进行细胞裂解和核酸提取的装置的制作方法

专利名称：进行细胞裂解和核酸提取的装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于联合进行细胞裂解和核酸(NA)提取的整合式芯片实验室 (lab-on-a-chip)诊断装置。该系统可以用于从含有细胞和/或颗粒的测试样品中提取核 酸。
背景技术：
对细菌细胞和病毒颗粒的DNA和/或RNA的分析是很多技术领域如例如诊断学、 环境监测、法庭辩论和分子生物学研究中的关键步骤。为了分析含有核酸的样品，通常需要 进行两个步骤。首先，对样品进行破碎、分离和浓縮以产生纯化的核酸提取物。其次，扩增 纯化的核酸提取物以增加存在的核酸量，以利于核酸的检测。 常规地，核酸的提取、纯化和扩增是在实验室由经过训练的技术人员手动进行的。
这不仅需要有技术熟练的使用者，还由于使用者错误而导致显著的错误率。另外，这种常规
提取使得提取、纯化和扩增无法在现场即时进行，因此，生物测定的结果被推迟。因此，需要
提供生物测定，其降低和简化使用者输入，并使得测定可在实际取样的时间和地点进行，例
如在医生的手术室、诊所、兽医的手术室、甚至在患者的家中或者野外。 微制造的"芯片实验室"装置是进行完备的(contained)生物反应的有吸引力的
选择。这些装置需要使用者进行尽可能少的试剂操作，并且允许使用小样品体积，这对于需
要昂贵试剂的生物反应而言是一个显著的优点。 之前的一个提供微制造"芯片实验室"装置来提取和纯化含核酸的样品的方法在 W0 2005/073691中描述。在该文献中，过滤含有细胞和/或颗粒的样品。将滤液(即细胞 和/或颗粒)通过裂解流体进行裂解。然后，使已裂解的样品通过核酸提取单元。核酸被提 取并保留在提取单元中，而裂解液流出该单元。合适的核酸提取方法的实例涉及在离液剂 存在下使DNA结合到二氧化硅颗粒上(见Boom等J. Clin. Microbiol. 1990， 28， 495-503)。 将提出的核酸用一次或多次洗涤溶剂洗涤，然后用洗脱液提取核酸。这个步骤也用于浓縮 核酸。 W0 2005/073691描述了如何在样品被注射到系统中之后用单个泵驱动系统中的 所有流体。W0 2005/073691还描述了完成它的一种方法，即在由气隙分隔的单个通道中提 供裂解流体、洗涤流体和洗脱液。 当核酸被提取、浓縮和纯化后，然后通常需要对其进行扩增。通常使用聚合酶链 式反应(PCR)技术，而在一些情况下可以使用的另一种扩增技术是基于核酸序列的扩增 (NASBA)。本领域技术人员会理解，NASBA与PCR存在若干差异。尤其是，PCR涉及样品的热 循环，通常只产生DNA扩增产物，而NASBA是等温技术，通常用于产生RNA扩增产物。
W0 02/22265中描述了特别设计用于进行NASBA的微制造系统。此系统包括两个 室。第一室加热样品，使其变性并且促进引物与变性样品的结合。第二室含有NASBA酶并
且等温加热样品至约4rc的温度。 为进行扩增，有必要将核酸样品与引物混合。这些引物需要存在混合流体。此流
5体可包括匿SO和山梨糖醇中的一种或两种。在W0 02/22265中，描述了如何将该流体预装 入第一室中，并在第一室中将样品与流体混合。

发明内容
本发明提供用于进行细胞裂解和核酸(优选mRNA)提取的改进的整合式装置，该 装置预装有细胞裂解和核酸提取所需的试剂。本发明装置的特征在于多种预装的试剂以 可精确控制并可通过单个泵驱动的方式装入。特别地，使用变位阀(variable position valve)与一套平行的流体储器相组合来容纳预装试剂，这使得可以通过单泵精确可靠地驱 动流体。作为补充或替代，所述装置的特征在于该装置包括用于在提取和纯化核酸样品之 后和将样品运送到核酸扩增单元之前将样品与溶剂进行混合的部件。 因此，本发明提供用于对含细胞和/或颗粒的流体样品进行核酸提取过程的整合
式芯片实验室装置，所述装置包括 (a)用于装载流体样品的样品入口 ； (b)用于裂解流体样品中存在的细胞和/或颗粒的裂解单元；
(c)用于该裂解单元的裂解流体储器；
(d)裂解单元下游的核酸提取单元；禾口 (e)用于该核酸提取单元的第一洗涤缓冲液和洗脱流体的储器，该装置还包括
(f)核酸提取单元下游的混合单元；禾口
(g)用于该混合单元的混合流体源。 在第二方面，本发明提供用于对含细胞和/或颗粒的流体样品进行核酸提取过程 的整合式芯片实验室装置，该装置包括
(a)用于装载流体样品的样品入口 ； (b)用于裂解流体样品中存在的细胞和/或颗粒的裂解单元；
(c)用于该裂解单元的裂解流体储器；
(d)裂解单元下游的核酸提取单元；禾口 (e)用于该核酸提取单元的第一洗涤缓冲液和洗脱流体的储器，其中所述裂解流 体、第一洗涤缓冲液和洗脱流体的储器平行排列，每个储器具有上端和下端，其中该装置还 包括 (h)与裂解流体、第一洗涤缓冲液和洗脱流体之储器的上端连接的上变位阀，
(i)与上变位阀连接接的泵， (j)与上述至少三个流体储器的下端连接的下变位阀，
(k)连接下变位阀与裂解单元的第一驱动通道，禾口
(1)连接下变位阀与核酸提取单元的第二驱动通道。 第二方面的特征可以与第一方面分开使用，或者可以与第一方面的特征相组合。
在第三方面，本发明提供用于对含细胞和/或颗粒的流体样品进行核酸提取以及 核酸序列的扩增和检测过程的整合式芯片实验室诊断系统，所述系统包括根据本发明第一 或第二方面的核酸提取装置以及核酸扩增单元。 在第四方面，本发明提供了使用整合式芯片实验室装置对含细胞和/或颗粒的流 体样品进行核酸提取过程的方法，所述方法包括
(i)提供整合式芯片实验室装置，其包括样品入口 ，裂解单元，核酸提取单元，混合 单元，以及裂解流体、第一洗涤缓冲液、洗脱流体和混合流体的储器；
(ii)通过该装置的样品入口装入样品； (iii)通过使来自裂解流体储器的裂解流体经过细胞和/或颗粒而对样品中的细 胞和/或颗粒进行裂解， (iv)使裂解流体经过核酸提取单元以提取核酸； (v)运送来自第一洗涤缓冲液储器的第一洗涤缓冲液经过核酸提取单元； (vi)运送来自洗脱液储器的洗脱流体经过核酸提取单元，以产生来自核酸提取单
元的洗脱样品；禾口 (vii)在混合单元中将洗脱样品与混合流体混合。 第一或第二方面的装置或第三方面的系统可以用于这种方法中。 在第五方面，本发明提供了使用整合式芯片实验室装置对含细胞和/或颗粒的流
体样品进行核酸提取过程的方法，所述方法包括 (i)提供整合式芯片实验室装置，其包括样品入口 ，裂解单元，核酸提取单元，混合 单元，和裂解流体、第一洗涤缓冲液、洗脱流体和混合流体的储器；
