-丁基}-(3-胍基-丙基)-氨基]-丙基氨基}-N-双十四烷基氨基甲酰基甲基-乙酰胺)的合成以与前面化合物4和5同样的方式操作，但是用N，N，N′，N′-(四氨基丙基)丁二胺作为原料多胺得到具有下述结构的酸
在从树脂上裂解之后，得到的残留物用硅胶进行纯化(洗脱剂∶氯仿/甲醇，以体积计为8∶2)。将有用的级份混合起来，然后在真空下蒸发，得到0.099毫摩尔产物，即产率为20％。
TLCRf＝0.3。
MH+＝1201。
将前面合成的酸和根据与实施例4描述的同样方法得到的甘氨酰-双十四烷基胺连接得到化合物6。甘氨酰-双十四烷基胺还可以用与前面同样的方法得到。
这样得到0.09毫摩尔化合物6，即这个步骤的产率为90％。
分析性HPLCRt＝11.2分。
1H NMR谱(400MHz，(CD3)2SO d6，添加几滴CD3COODd4，δ以ppm为单位)0.87(t，J＝7Hz，6H脂肪链的CH3)；1.20-1.40(mt，44H脂肪链中心的(CH2)11)；1.45与1.54(2mt，每个2H每个脂肪链的1CH2)；1.67(mt，4H丁基中心的CH2)；1.80-2.10(mt，8H丙基中心的CH2)；2.95-3.30(mt，20H丙基的NCH2与丁基的NCH2)；3.15-3.30(mt，4H脂肪链的NCH2)；3.84(s，2HNCH2CON)；4.05(s，2H甘氨酰的CONCH2CON)。
MH+＝949。
实施例7化合物1在遗传物质体外转染中的应用使用的遗传物质使用的核酸是pXL2774质粒(WO 97/10343)，它包含在人的巨细胞病毒(CMV)启动子控制下的荧光素酶编码基因。
核酸溶液在生理血清中(氯化钠0.15M NaCl)稀释到20微克/毫升。
转染溶液(临时制备)将本发明中描述的产品制成水溶液，浓度为60-240μM，与DNA溶液以等体积比混合。最后的盐浓度是75mM。
转染在24孔(2平方厘米/孔)微板中在适当的条件下培养细胞，在细胞达到指数生长阶段并融合达50-70％时进行转染。
这些细胞每次用500微升贫含血清蛋白的介质洗涤2次，然后，或者在无血清培养基中[在没有血清的情况下转染]，或者在完全培养基中[在血清存在的情况下转染]再进行生长。将50微升转染混合物[即0.5微克DNA/孔]加到细胞中[3个孔/载体-DNA条件]。当在没有血清存在的情况下细胞被转染时，在转染2小时后生长培养基中要补充适当量的血清。
根据Promega试剂盒[荧光素酶检测系统]所给出的使用说明，通过测定荧光素酶的表达可评价转染48小时之后的转染效率。通过测定细胞溶胞裂解物中蛋白浓度可估算出转染混合物的毒性。
结果使用化合物1作为DNA载体转染三种不同细胞系NIH3T3细胞、HepG2细胞与HeLa细胞，与RPR 120535阳离子脂类(TFA盐)[作为参考文献列入的WO 97/18185专利申请中描述的]进行比较。对于这三种细胞，我们未发现如实施例1中所述制备的化合物1有显著的毒性。在三种细胞中化合物1与对比阳离子脂类的转染效率示于图2/15中，化合物纳摩尔/DNA微克之比为3-12。
由图2/15可以得出，对于NIH3T3细胞，阳离子脂类纳摩尔/DNA微克之比为6时，对于HeLa细胞与HepG2细胞，阳离子脂类纳摩尔/DNA微克之比为9时，可达到最大的转染效率。对于在没有血清情况下的转染，在HeLa细胞与HepG2细胞中达到的表达水平，化合物1比对比试验产品高2-4倍。
图3/15表示了化合物1/DNA复合物的转染效率，还与前面描述的同样的阳离子脂类(RPR120535)与DNA的复合物进行比较。白色条表示在没有血清存在下在2小时内核酸脂类复合物的转染效率。黑色条表示在血清存在下核酸脂类复合物的转染效率。
由图3/15因此可以证明本发明转移剂的一个特别的优点。事实上，观察到在有或没有血清蛋白时的转染水平在本发明化合物1的情况下都是相同的，而使用对比的阳离子脂类，观察到因血清蛋白存在而受到强烈的抑制。这对于体内转染来说是一个特别有意义的性质。
