冠状病毒hku1实时荧光pcr检测试剂盒及其非诊断性检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种冠状病毒HKU1实时荧光PCR检测试剂盒及其非诊断性检测方法，在HCoV-HKU1基因的保守区域设计引物及Taqman?MGB探针，优化反应体系和反应条件，分析TaqMan?MGB探针实时荧光PCR方法的特异性、最低检测限和重复性，并确定CUT?OFF值。结果HCoV-HKU1实时荧光PCR方法最低检测量为4.96×101Copies/mL。该方法针对其他病原微生物及类基因组无反应信号，特异性好。4个梯度稀释质粒样品的4次重复检测CT值变异系数均小于5%，说明重复性好。结论HCoV-HKU1实时荧光PCR检测方法特异性好、敏感性高、稳定性好，在临床鉴别诊断和口岸冠状病毒的检测中具有很好的应用前景。
【专利说明】冠状病毒HKU1实时荧光PCR检测试剂盒及其非诊断性检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种冠状病毒HKU1实时荧光PCR检测试剂盒及其非诊断性检测方法。【背景技术】
[0002]冠状病毒因其复制机制比较独特，同源RNA的重组频率很高，容易出现新的变异株。对于任何一种病毒都不能掉以轻心，应积极从来源、传播途径、病毒特点、所引发的疾病以及相应的检测和治疗等方面进行研究，才能避免像SARS那样的灾难。快速而敏感的检测方法的建立，对于冠状病毒HKU1 (HCoV-HKUl)以及目前尚未发现的冠状病毒变异株的检测有重要的意义。分子生物学技术为WHO (世界卫生组织)推荐的病原检测手段，其可在短时间内确认病原、大幅节约检测时间和成本，敏感度和特异性也超越现有各类实验室检测手段。
【发明内容】
[0003]针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种冠状病毒HKU1实时荧光PCR非诊断性检测方法，该方法能够对病毒快速、灵敏、高效的检测，本发明的另一目的是提供一种实施上述方法的冠状病毒HKU1实时荧光PCR检测试剂盒。
[0004]为实现上述目的，本发明冠状病毒HKU1实时荧光PCR非诊断性检测方法，其设计的引物和探针为:
【权利要求】
1.冠状病毒HKU1实时荧光PCR非诊断性检测方法，其特征在于，其设计的引物和探针为:
2.如权利要求1所述冠状病毒HKU1实时荧光PCR非诊断性检测方法，其特征在于，所述非诊断性检测方法的具体步骤为:1)设计所述引物和探针；2)提取病毒RNA；3)实时荧光PCR扩增及分析:通过调整反应体系中探针和引物的反应浓度，选择最佳反应体系。
3.如权利要求1所述冠状病毒HKU1实时荧光PCR非诊断性检测方法，其特征在于，所述反应体系为:2X One Step RT-PCR Buffer3 12.5 μ 1，TaKaRa Ex Taq HS0.5 μ 1,PrmieScrip RT Enzyme Mix2 0.5 μ 1，Primerl 0.2 μ 1，Primer2 0.2 μ 1,Probe 1 μ 1,ROXDye II 0.5 μ 1，Rnase Free dH20 4.6 μ 1。
4.如权利要求1所述冠状病毒HKU1实时荧光PCR非诊断性检测方法，其特征在于，所述反应体系的反应条件为:42°C 8min ；95°C 10s ；95°C 5s，58°C 34s，45Cycles。
5.如权利要求1所述冠状病毒HKU1实时荧光PCR非诊断性检测方法，其特征在于，所述非诊断性检测方法对冠状病毒HKU1的最低检测量为4.96X lOtopies/mL。
6.冠状病毒HKU1实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒中采用的引物和探针为:
【文档编号】C12Q1/70GK103710462SQ201310578974
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2013年11月18日 优先权日:2013年11月18日
【发明者】刘胜牙, 朱玉兰, 刘慧玲, 谢聪贤, 甄胜西, 张树平 申请人:深圳国际旅行卫生保健中心