(ii)通过该装置的样品入口装入样品； (iii)通过使来自裂解流体储器的裂解流体经过细胞和/或颗粒来对样品中经过 滤的细胞和/或颗粒进行裂解， (iv)使裂解流体经过核酸提取单元以提取核酸；禾口 (v)运送来自第一洗涤缓冲液储器的第一洗涤缓冲液经过核酸提取单元；禾口
(vi)运送来自洗脱液储器的洗脱流体经过核酸提取单元，以产生来自核酸提取单 元的洗脱样品， 其中所述裂解流体、第一洗涤缓冲液和洗脱流体由单个泵驱动。 该第五方面的特征可以与第四方面分开使用，或者可以与第四方面的特征相组
合。第一或第二方面的装置或者第三方面的系统可用于这种方法中。


参考下列附图描述本发明。这些图用作本发明的实例。 图1和2提供本发明装置的示意图。 图3显示试剂存储储器的平行排列。 图4和5显示混合单元之构造的实例。 图6是可在本发明装置中进行的过程的实例的分步指南。 图7是示例性核酸扩增系统。 图8显示本发明的一个详细实例。 图9显示本发明混合单元的一个详细实例。 发明详述 本发明提供用于进行完整的样品制备方法的整合式芯片实验室装置。所述装置可 用于进行核酸扩增和检测的微制造反应室系统之中，或与其结合使用，或与其整体成形。 本发明的发明人认识到了使用WO 2005/073691中所述系统在扩增前制备核酸样品的优势。本发明人还注意到，WO 02/22265提供了用于实施核酸扩增反应(尤其是NASBA) 的方便的微制造系统。但是，当试图将如WO 2005/073691中所述的样品制备系统与如WO 02/22265中所述的扩增系统相结合时，本发明人发现，与大规模实验所预计的相比，有时结 合后的系统显示特异性和效率降低。 本发明人发现，这种特异性降低意外地是由扩增反应的引物本身所导致的。尤其， WO 02/22265要求在装载样品之前将所有用于扩增反应的试剂预装到其微制造系统中。尽 管本发明人认识到，这种方法有利是因为其简化扩增系统的制造和操作，但本发明人发现， 预装一种特定试剂尤其可降低扩增反应的特异性。这种特定的试剂是在扩增中用来使引物 溶剂化并将它们与样品混合的混合流体。 不希望被理论所限，认为混合溶剂帮助使扩增中所用引物分子溶剂化，以使得引 物分子完全延伸。如果不使用混合溶剂，则引物分子不完全延伸，因此它们结合特异性将下 降。本发明人发现，这在可用匿S0/山梨糖醇混合物使NASBA引物溶剂化的NASBA中尤其 成为一个问题。 因此，发明人寻找了其他方法来提供混合流体。本发明人发现，通过在核酸提取和 纯化之后以及在样品运送至核酸扩增单元之前将混合流体与核酸样品混合，可以提高引物 与样品的结合特异性。 因此，在第一方面中，本发明提供用于对含细胞和/或颗粒的流体样品实施核酸 提取方法的整合式芯片实验室装置，该装置包括
(a)用于装入流体样品的样品入口 ；
(b)样品入口下游的可选的过滤单元； (c)用于裂解流体样品中所存在的细胞和/或颗粒的裂解单元，其与过滤单元(如 果存在的话)整合在一起，或者在过滤单元的下游；
(d)用于该裂解单元的裂解流体储器；
(e)裂解单元下游的核酸提取单元；禾口 (f)用于该核酸提取单元的第一洗涤缓冲液和洗脱流体的储器，此装置还包括
(g)核酸提取单元下游的混合单元；禾口
(h)用于该混合单元的混合流体源。 发明人还认识到使用单个泵来驱动WO 2005/073691之装置中的预装试剂的优 势。尤其，单泵的使用提供了简化的微制造测定。W0 2005/073691提出了将其系统设计成 可使用单泵的一种方法是，在具有气隙的单个通道中将裂解流体、洗涤流体和洗脱液分隔 开。但是，本发明的发明人发现，当使用这种方法时，不同的流体有汇合的趋势。这在使用 通常用作洗涤溶剂的低表面能溶剂如醇(包括乙醇和异丙醇)时尤其是一个问题。
因此，在第二方面，本发明提供了对含细胞和/或颗粒的流体样品实施核酸提取 方法的整合式芯片实验室装置，该装置具有特定的试剂存储单元，用于预装和控制其试剂 的移动，所述装置包括 (a)用于装入流体样品的样品入口 ；
(b)样品入口下游的可选的过滤单元； (c)用于裂解流体样品中所存在的细胞和/或颗粒的裂解单元，其与过滤单元(如 果存在的话)整合在一起，或者在过滤单元的下游；
8
(d)用于该裂解单元的裂解流体储器；
(e)裂解单元下游的核酸提取单元；禾口 (f)用于该核酸提取单元的第一洗涤缓冲液和洗脱流体的储器，其中所述裂解流 体、第一洗涤缓冲液和洗脱流体的储器平行排列，每个储器具有上端和下端，其中该装置还 包括 (i)与裂解流体、第一洗涤缓冲液和洗脱流体之储器的上端连接的上变位阀；
(g)与该上变位阀连接的泵； (h)与所述至少三个流体储器的下端连接的下变位阀；
(j)连接下变位阀与裂解单元的第一驱动通道；禾口
(k)连接下变位阀与核酸提取单元的第二驱动通道。
第二方面的特征可以用于第一方面，反之亦然。 本文中所用的术语"下游"是指，在运行时样品依次经过装置的不同部件。术语 "下游"的范围包括该装置的两部件直接流体连通，但其范围也包括两个部件被隔开(例如 被阀或者该装置的另一部件隔开)。术语"整合"是指该装置的两个不同部件组合成单个单 元，以使得例如该装置的同一部件可用于过滤样品和用作裂解单元。当术语"整合"用于与 核酸扩增单元组合的本发明第一和第二方面所述装置时，其指的是系统的两个部件彼此连 接，从而在使用中它们彼此流体连通。另一方面，术语"整合"指装置的不同部件优选在共 同的基底上形成。在用于装置的两个部件时，术语"连接"是指这两个部件可以彼此直接流 体连通(例如通过直接连接到一起或者通过通道连接)或者可以被例如阀或者该装置的另
一部件相互隔开。优选地，术语"与......连接"是指装置的两个部件彼此直接连接。 以下将更加详细地描述第一和第二方面的特征。
样品入口 样品入口设计成使得样品能被装入装置中。例如，其可适用于通过注射器注入样 品。样品入口也可以与泵连接。在这种情况下，样品可以包含在容器中而没有其自身的驱 动部件，使得在使用时样品被泵吸入样品入口 。