实施例8化合物2、3、5和6在遗传物质体外转染中的应用使用的遗传物质使用的核酸是pXL3031质粒，它包含在人的巨细胞病毒(CMV)启动子控制下荧光素酶编码基因。该pXL3031质粒示于图15/15。根据本领域技术人员已知的标准方案，特别是根据Maniatis T.，Fritsch E.F.和Sambrook，分子生物学方法实验室手册，1982年，第83-94页，Cold Spring Harbor Lab.，NY.的方案分离该质粒。
更具体地，使用的方法是碱溶胞方法和氯化铯梯度纯化方法。
转染
在24孔微板中在适当的条件下培养这些细胞。在生长一夜之后，每个孔含有约100 000个细胞。
在每个孔中，加入转染混合物，该混合物含有在0.5毫升DMEM中的1微克DNA，没有血清。在转染之后5小时，往生长培养基中补充适当量的血清(DMEM与10％牛胎血清)。在转染24小时后回收细胞裂解产物，根据Promega试剂盒[荧光素酶检测试剂盒]所给出的使用说明，通过测定荧光素酶的表达可评价转染效率。
结果在图4/15、5/15、6/15与7/15中示出了转染水平。
每次测定呈微团形式和与辅脂类(DOPE或胆固醇)混合物形式的质类转染效率。由这些表可以得出，转染水平是非常高的，甚至电荷比非常低时也是如此，由此得出在毒性方面有益的结果。这是本发明化合物的一个优点。事实上，使用不含有脒官能团的阳离子脂类，为达到这样的转染水平往往必需将电荷比调到更高，这样一般会引起毒性增高。
实施例9化合物2、3、5和6对DNA亲和力的研究如前面实施例所描述的，使用的核酸是pXL3031质粒。
在浓度为0.25毫克DNA/毫升下，根据所要求的电荷比，使用适当量的如本发明所定义的脂类制备复合物。在含有5％葡萄糖和20mM氯化钠溶液的介质中制备该复合物。然后将50微升核酸脂类复合物稀释在950微升含有5％葡萄糖和20mM氯化钠溶液的溶液中，稀释20倍。
复合物的尺寸可借助Coulter N4+仪器通过光的动力学散射测定流体动力学直径而得出。
对于所有的化合物，根据电荷比证明了3种不同的物理-化学相-A相，其中DNA未被阳离子脂类饱和，即在混合物中还有裸露的DNA，这意味着DNA没有完全地被脂类保护，因此可能被酶降解。所生成的复合物总体上为负电荷，这样使其难以通过细胞膜。因此优选的是DNA转染不应处在这个区域。
-B相，其中DNA完全被阳离子脂类饱和，复合物总体上是中性的或稍微阳性。由于离子排斥作用最大，这个相是不稳定的。可能出现“交联”现象，因此导致复合物沉淀。处于这种状态的复合物因此不可能在注射中使用。
-C相，其中DNA被脂类过饱和，因此复合物总体上是阳性的。这样DNA完全被脂类保护了，它通过细胞膜(总体上为负电荷)是较容易的。因此C相的复合物特别适合在细胞中核酸转移的应用。
这些表明各相的表在图8/15、9/15、10/15与11/15中示出，表明复合物根据电荷比不同所处的相。
图8/15、9/15、10/15与11/15中的这些表，根据电荷比比较了本发明化合物和它们的胺类似物，胺类似物即为脒官能团或胍官能团被氨基官能团取代的阳离子脂类。可看到B相向电荷比低得多的方向移动。这样，在阳离子头上加入脒官能团可使化合物对DNA的亲和力增加作出贡献。这是本发明化合物的一个重要性质，因为与DNA生成的复合物可以在C相中使用，而对此并不必定位在非常高的电荷比，由此得到在毒性方面有益的效果。
还可以通过在添加溴化乙锭之后测定荧光降低来评价本发明化合物对DNA的亲和力。事实上，用脂类取代DNA的溴化乙锭是一种与DNA结合的指示。
这样，往制备的复合物中添加4微升1毫克/毫升溴化乙锭溶液，然后在激发波长260nm处和发射波长590nm处测定荧光。仅有DNA时所得到的荧光规定为100％。
在图12/15、13/15与14/15的表中列出了这些结果。这些结果表明本发明的化合物对DNA具有非常好的亲和力，这是本发明化合物所具有的特别有意义的性质。
权利要求
1.具有下述通式(I)的呈D、L或DL形式的脂多胺，以及它们的盐
式中-R1、R2和R3各自代表氢原子或-(CH2)q-NRR′，其中·q是包括1和6在内的1-6中的整数，q值在不同R1、R2和R3基团之间是彼此不相关的，·R和R′各自代表氢原子或下述化学式(II)基团
式中r是包括0和6在内0-6中的整数，R5各自代表氢原子或烃残基，条件是R1、R2和R3基团中至少一个基团含有至少一个化学式(II)基团，-m和n各自代表包括1和6在内的1-6中的整数，当n大于1时，m可以取不同的值，而R3在通式(I)中可具有不同的含意，-p代表包括1和6在内的1-6中的整数，以及-R4代表具有下述通式(III)的基团
式中·R7和R8各自代表氢原子或亲脂基团，R7和R8基团中至少一个基团不是氢，·t是包括0和10在内的0-10中的整数，当t是大于1的整数时，R6、X、Y和s在不同的结构单元[X-(CHR6)s-Y]中可以具有不同的含意，·X代表氧原子或硫原子，或氨基或烷基氨基，烷基取代基是直链或支链的并含有1-8个碳原子，·Y代表羰基或亚甲基，·R6代表氢原子或任选被取代的天然氨基酸侧链，以及·s代表包括1和10在内的1-10中的整数，并且当s等于1时，R6代表任选被取代的天然氨基酸侧链，当s大于1时，R6代表氢原子。
2.根据权利要求1的化合物，其特征在于在化学式(II)基团中，R5是氢原子或任选卤代的脂族或芳族烃残基。
3.根据权利要求2的化合物，其特征在于在化学式(II)中，其中一个R5基团是氢原子，另一个是含有1-10个碳原子的脂族残基，或优选地选自苄基及其衍生物的芳族残基。
4.根据权利要求2的化合物，其特征在于在化学式(II)中，两个R5基团都是氢原子。
5.根据上述权利要求中任一项的化合物，其特征在于当R1、R2和/或R3不是氢并含有化学式(II)时，q的值为2或3，而r为0。
6.根据上述权利要求中任一项的化合物，其特征在于在通式(I)中，m选自2、3和4。
7.根据上述权利要求中任一项的化合物，其特征在于在化学式(III)中，R7和R8基团中至少一个代表由一个或多个脂族脂肪链、类固醇衍生物、天然的或合成的脂类、或它们的组合构成的亲脂基团。
8.根据权利要求7所述的化合物，其特征在于亲脂基团为含有5-22个碳原子的饱和或未饱和的、直链或支链的任选被卤代的脂族基团。
9.根据权利要求7所述的化合物，其特征在于亲脂基团为类固醇衍生物，该类固醇衍生物选自胆固醇、胆甾烷醇、3-α-5-环-5-α-胆甾烷-6-β-醇、胆酸、胆固醇甲酸酯、胆甾烷醇甲酸酯、3α-5-环-5α-胆甾烷-6-β-醇甲酸酯、胆甾烯基胺、6-(1，5-二甲基己基)-3a，5a-二甲基十六氢环戊二烯并[a]环丙并[2，3]环戊二烯并[1，2]萘-10-基胺，或胆甾烷基胺。
10.根据权利要求7所述的化合物，其特征在于亲脂基团为(CH2)u-NH-R9基团，式中u是包括2和6在内的2-6的整数，R9是酰基，例如胆固醇甲酸酯、花生四烯酰基或胆酸。
11.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于R7和R8两个基团都代表亲脂基团。
12.根据权利要求11所述的化合物，其特征在于R7和R8两个基团都代表含有5-22个碳原子，优选地12-22个碳原子的脂族链。
13.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于R1含有化学式(II)的基团，而R2和R3是氢原子。
14.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于R1和R2每个都含有化学式(II)的基团，而R3是氢原子。