过滤单元 所述装置可包括过滤单元。此单元可位于裂解单元上游，或者与裂解单元整合形 成。过滤单元可包括例如交错流过滤器或者中空过滤器。或者，裂解单元本身可进一步包 括过滤流体样品的部件。所述部件可包括例如交错流过滤器或者中空过滤器，它们可以与 裂解单元整合。 裂解单元和可诜的核酸片段化单元 所述装置包括适于裂解流体样品(例如生物或环境流体或者由其衍生的流体样 品)中所存在细胞的裂解单元，以及适于从裂解单元所裂解细胞或颗粒的内容物中提取核 酸(例如mRNA)的核酸提取单元。裂解单元可以是任何裂解单元，如WO 2005/073691中所 述的裂解单元，该文献通过引用全文并入本文中。裂解单元可具有任何合适的形状和构造， 但通常为通道或室的形式。裂解单元优选用于裂解流体样品中所含的真核细胞和/或原核 细胞和颗粒，例如病毒颗粒。 如果必要，所述装置还可包括核酸片段化单元，其位于裂解单元的下游，并优选 位于核酸提取单元的上游。或者，裂解单元本身可进一步包括对流体样品中的细胞/颗粒裂解时所释放的核酸进行片段化的方法。作为样品预处理步骤，DNA或RNA的随机片段 化经常是必要的。片段化可以使用限制酶以生物方法实现，或者通过施加物理力使分子 断裂(参见例如P. N. Hengen， Trends in Biochem. Sci. ， vol. 22， 273-274页，1997，以及 P. F. Davison, Proc. Nat. Acad. Sci. USA， vol. 45， 1560-1568页，1959)。通过剪切对DNA进 行片段化通常包括使样品经过短的縮窄件(constriction)。在一个优选实施方案中，DNA 和/或RNA在泵过狭窄的孔口时由于对分子的快速牵拉而在机械力下断裂。压力驱动流可 以产生剪切力，这导致核酸的片段化。国际专利申请PCT/GB03/004768描述了一种用于核 酸片段化的微流体装置。 裂解单元本身可以进一步包括对流体样品进行过滤的部件，可选地还包括对核酸
进行片段化的部件。禾亥斷是耳又転 核酸提取单元可以具有任意合适的形状和构造，但是通常为通道或室的形式。核 酸提取单元可以至少部分地填充有非特异性结合核酸(如mRNA)之材料(例如二氧化硅) 的珠子、颗粒、过滤器或纤维。作为替代或补充，核酸提取单元可包括二氧化硅过滤器。核 酸在离液剂存在下与二氧化硅表面结合。所述单元通常包括基底和上层覆盖物，提取单元 由基底表面的凹陷和所述覆盖物的相邻表面所限定。基底优选由硅、P匿S(聚二甲基硅氧 烷)、PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)、COC(环烯烃共聚物)、PE(聚乙烯)、PP(聚丙烯)、PC(聚 碳酸酯)、PL(聚交酯)、PBT(聚对苯二甲酸丁二醇酯)和PSU(聚砜)形成，还包括其中两 种或多种的混合物。优选的聚合物是COC。在一个具体实施方案中，核酸提取单元包括通道 中的二氧化硅珠堆、颗粒过滤器或者纤维。 无论核酸提取单元是什么形式，本发明人都发现，提取单元在使用前经过氧化氢 处理后将更加有效。发现这产生了可更可靠地扩增的样品。还发现对从核酸提取单元中提 取的样品进行稀释会促进选择性扩增。这可以通过例如使混合流体中包含稀释流体(例如 水)来完成。 所述装置可还包括对裂解单元和/或核酸提取单元的内容物进行加热的部件。所 述部件可包括例如一个或多个位于裂解单元和/或核酸提取单元之中或其附近的珀尔帖 兀件(Peltier elements)。
试剂储存和驱动单元 在最一般性的方面中，本发明包括三个试剂存储储器，即裂解流体储器、第一洗涤 缓冲液储器和洗脱流体储器。 在一个优选方面，这三个储器平行排列。每个储器具有两个端，这两端命名为上端 和下端。每个储器的上端与第一变位阀连接(称为"上"变位阀)，而下端与第二变位阀连接 (称为"下"变位阀)。上变位阀还与驱动全部三个流体储器的单个泵连接。所述单泵还可 以驱动所有预装到该装置中的其他流体和/或装载到装置中的样品。下变位阀使得流体能 够在使用中转移到装置的相应部件。为实现此目的，所述装置配有将下变位阀与裂解单元 连接的第一驱动通道以及进一步将下变位阀与核酸提取单元连接的第二驱动通道。这样， 使用中，上和下变位阀的适当定位使得单泵能够驱动裂解流体使其经过第一驱动通道转移 到裂解单元，以及驱动第一洗涤缓冲液和洗脱流体使它们经过第二驱动通道转移到核酸提 取单元。
可选地，第四储器与其他三个储器平行排列。此第四储器是核酸提取单元的第二 洗涤缓冲液的储器。同样，如果此储器的两端被称为上端和下端，则此第四储器的上端与上 变位阀连接，并且下端与下变位阀连接。第二洗涤缓冲液被驱动另外三个储器的同一个泵 驱动。使用中，驱动第四洗涤缓冲液以使其经过第二驱动通道转移通过核酸提取单元。
因此，每个储器中预装有其相应的试剂。裂解流体储器预装有裂解流体；第一洗涤 缓冲液储器预装有第一洗涤缓冲液；洗脱液储器预装有洗脱液。可选地，第二洗涤缓冲液储 器预装有第二洗涤缓冲液；混合流体储器预装有混合流体。 通过使用这个特定系统，可以使用试剂存储及驱动单元有效且高效地分隔不同的 流体，以使得它们不会在混合过程或使用过程中发生不期望的混合。另外，可以使用单个泵 来驱动所有预装的流体。这会简化系统并提高可靠性。 裂解流体可以是能够裂解流体样品中目的细胞和/或颗粒的任何合适的裂解流 体/缓冲液。合适的裂解缓冲流体的实例是100mMTris/HCl，8M GuSCN(pH 6. 4)。
洗脱流体可以是任何适于从核酸提取单元中洗脱经纯化核酸的流体。合适的洗脱 缓冲液的实例是10mM Tris/HCl，lmM EDTANa2 (pH 8)。 第一洗涤溶剂可以选自任何合适的溶剂，不过优选易于蒸发的溶剂，例如乙醇。
第二洗涤溶剂可以选自任何合适的溶剂，不过优选易于蒸发的溶剂，例如异丙醇。
混合流体也可以是此试剂存储系统的一部分(如下)。当使用时，混合流体通常是 为进行下游过程或反应而添加到从核酸提取单元洗脱出的纯化核酸中的试剂。在一个实施 方案中，混合流体可以是DMSO、山梨糖醇或者它们的混合物。其他混合流体是本领域技术人 员已知的(例如多元醇，其为具有一个或多个侧醇基的分子，如甘油)。如上所述，这些特定 的混合流体为进行NASBA而特别提供。 为了控制通过装置而存储在试剂储器中的单个试剂的流量，试剂存储及驱动系统 的两个变位阀协同操作。第一变位阀称为上阀，可以变换位置以使得泵与任何试剂存储通 道之间流体连通。其也称为泵阀。第二变位阀称为下阀，可以变换位置以选择性地在驱动 通道与每一个试剂储器之间轮流建立流体连通。其也可称为驱动阀。根据驱动阀的所选位 置，每一次只有一个试剂储器与驱动通道流体连通。当装置在使用中时，下阀使得每个试剂 储器的试剂流被单个试剂流驱动器驱动。 本发明试剂存储及驱动系统的使用使得所述装置在使用时，从试剂储器经过该装 置到裂解单元及核酸提取单元的试剂流能够根据预定的方案使用单个试剂流驱动器来驱动。 混合单元 本发明的装置还可包括单独的混合单元，以在样品装入扩增单元的第一反应室中 之前将样品和混合流体进行预混合。发明人已发现，尽管提高了装置的复杂度，但对装置的 这种修改实际上提供了样品与混合流体之间高效且有效得多的混合。这可以提高下游扩增 单元中进行的扩增反应的特异性。 因此，所述装置还可包括在核酸提取单元下游的混合单元，以便在使用该装置时 接收来自提取单元的洗脱液。混合单元也与预装载混合流体的试剂储器流体连通。混合流 体可以是用于促进扩增引物与其靶标选择性杂交的流体。这种溶剂的实例包括亚砜和/或 山梨糖醇。亚砜的实例是匿SO。将混合单元设计成使来自核酸提取单元的洗脱液(或者包
11含该洗脱液的流体，如稀释的洗脱液)与预装的混合流体混合。
混合单元可具有任何合适的形状和构造。 在一个实施方案中，混合流体的储器与裂解流体、第一洗涤缓冲液和洗脱流体的 储器平行放置。如果这个储器的两端命名为上端和下端，则混合流体储器的上端与上变位 阀连接，下端与下变位阀连接。这是能够使该储器与所有其他预装载到该装置之流体的储 器用同一泵驱动的便捷方法。如果混合试剂以这种方式存储，则该装置还包括连接下变位 阀与混合单元的第三驱动通道。在使用中，可以驱动混合流体以使其经过第三驱动通道转 移到混合单元。这种构造使得混合流体可以被存储，然后在需要时提供给混合单元。
因此，混合单元可具有
(i)第三变位阀； (ii)具有第一和第二端的第一和第二通道，其中第一和第二通道的第一端与第三 变位阀连接，而第一和第二通道的第二端具有共同的端， (iii)具有第一和第二端的伸长通道，其中第三通道的第一端与第一和第二通道 的第二端具有共同的端。 使用中，这种构造允许样品从核酸提取单元中洗脱，然后装载到第一通道中。然后
混合流体装载到第二通道中。最后，洗脱样品和溶剂同时泵到伸长通道中。 在这种构造中，混合单元还可包括用于测量在第一通道中从核酸提取单元中洗脱
出来的样品和在第二通道中的混合流体的位置(或栓)的部件。这使得对流体能够精确控
制，以确保样品与混合流体的有效混合。所述测量部件优选是含有光源的光学系统。为了
简化装置的设计，光源可以是与浊度测定中所用的相同的光源(见下文)。 或者，混合流体可存储在两端均与第三变位阀连接的储器中。在这种情况下，混合
通道或室可以直接与第三变位阀连接，以使得装置包括 混合单元，其包括与核酸提取单元的出口连接的变位阀，以及与该变位阀连接的 混合通道，其中混合流体储器的两端均与第三变位阀直接连接。本发明人发现这是有利的， 因为简化了混合单元的操作。尤其是，这意味着该装置可以与在样品装入混合通道或室之 前用于测量样品位置的简化检测系统协同操作，或者根本不需要任何检测系统。已经发现 这会提高装置的可靠性。 在任何实施方案中，样品和混合流体在其中混合的通道或室通常是伸长通道的形 式，可以包括嵌入物或者结构化的侧壁以促进混合。伸长的通道可以巻曲的，例如呈波状。 为了实现将洗脱液与下游试剂进行混合，使这两种流体沿着混合单元的伸长通道混合并流 动。伸长的通道提供足够长度的流动路径，以使得两种流体通过单纯扩散而混合。
应该注意到，上述的第三变位阀可帮助控制装置的其他部件。或者，可以提供单独 的变位阀来帮助沿着该装置驱动流体。在任一情况下，阀都与第一和第二变位阀协同操作。 这样，将其命名为试剂流路控制阀。此阀的作用可以是变位以在选定的储器与裂解单元、核 酸提取单元或者(在储器预装载有混合流体的情况下)混合单元之间建立流体连通。根据 流路控制阀的选择位置，只有一个试剂储器与裂解单元、核酸提取单元或者混合单元(如 果存在)流体连通。
其他特征 根据本发明的装置通常还包括与样品入口、裂解单元和核酸提取单元中的任何一个或者任何组合流体连通的废弃物单元。可以存在可选的阀来控制流体流到废弃物单元。 废弃物单元可以是微制造的，并与其他组件整合。 所述装置旨在与试剂流驱动器一起使用，这是将空气(或其他流体)引入该装置 的一个部件。例如，试剂流驱动器可与试剂存储系统连接。试剂流驱动器可以形成装置的 一部分，或者是与装置一起使用的单独组件。试剂流驱动器可包括泵或注射器，或者与试剂 存储系统连接的体积可变室。 所述装置还包括将流体样品引入样品入口的部件，或者与其一起使用。所述部件 可包括泵或注射器。或者，这种部件可包括一个或多个与样品入口连接的体积可变室，其中 改变该体积可变室的体积会影响和/或限制流体样品流入和/或流出入口 。体积可变室通 常包括覆盖在下层基底中凹陷上的柔性膜。国际专利申请PCT/GB02/005945描述了 一种优 选的流体运输系统。 所述装置还包括浊度传感器。传感器可位于过滤单元的上游。为了简化装置的设 计，该传感器可使用与混合系统的位置传感器相同的光源。 所述装置还可以包括压力传感器。优选地，压力传感器是封闭末端(dead-end)压 力传感器而不是线上(in-line)压力传感器，因为本发明人发现，使用封闭末端传感器防 止了同一芯片上提取和纯化的不同样品之间的污染。
肝则亍禾亥斷是耳又扁禾,l隨充 本发明也提供用于对含有细胞和/或颗粒的流体样品进行核酸提取和核酸序列 扩增及检测过程的整合式芯片实验室诊断系统，所述系统包括根据本发明第一或第二方面 的核酸提取装置以及核酸扩增单元。 通常，核酸扩增单元将与核酸提取单元流体连通，或者与混合单元(如果存在的 话)流体连通，从而使得来自核酸提取单元的洗脱液或者其与溶剂的混合物可以直接流到 核酸扩增单元。可以存在可选的阀来控制二者之间的流体流动。优选地，核酸反应单元是 微制造的，并且优选与其他组件整合。 在反应单元中可以进行任何常规反应。在一个具体实施方案中，所述反应能够对 特异性靶核酸序列进行检测和定量分析。核酸反应单元通常包括核酸序列扩增单元，该单 元允许通过核酸扩增反应来检测特异性序列。实例包括PCR和等温扩增技术，例如基于核 酸序列的扩增(NASBA)。最优选的是使用分子信标检测扩增产物的实时NASBA。
因此，在一个优选方面，本发明提供对含有细胞和/或颗粒的流体样品进行样品 制备、核酸序列扩增和检测过程的整合式芯片实验室诊断系统，更优选实时NASBA。 NASBA 反应的一般特征和要求在本领域中众所周知。国际专利申请W0 02/22265 (该文内容通过 引用并入本文)描述了用于进行NASBA的微制造反应室系统，该系统可适于包括在本发明 的系统中。 核酸反应单元可具有任何合适的构造。在一个实施方案中，反应单元可包括多个 平行反应通道或室。在一个实施方案中，反应室/通道可预装有核酸扩增和/或检测所需 的试剂，例如实时NASBA所需的试剂。这些试剂可包括酶、缓冲组分、NTP、引物、探针等。试 剂可以存储为干燥状态，并在临用前重建，例如通过添加在该系统的样品制备部分中制备 的流体核酸样品来重建。 在一个优选实施方案中，用于核酸扩增的引物预装到扩增单元中。将引物预装载并将混合流体与核酸样品在本发明的混合单元中混合，这二者的组合有助于促进引物与其 靶标的特异性结合。引物可以预装载到多组平行排列的双室中的第一个室中。每个第一室 可以与共同的入口连接。在这种情况下，扩增酶(如NASBA酶)在第二室中提供，优选是预 装的。所有其他试剂可以在第一室中提供，优选是预装的。 术语"预装"是指试剂在其最终使用之前(例如在装置制造过程中)加入装置中。 这样，固体试剂可以沉积到所述装置上，例如通过使溶液中的溶剂蒸发而使试剂溶液干燥 来实现。 核酸反应单元还可以包括计量部件，其用于在将流体核酸样品引入平行反应室/ 通道时对其等分试样进行计量。该计量部件可以采取任何合适的形式。