15.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于R1和R3每个都含有化学式(II)的基团，而R2是氢原子。
16.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于R1、R2和R3每个都含有化学式(II)的基团。
17.根据上述权利要求中任一项的化合物，其特征在于它与细胞外或细胞内的靶向元件结合。
18.根据权利要求17所述的化合物，其特征在于它在R6氨基酸侧链上加入靶向元件。
19.根据上述权利要求中任一项的化合物，其特征在于它在R6氨基酸侧链上加入生物素、罗丹明、叶酸类标记剂，或加入含有Arg-Gly-Asp表位的直链或环状肽序列或假肽序列。
20.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于它选自下述化学式的化合物，式中R4和R5具有在权利要求1中所给出的意义
21.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于它选自
化合物3
化合物4
化合物5
化合物6
22.含有上述权利要求中任一项所述的化合物及核酸的组合物。
23.根据权利要求22所述的组合物，其特征在于它还含有一种或多种添加剂。
24.根据权利要求23所述的组合物，其特征在于添加剂是一种或多种中性脂类。
25.根据权利要求23或24所述的组合物，其特征在于中性脂类是具有两个脂肪链的脂类。
26.根据权利要求23-25之一所述的组合物，其特征在于中性脂类是在生理条件下为两性离子或没有离子电荷的天然或合成的脂类，它们例如选自二油酰基磷脂酰基乙醇胺(DOPE)、油酰基棕榈酰基磷脂酰基乙醇胺(POPE)、二硬脂酰基-、二棕榈酰基-、二肉豆蔻酰基磷脂酰基乙醇胺以及它们的1-3次N-甲基衍生物、磷脂酰基甘油、二酰基甘油、糖基二酰基甘油、脑苷脂类(特别如半乳糖脑苷脂类)、鞘脂类(特别例如鞘磷脂)，或脱唾液酸神经节苷脂(特别例如是脱唾液酸GM1和GM2)。
27.根据权利要求23所述的组合物，其特征在于添加剂是一种直接或非直接地参与核酸聚集的化合物。
28.根据权利要求23-25所述的组合物，其特征在于所述的添加剂全部或部分来自鱼精蛋白、组蛋白或核仁素和/或一种它们的衍生物，或全部或部分由肽结构单元(KTPKKAKKP)和/或(ATPAKKAA)构成，结构单元数可以是2-10，这些结构单元可以连续地或非连续地重复。
29.根据权利要求22所述的组合物，其特征在于它还含有靶向元件。
30.根据权利要求22-29之一所述的组合物，其特征在于它还含有用于注射制剂的药学上可接受的赋形剂。
31.根据权利要求22-29之一所述的组合物，其特征在于它含有用于皮肤和/或粘膜施用的药学上可接受的赋形剂。
32.根据权利要求1-21之一所述的化合物的向细胞中转移核酸的应用。
33.如权利要求1-21所限定化合物的制备方法，其特征在于通过脲的硫代或氧代衍生物与脂多胺反应生成脒基团，或其特征在于通过肽偶联在脂类上接枝多氨基脒。
34.向细胞中转移核酸的方法，其特征在于该方法包括下述步骤(1)让核酸与如权利要求1-21中限定的化合物和必要时的一种或多种添加剂和/或靶向元件接触，形成一种复合物，(2)让细胞与(1)中生成的复合物接触。
全文摘要
本发明涉及用于细胞中转移核酸的新化合物。更具体地,这些新化合物属于脂多胺类,它们含有脒官能团。这些化合物可用于向不同种类的细胞中转移目的核酸,在体外、在体内或离体均可。
文档编号C07C279/12GK1257480SQ9880547
公开日2000年6月21日 申请日期1998年5月25日 优先权日1997年5月28日
发明者G·柏克, C·都伯特莱特, D·舍曼 申请人:罗纳-布朗克罗莱尔股份有限公司