在一个具体实施方案中，本发明的系统可以用于裂解流体样品中存在的细胞，提 取mRNA，对一种或多种特定靶序列进行NASBA扩增，以及对扩增产物进行实时检测。
碰白懇隨 所述装置的各个组件可以是微制造的。在一个实施方案中，裂解单元、核酸提取单 元和试剂存储及驱动系统的试剂储器是微制造的并整合在一起，即在同一基底上形成。
所述系统或至少其母版(master version)通常由半导体材料形成，或者包括半导 体材料，但是也可以使用绝缘体(例如玻璃、熔融二氧化硅、石英、聚合物材料和陶瓷材料) 和/或金属材料。半导体材料的实例包括以下一种或多种第IV族元素(即，硅和锗)； III-V族化合物(例如砷化镓、磷化镓、锑化镓、磷化铟、砷化铟、砷化铝和锑化铝)；II-VI 族化合物(例如硫化镉、硒化镉、硫化锌、硒化锌)；以及IV-VI族化合物(例如硫化铅、硒 化铅、碲化铅、碲化锡)。硅和砷化镓是优选的半导体材料。所述系统可使用传统上用于批 量生产半导体微电子装置以及近年来用于生产半导体微机械的常规方法来制造。这些微制 造技术包括如外延生长(例如气相、液相、分子束、金属有机化学气相沉积)、平板印刷(例 如光平板印刷、电子束平板印刷、X射线平板印刷、离子束平板印刷)、蚀刻(例如化学蚀刻、 气相蚀亥IJ、等离子体蚀刻)、电沉积、溅射、扩散掺杂、离子注入和微机械加工。也可以使用非 晶体材料，如玻璃和聚合物材料。 聚合物材料的实例包括PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)、P匿S(聚二甲基硅氧烷)、 PC(聚碳酸酯)、C0C(环烯烃共聚物)、PE(聚乙烯)、PP(聚丙烯)、PL(聚交酯)、PBT(聚 对苯二甲酸丁二醇酯)和PSU(聚砜)，还包括两种或更多种上述物质的掺和物。优选的聚 合物是PDMS或者C0C。 所述装置或系统通常整体成形。所述装置或系统可以在共同的基底材料(如本文 所述的半导体材料，但也可以使用如玻璃或陶瓷材料等绝缘体基底材料)上进行微制造。 然而，优选的共同基底材料是塑料或聚合物材料，并且适当的实例如上给出。所述装置或系 统可优选通过对例如硅母版进行复制来成形。 以塑料代替硅玻璃用于微结构的优点有很多，至少在生物学应用上是这样。 一个 最大的优点是减少了采用例如微注射模制、热压印和铸塑等方法进行大量生产的成本。复 合结构的系数为ioo或更高并不是不可能的。复制多层模具之结构的可能性使得在设计自 由度上具有巨大的灵活性。由于有了将常用的标准部分相组合的选择余地，因此在很多情 况下微观世界和宏观世界的相互联系更为容易。组装技术可以使用不同的方法，例如由微 结构制成的US焊接或溶剂焊接、激光焊接、胶黏和层压。其他有利的特征是表面改性。对于专用于生物分析的微型化结构而言，重要的是表面具有生物相容性。通过利用等离子体处
理和等离子体聚合，可在涂层中获得多样性方面的灵活性和变化性。塑料对酸碱的化学耐
性要远优于容易被腐蚀掉的硅基底。生物技术领域中的大部分检测方法都涉及光学测量。
因此，相对于不透明的硅基底，塑料的透明性是一个重要的特征。聚合物微流体技术目前在
芯片实验室市场中是已经建立但仍在发展的领域。 本文所述微制造的装置或系统也意欲包括纳米制造的装置。 就硅母版或半导体母版而言，可以通过如蚀刻或者微机械加工而在硅基底上以准 确的微观尺度限定出一个或多个体积可变室、微流体通道、反应室和流体互连。然后由所述 硅母版制造塑料复制物。以这种方式，可以通过任何适当的方法(例如使用粘合剂或者通 过加热)，将具有蚀刻微结构或机械加工微结构的塑料基底结合到覆盖物上。
驟,ffl诚 本发明的装置或系统可以根据本发明的第四或第五方面来使用。这些方法的步骤 概括如下 (i)通过样品入口装入样品； (ii)可选地测量样品的浊度和/或压力； (iii)可选地使样品经过过滤单元； (iv)使来自样品的流体可选地转移到废弃物单元； (V)使裂解流体从裂解流体储器中移出，并转移到样品中的细胞和/或颗粒上；这 可以通过使裂解流体流经第一驱动通道来进行；
(vi)然后使裂解流体流入核酸提取单元； (Vii)使经过核酸提取单元之后剩余的流体可选地转移到废弃物单元；
(viii)使第一洗涤缓冲液从第一洗涤缓冲液储器流经核酸提取单元，然后可选地 转移到废弃物单元；这可以通过使第一洗涤缓冲液经第二驱动通道从第一洗涤缓冲液储器 中移出来实施； (ix)使第二洗涤缓冲液可选地从第二洗涤缓冲液储器流经核酸提取单元，然后可 选地转移至废弃物单元；这可以通过使第一洗涤缓冲液经第二驱动通道从第一洗涤缓冲液 储器移出来实现； (x)使洗脱流体经第二驱动通道从洗脱液储器流经核酸提取单元；
(xi)然后，可选地，使洗脱的样品转移到混合单元；
(xii)在混合单元中，使洗脱的样品与混合流体混合；
(xiii)然后样品转移至扩增单元。
在扩增单元中，样品可以 (xiv)转移至第一室中并且加热至6(TC或更高，然后
(xv)转移到含有NASBA酶的第二室中并加热到约40°C 。 从上述本发明的第一、第二和第三方面的描述中可明显看出，可以对这一步骤顺
序进行修改、填加和删减。
装置的制造 本发明还提供用于制造本文所述的整合式芯片实验室诊断系统的方法，该方法包 括
A.提供在其表面上具有入口凹陷、裂解单元凹陷、核酸提取单元凹陷、裂解流体储 器凹陷和洗脱液储器凹陷的基底；
B.提供覆盖物；禾口 C.将所述覆盖物结合到所述基底上，以形成各自由所述基底表面的各个凹陷和所 述覆盖物的相邻表面所限定的(a)入口、(b)裂解单元、(c)核酸提取单元、(d)裂解流体储 器和(e)洗脱液储器。 本文中用到的术语凹陷还意欲涵盖多种特征，包括例如槽、缝、？L、沟和通道，包括 它们的一部分。 所述方法可以进一步包括在将覆盖物结合到基底上之前或之后将裂解流体引入 裂解流体储器中的步骤。 所述方法可以进一步包括在将覆盖物结合到基底之前或之后将洗脱液引入洗脱 液储器中的步骤。 所述方法可以进一步包括在将覆盖物结合到基底之前或之后将乙醇引入第一洗 涤溶剂储器中的步骤。 所述方法可以进一步包括在将覆盖物结合到基底之前或之后将异丙醇引入洗涤 溶剂储器中的步骤。 基底可以由例如硅形成，而上层覆盖物可以由例如玻璃形成。在这种情况下，优选 将玻璃覆盖物与硅基底阳极键合，所述阳极键合可选地通过在该基底表面上形成的中间二 氧化硅层进行。 硅中的凹陷可以采用反应性离子蚀刻形成。诸如聚合物材料等其他材料也可以用 作基底和/或覆盖物。这些材料可以使用例如硅复制物(r印lica)来制造。或者，所述装 置可以如下制造通过研磨和放电工具(EDM)来构建模具，然后对芯片部分进行注射模制， 然后采用例如钻孔、研磨、去毛剌(deburring)等对聚合物部分进行机械性后加工。随后， 可以接着进行滤器的插入、溶剂结合和流体连接的安装。 聚合物材料的实例包括PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)、COC(环烯烃共聚物)、 P匿S(聚(二甲基硅氧烷))、PE(聚乙烯)、PP(聚丙烯)、PC(聚碳酸酯)、PL(聚交酯)、 PBT(聚对苯二甲酸丁二醇酯)和PSU(聚砜)，包括其两种或多种的掺和物。优选的聚合物 是C0C。 优选地，尤其是如果需要对小室中的内容物进行光学观测的话，则上层覆盖物由 诸如玻璃、Pyrex或C0C等透光物质或材料制成。 微制造组件与一种或多种其他元件(如玻璃板或辅助微制造元件)的组合是经常 使用的，并且意欲落在本文所使用的术语"微制造"的范围之内。 部分或全部的基材基底可以具有涂层，所述涂层的厚度通常至多为lym，优选小 于O. 5 ii m。该涂层优选由以下的一种或多种形成聚乙二醇(PEG)、牛血清白蛋白(BSA)、吐 温和葡聚糖。优选的葡聚糖是分子量为9000 200000的葡聚糖，特别优选的是分子量为 20000 100000，尤其是25000 75000 (例如35000 65000)的葡聚糖。吐温(或聚氧 乙烯脱水山梨糖醇)可以是可得自SigmaAldrich Company的任何吐温。优选将PEG单独 地或组合地作为涂层部件。PEG包括纯的聚乙二醇，即式H0-(CH^H^)n-H，其中n是使PEG 通常具有200 50000、尤其是PEG1000 20000、例如15000 20000的分子量的整数；或者是化学改性的PEG，其中一种或多种乙二醇低聚物通过同双官能团(homobifunctional group)(例如磷酸部分或芳香族间隔物)连接。特别优选的是具有数均分子量为15000 20000的聚乙二醇PEG。这种PEG的实例是SigmaAldrich Company销售的产品P2263。施 加于所述小室/室、入口 、出口和/或通道的上述涂层可以改善流体流过该系统的流动。特 别地，已发现样品不大容易附着或粘结到这种表面上。PEG涂层是优选的。
就硅母版或半导体母版而言，可以通过如蚀刻或者微机械加工而在硅基底上以准 确的微观尺度限定出一个或多个体积可变室、微流体通道、反应室和流体互连件(深层反 应性离子蚀刻(DRIE)是优选的技术)。然后由所述硅母版制造塑料复制物。以这种方式，可 以通过任何适当的方法(例如使用粘合剂或者通过加热)，将具有蚀刻微结构或机械加工 微结构的塑料基底结合到覆盖物上，从而形成密闭的片段化小室、入口 、出口和连接通道。
通常，所述装置优选用塑料如C0C注入模制来制造。这使得装置的制造简易又方 便。 所述装置包括基底，其上表面上形成预期的微结构。例如，该基底可以是硅，或者 是通过硅母版复制而形成的塑料基材。该基底的上表面与覆盖物结合，从而限定出一系列 的单元/小室、入口、出口和/或通道。所述覆盖物可以由例如塑料或玻璃形成。该覆盖物 优选是透明的，这允许对流体进行观测。如果装置由硅制成，其可以通过DRIE制造，或者所 述装置可以如下制造通过研磨和放电工具(EDM)来构建模具，然后对芯片部分进行注射 模制，然后采用例如钻孔、研磨、去毛剌等对聚合物部分进行机械性后加工。随后，可以接着 进行滤器的插入、溶剂结合和流体连接的安装。 核酸样品可以是或者来自于例如生物流体、乳制品、环境流体和/或饮用水，或者 含有细胞的流体样品，所述流体样品获得自或来自临床组织样品，例如活检或类似的组织 取样方法，例如宫颈刮片。非限制性实例包括血液、血清、唾液、尿、奶、饮用水、海水和池水。 对于许多复杂的生物样品例如血液和奶，应该理解，在可从样品中的细菌细胞和病毒颗粒 中分离和纯化DNA何/或RNA之前，首先需要将病毒颗粒和细菌细胞与样品中的其他颗粒 分开。还应该理解，在进一步破坏细菌细胞壁或者病毒蛋白被膜并分离核酸之前，为了浓縮 细菌细胞和病毒颗粒，即减少起始材料的体积，可能需要进行另外的样品制备步骤。这在 起始材料具有大体积(例如含有相对较少的细菌细胞或病毒颗粒的水溶液)时是非常重要 的。这种类型的起始材料在环境监测应用(如饮用水中细胞污染的例行监测)中经常碰到。
所述装置或系统优选设计成处理1 100ml的样品体积。 本发明还提供用于分析生物样品和/或环境样品的设备，该设备包括本文所述的 系统。该设备可以是一次性设备。 现在通过举例的方式并参照附图对本发明进行描述。 典型的装置布局在图1中示意性示出。该装置包括流体样品入口 1、带有整合滤 器的裂解单元4、核酸提取单元5和混合单元6。该装置配有裂解流体(7)、第一缓冲溶液 (8)、洗脱流体(9)的储器，可选地配有第二缓冲溶液(10)和混合流体(11)的储器。
使用中，流体进入样品入口 。可以通过例如注射器的作用主动将流体泵入入口 。或 者，可以提供与入口流体连通的泵，以使得样品从被动存储系统中被吸入流体入口。该泵可 以与用于驱动该装置中预装流体的泵27相同或者不同。 可选地，该系统可包括浊度传感器2和/或压力传感器3。也可以通过用光学传感
17器组件2，通过测量透过光和散射光来测量浊度，作为样品中糖蛋白含量和细胞数的指标。 可以通过压力传感器3来测量压力，作为滤器负荷的指标。使用中，如果样品不具备预定水 平的压力和浊度，样品会被拒绝。 使用中，可选地过滤样品后，来自样品的流体可以穿过废弃物单元12。另外，当从 核酸提取单元中洗脱时，裂解流体和第一缓冲溶液可以穿过废弃物单元12。这两个出口在 图1中显示为不同的出口。在这种情况下，可选的阀15和16用于控制流体经过流体途径 或通往废弃物单元的流动。但是，图2显示了更加方便的方案。在该图中提供了单个废弃 物单元。显示其具有可选的出口，以使该系统中不产生压力。这个出口也允许在核酸纯化 单元的可选空气干燥步骤中将气体从系统中释放。另外，试剂沿着芯片的流动可通过一个 变位阀控制，上文称为第三变位阀或者驱动阀。尽管未在图2中示出，但这个第三变位阀也 可与图2所示的其他功能组合提供，或者作为单独的变位阀向混合单元6提供混合流体11。
试剂7、8、9和10可在平行的试剂储器中提供。图3中显示了三个平行储器的示例 性排列。在此图中，储器20、21和22的两端各与变位阀23(上变位阀)和24(下变位阀) 连接。储器20中含有试剂7，储器21中含有试剂8，储器22中含有试剂9。可选地，可以提 供一个或两个另外的平行试剂储器。它们可含有混合流体和/或第二洗涤缓冲液。
上变位阀与泵27连接。这个泵优选驱动装置上的所有试剂7、8、9和10和11 (如
果存在)。 下变位阀与第一和第二驱动通道25和26连接。第一驱动通道与裂解单元连接， 从而使得在使用中裂解流体可以用泵27驱动，并通过第一驱动通道供应到裂解单元。第二 驱动通道与核酸提取单元连接，从而使得在使用中第一洗涤缓冲液和洗脱流体通过第二驱 动通道供应到核酸提取单元。 应该理解，上变位阀和下变位阀的协同控制可用于驱动预装到装置上的所有流 体。这种控制可以通过使用如图2所示的第三变位阀得到进一步改善。
核酸提取单元可包括二氧化硅珠子，例如0. 3mg的15_30 y m大小的二氧化硅珠 子。也可以在填料床的正下方提供电极(未示出)，用于通过电运动收集带负电荷的洗脱核酸。 图4和5显示了混合单元6的两种可能的构造。在图4中，第三变位阀33用于定 位第一通道30中来自核酸提取单元5的洗脱样品。然后，来自混合流体储器的混合流体11 通过第三变位阀33装载到第二通道31中。 一旦装载后，驱动这两个通道。由于通道在伸 长混合通道32的起点具有共同末端，混合流体和洗脱样品传递到伸长混合通道中并混合。 该伸长混合通道的外形有利于样品与混合流体的完全混合。 在图4中，优选地通过光学仪器测量混合流体和洗脱样品栓体(plug)的位置。优 选地，这个光学仪器是进行样品浊度测量的同一光学仪器。这在图2中用箭头指出提供单 个光学检测器，其检测用于浊度测量(52)和定位混合单元55中样品与混合流体前端位置 的光。 图5示出图4的另一个替代性构造。具体地，提供第三变位阀33与混合通道32 直接连接。这个第三变位阀还与混合流体储器(示为34)的两端都连接。该阀也与核酸提 取单元5的出口连接。使用中，该变位阀使得混合流体和从核酸提取单元洗脱出来的样品 能够在混合通道中直接混合，而不需要复杂的光学系统来测量样品和混合流体两者的栓体(即最前点)的位置。 因此，使用中，装入该装置的样品经过如图6中所示的几步。第一步是样品装载。 将1 20ml流体样品经由样品入口引入装置中(例如使用注射器泵)，并且流经裂解/过 滤单元成为废弃物。样品中存在的细胞和/或颗粒通过裂解单元中的滤器保留下来。使用 压力表测量压力，作为滤器负荷的指示。还通过光学传感器组件测量透射光和散射光，作为 样品中糖蛋白含量和细胞数的指标。 第2步是裂解。将裂解流体从预装有裂解溶液的试剂储器中移出，例如经过第一 驱动通道移出。然后裂解流体转移到核酸提取单元。第l步中保留在滤器中的细胞和/或 颗粒裂解释放其内容物，然后裂解的样品被传递到核酸提取单元。裂解样品中存在的核酸
被核酸提取单元中的二氧化硅珠子结合并保留。流体离开提取单元成为废弃物。如果变位 阀设置成与提取单元的出口连接，则该阀设置成使得流体能够流经核酸提取单元离开成为 废弃物。在这一步中，所有流体可以用单个泵驱动。 第3步是第一次洗涤。将第一洗涤溶剂转移至核酸提取单元，优选经过第二驱动 通道转移。与核酸提取室的出口连接的变位阀可以设置成允许流体流经核酸提取单元离成 为废弃物。所有流体均可以用上述步骤中的同一单泵驱动。 第4步是可选的第二次洗涤，例如用异丙醇。这一步洗涤的细节与第一次洗涤相 同。同样，所有流体均可以用第2到4步中的同一单泵驱动。 第5步是风干和加热。将第2 4步中用于驱动所有流体的单泵再用于将空气泵 过核酸提取单元。这一点的实现是通过例如使允许第二洗涤缓冲液泵入核酸提取单元的流 体通路保持开放。如果需要可对室进行加热。 第6步是核酸的洗脱。利用第2 5步中用于驱动所有流体的同一单泵将洗脱流 体从洗脱液储器中泵出。如果存在的话，将第三变位阀设置成使得流体流经核酸提取单元 离开到混合单元。核酸从核酸提取室中被洗脱出来并且转移到混合单元。光学传感器可以 用于监测混合单元中洗脱核酸的到达。 第7步是混合。如前所述，这一步混合步骤的具体细节取决于混合单元的构成。
与混合流体混合后，样品被传递到核酸扩增单元。 在一个实施方案中，核酸扩增单元包括如图7所示的一系列双室。在第一室40中， 预装有用于扩增反应的引物。它们以干燥形式预装载。可在核酸扩增单元的其他构造中提 供类似地预装载的引物。 图7中，如果要在反应室系统中进行NASBA，则将NASBA试剂预装入第二室41中。 所有其他试剂也可以提供预装入第一或第二反应室或者两者中。 图8示出本发明的装置的一种可能构造。该图显示了样品入口 (50)、压力传感器 (51)、浊度传感器(52)，它们被设计成使得其能够用于测量以下单元中的流体的位置混 合单元、整合式过滤及裂解单元(53)、核酸提取单元(54)、废物单元(56)、用于驱动装置中 所有流体的泵(57)、上变位阀和下变位阀(58和59)、用于混合单元中的定位样品和混合流 体以及控制流体沿该装置流动和向废物单元(56)流动的第三变位阀、试剂存储储器(61、 62、63、64和65)以及将下变位阀与裂解单元、核酸提取单元和混合单元(66， 67和68)连接 的特定驱动通道。可见一个通道离开混合单元(55)的伸长通道，其与核酸扩增单元(未示 出)连接。
图9示出混合单元的一种替代构造。变位阀(72)用于控制混合流体储器(70)。 所述阀与混合通道(71)连接。样品通过驱动通道(74)从核酸提取单元中提供。
因此，本发明的装置可用于毫升样品体积的常规诊断。本发明人已经通过包含 50 50000个细胞的样品进行了证实。特别地，在核酸扩增单元中提供HPV16的引物，并 用NASBA扩增从细胞中提取出的RNA。遵循以上实验方案。具体地，将3ml样品装入样品入 口 。所述系统由C0C制造。核酸提取单元中的二氧化硅用3%的过氧化氢预处理24小时。 使用"Genomed A"二氧化硅滤器。 装入样品后，将120iU "Biomerieux Buffer pH 7. 5"用作裂解流体。然后，将 230 iU 75%乙醇水溶液用作第一洗涤缓冲液。第二洗涤缓冲液由100%醇构成。用7X4ml 以1. 5ml/分钟供应的和1X2ml以1. 5ml/分钟供应的空气干燥核酸提取单元。然后将核 酸提取单元在6(TC干燥20分钟。然后用HPV16的引物对样品进行NASBA。观察到样品的 阳性结果。
20
权利要求
一种用于对含有细胞和/或颗粒的流体样品进行核酸提取过程的整合式芯片实验室装置，所述装置包括(a)用于装入流体样品的样品入口；(b)用于裂解所述流体样品中存在的细胞和/或颗粒的裂解单元；(c)用于所述裂解单元的裂解流体储器；(d)在所述裂解单元下游的核酸提取单元；和(e)用于所述核酸提取单元的第一洗涤缓冲液和洗脱流体的储器，所述装置还包括(f)在所述核酸提取单元下游的混合单元；和(g)用于所述混合单元的混合流体源。
2. 权利要求1所述的整合式芯片实验室装置，还包括(h) 过滤单元，所述过滤单元在所述裂解单元的上游，或者与所述裂解单元是整合形成的。
3. 权利要求1或权利要求2所述的整合式芯片实验室装置，其中所述裂解流体、第一洗涤缓冲液和洗脱流体的储器平行排列，每个储器具有上端和下端，其中所述装置还包括(i) 与所述裂解流体、第一洗涤缓冲液和洗脱流体之储器的所述上端连接的上变位阀，(g) 与所述上变位阀连接的泵，(h) 与所述至少三个流体储器的所述下端连接的下变位阀， (j)将所述下变位阀与所述裂解单元连接的第一驱动通道，禾口(k)将所述下变位阀与所述核酸提取单元连接的第二驱动通道，其中至少所述裂解流 体、第一洗涤缓冲液和洗脱流体由单个泵(g)驱动。
4. 上述权利要求中任一项的装置，还包括(1)用于所述核酸提取单元的第二洗涤缓冲液的储器，其与所述裂解流体、第一洗涤缓 冲液和洗脱流体的储器平行排列，其中所述第二洗涤缓冲液的储器具有上端和下端，所述 储器的上端与所述上变位阀连接，并且所述储器的下端与所述下变位阀连接，其中所述第 二洗涤缓冲液由所述单个泵(g)驱动。
5. 上述权利要求中任一项的装置，其中所述混合流体包括DMS0、山梨糖醇或者它们的 混合物。
6. 上述权利要求中任一项的装置，其中所述混合流体由所述单个泵(g)驱动。
7. 权利要求6的装置，其中所述混合流体的储器与所述裂解流体、第一洗涤缓冲液和 洗脱流体的储器平行排列，并且具有上端和下端，其中所述上端与所述上变位阀连接，和所 述下端与所述下变位阀连接。
8. 权利要求7的装置，其中所述装置还包括将所述下变位阀与所述混合单元连接的第 三驱动通道。
9. 上述权利要求中任一项的装置，其中所述混合单元包括(i) 在所述核酸提取单元下游并且与所述混合流体储器连接的第三变位阀，禾口 (ii)在所述第三变位阀下游的混合通道。
10. 上述权利要求中任一项的装置，其中所述装置还包括浊度传感器，其设置成测量经 由所述样品入口装入的流体样品的浊度。
11. 上述权利要求中任一项的装置，其中所述装置还包括压力传感器，其设置成测量经由所述样品入口装入的流体样品的压力。
12. 上述权利要求中的任一项的装置，其中所述装置还包括(m)废弃物单元，其中所述废弃物单元与所述裂解单元和/或所述核酸提取单元流体 连通。
13. 上述权利要求中任一项的装置，其中所述装置还包括加热所述裂解单元和/或所 述核酸提取单元中内容物的部件。
14. 权利要求13的装置，其中所述加热部件包括一个或多个珀尔帖元件，其位于所述 裂解单元和/或所述核酸提取单元中，或者与它们相邻。
15. —种用于对含有细胞和/或颗粒的流体样品进行核酸提取过程的整合式芯片实验 室装置，所述装置包括(a) 用于装入流体样品的样品入口 ；(b) 用于裂解所述流体样品中存在的细胞和/或颗粒的裂解单元；(c) 用于所述裂解单元的裂解流体储器；(d) 在所述裂解单元下游的核酸提取单元；禾口(e) 用于所述核酸提取单元的第一洗涤缓冲液和洗脱流体的储器，其中所述裂解流体、 第一洗涤缓冲液和洗脱流体的储器平行排列，每个储器具有上端和下端，其中所述装置还 包括(i)与所述裂解流体、第一洗涤缓冲液和洗脱流体的储器的上端连接的上变位阀；(g) 与所述上变位阀连接的泵；(h) 与所述至少三个流体储器的下端连接的下变位阀；(j)将所述下变位阀与所述裂解单元连接的第一驱动通道；禾口 (k)将所述下变位阀与所述核酸提取单元连接的第二驱动通道。
16. —种用于对含有细胞和/或颗粒的流体样品进行核酸提取和核酸序列扩增及检测 过程的整合式芯片实验室诊断系统，所述系统包括根据权利要求1 15中任一项的核酸提取装置，禾口 核酸反应单元。
17. 如权利要求16所述的系统，其中所述核酸提取装置和所述核酸反应单元是整合形 成的。
18. —种使用整合式芯片实验室装置对含有细胞和/或颗粒的流体样品进行核酸提取 过程的方法，所述方法包括(i) 提供整合式芯片实验室装置，其包括样品入口、裂解单元、核酸提取单元、混合单 元，以及裂解流体、第一洗涤缓冲液、洗脱流体和混合流体的储器；(ii) 通过所述装置的所述样品入口装入样品；(iii) 通过使来自所述裂解流体储器的裂解流体经过所述细胞和/或颗粒而对所述样 品中的细胞和/或颗粒进行裂解，(iv) 使所述裂解流体经过所述核酸提取单元以提取核酸；(v) 将来自所述第一洗涤缓冲储器的第一洗涤缓冲液运送经过所述核酸提取单元；(vi) 将来自所述洗脱液储器的洗脱流体运送经过所述核酸提取单元，以产生所述核酸 提取单元的洗脱样品；禾口(vii)在所述混合单元中将所述洗脱样品与混合溶剂混合。
19. 一种使用整合式芯片实验室装置对含细胞和/或颗粒的流体样品进行核酸提取过程的方法，所述方法包括(i) 提供整合式芯片实验室装置，其包括样品入口、裂解单元、核酸提取单元、混合单元，以及裂解流体、第一洗涤缓冲液、洗脱流体和混合流体的储器；(ii) 通过所述装置的所述样品入口装入样品；(iii) 通过使来自所述裂解流体储器的裂解流体经过所述细胞和/或颗粒而对所述样 品中的细胞和/或粒子进行裂解，(iv) 使所述裂解流体经过所述核酸提取单元以提取核酸；(v) 将来自所述第一洗涤缓液冲储器的第一洗涤缓冲液运送经过所述核酸提取单元；和(vi) 将来自所述洗脱液储器的洗脱流体运送经过所述核酸提取单元，以产生来自核酸 提取单元的洗脱样品。其中，所述裂解流体、第一洗涤缓冲液和洗脱流体由单个泵驱动。
全文摘要
本发明提供用于对含有细胞和/或颗粒的流体样品进行核酸提取过程的整合式芯片实验室装置，所述装置包括(a)用于装载流体样品的样品入口(1)；(b)用于裂解流体样品中存在的细胞和/或颗粒的裂解单元(4)；(c)用于所述裂解单元的裂解流体储器(7)；(d)所述裂解单元下游的核酸提取单元(5)；和(e)用于核酸提取单元的第一洗涤缓冲液和洗脱流体的储器(8、9、10)，其中该装置还包括(f)核酸提取单元下游的混合单元(6)；和(g)用于所述混合单元的混合流体源(11)。所述裂解流体、第一洗涤缓冲液和洗脱流体的储器设置为互相平行，以使得它们可以用单个泵驱动。
文档编号B01L3/00GK101765463SQ200880023815
公开日2010年6月30日 申请日期2008年6月9日 优先权日2007年6月7日
发明者克劳斯·斯特凡·德雷泽, 利夫·富鲁贝格, 安雅·格利克森, 弗兰克·卡尔森, 托比亚斯·拜尔, 托马斯·翰森-哈格, 拉斯·A·索利, 雷纳·格兰泽 申请人:诺奇普公司