一种a型h5n6亚型禽流感病毒双通道实时荧光pcr检测试剂盒和检测方法
【技术领域】
[00011本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种A型H5N6亚型禽流感病毒双通道实 时荧光PCR检测试剂盒和检测方法。
【背景技术】
[0002] 流感病毒是流行性感冒的病原体，属于正粘病毒科，为RNA病毒，根据流感病毒核 蛋白（Nucleoprotein，NP)和基质1蛋白（Matrix protein 1，M1)抗原性的不同，流感病毒可 分为A、B、C三型，其中A型流感病毒是正粘病毒科的唯一属，根据流感病毒表面血凝素 (hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(neuraminidase，NA)抗原性的不同，A型流感病毒可分 为18个HA亚型（H1-H18)和11个NA亚型（N1-N11)，H5N1亚型禽流感病毒(Avian inf luenza virus，AIV)表示一个禽流感病毒具有H5型HA蛋白和N1型ΝΑ蛋白。因此，在理论上，根据目前 已知的18个ΗΑ和11个ΝΑ亚型可以组合形成198个亚型流感病毒.人感染Α型流感病毒通常局 限于3种HA亚型（H1，H2和H3)和2种NA亚型（N1和N2)，而家禽和野生鸟类通常作为其他亚型 流感病毒的天然宿主。许多跨物种传播的禽流感病毒已经报道，如H5N1，H5N2，H9N2，H7N7， !17呢，!17似，!11(^7，!17册和!11(^8，尤其是!15附和!17册亚型禽流感病毒疫情造成了巨大的经 济损失和人感染死亡病例。
[0003] 2014年2月，一种新型的H5N6亚型重配禽流感病毒造成人类感染，截止2015年7月， 全球共报告5例人感染病例，全部病例发生在中国大陆，另外在老挝、越南及中国大陆的禽 及禽类市场环境中已检出H5N6亚型禽流感病毒，表明人感染H5N6亚型禽流感疫情形势不容 乐观。为了有效地控制人感染H5N6亚型禽流感疫情，早期、快速、特异和敏感的检测方法研 究成为当务之急。目前针对H5N6亚型禽流感病毒的检测主要依赖病毒培养、核酸检测和基 因测序等方法，其中实时荧光PCR方法因具有快速、特异、敏感的特点，已成为各大研究机构 和生物试剂公司优先研究开发的重点方向.
[0004] 随着分子生物学的快速发展，实时荧光PCR技术在流感分子诊断领域发展最快。 2004年Jurgen A.Richt等利用real-time RT-PCR技术进行了北美猪流感病毒的型别和亚 型的分子诊断，该体系每次只能进行一个型别或亚型的诊断.2006年multiplex PCR技术 被用于呼吸道病毒的分子诊断.2007年有人利用2套multiplex PCR对12种呼吸道病毒进行 了分子诊断，但这两种方法都靠凝胶电泳进行结果分析，且自身存在灵敏度差、易交叉污染 等不足。2007年real-time PCR被用于同时进行人禽流感病毒H5N1亚型的分子诊断.2008年 多重real-time PCR开始被用于常见呼吸道病毒的分子诊断.2009年多管多重荧光定量PCR 被用于检测新甲型H1N1流感病毒和季节性流感病毒.2010年单管多重荧光定量PCR开始被 用于流感病毒亚型分型.但因为流感病毒的多变性，目前尚没有针对新近发现的A型H5N6流 感病毒的单管多重荧光定量PCR试剂盒和诊断方法的报道.
【发明内容】
[0005] 本发明的目的之一在于提供一种快速、特异性强、灵敏度高的A型H5N6亚型禽流感 病毒双通道实时荧光PCR检测试剂盒，可用于H5N6亚型禽流感病毒的监测和临床诊断。
[0006] 本发明所述检测试剂盒具体包括以下组分：
[0007] (l)RT-PCR反应液：含有50mM MgS〇4、0.4mM dNTPs;
[0008] (2)引物和探针混合液:包含H5及N6特异性引物、探针，其中H5-F和N6-F引物浓度 均为20yM，H5-R和N6-R引物浓度均为40μΜ，Η5和N6探针浓度为20μΜ;扩增特异性引物的序列 如下：
[0009] Η5上游引物H5-F:5-ATTGCTCCAGAATATGCATA-3(Seq ID No:l);
[0010] H5下游引物H5-R:5-AGARTTTATCGCCCCTATTG-3(Seq ID No:2);
[0011] H5特异性探针H5-probe: 5-荧光报告基团-CAAAATWGTCAAGAAAGGGG-荧光猝灭基 团-3(Seq ID No:5);
[0012] N6上游引物N6-F:5-CTAGGGTCGARTGCATAGGATG-3(Seq ID No:3);
[0013] N6下游引物N6-R:5-TACCACACYACTGCCGATGC-3(Seq ID No:4);
[0014] N6特异性探针N6-probe:5-荧光报告基团-AAGCACGTCATGCCAYGATG-荧光猝灭基 团-3(Seq ID No:6);
[0015] (3)酶混合液:含有逆转录酶、Taq酶；
[0016] (4)阳性标准品为含H5N6亚型禽流感病毒特异性HA和NA基因片段DNA浓度分别为 3.6 ng/yL和3.3ng/yL的质粒混合物；
[0017] (5)阴性标准品为ddH2〇。
[0018] 上述A型H5N6亚型禽流感病毒HA和ΝΑ基因的双通道核酸检测试剂盒扩增反应液每 管20.0 yL，最优组成为:RT-PCR反应液16. OyL、引物和探针混合液3. OyL、酶混合液1. OyL.
[0019] 本发明的双通道荧光PCR检测用引物具体包括两对引物及其各自对应的探针，分 别扩增、检测H5基因和N6基因.
[0020] 本发明的探针一端标记有荧光报告基团，探针另一端标记有荧光猝灭基团，荧光 报告基团可以为常见的所述的荧光报告基团包括:MAR、JUP、URA、NEP、PLU、FAM、HEX、JOE、 NED、TET、R0X或CY5;荧光猝灭基团包括:了六11^、8即1、8即2，两条探针的荧光报告基团不相 同即可.优选的，H5探针标记的焚光报告基团为FAM焚光基团，N6探针标记的焚光报告基团 为Hex，所述的荧光猝灭基团均为BHQ1.
[0021] 本发明的酶混合物，由逆转录酶和Taq酶组成，所述的逆转录酶为鼠白血病病毒逆 转录酶，Taq酶为常见的耐热Taq聚合酶。两种酶的浓度分别为2IU/yL和2IU/yL。
[0022] 本发明的反应体系中，所述的RT-PCR反应液、引物和探针混合液、酶混合液可以分 开单独保存，也可以混合在一起，优选混合在一起保存.
[0023]本发明所述的阳性标准品，可以为含有H5基因和N6基因的DNA片段，该DNA片段可 以为PCR扩增后产物、质粒、人工合成基因.
[0024] 本发明样本核酸的提取，可参考现有病毒RNA提取技术，优选试剂盒提取法。
[0025] 本发明试剂盒的PCR扩增程序为:①50°C30min，②95°C10min，③95°C15sec，④55 °C45sec，其中③-④循环40次，荧光收集在步骤④。
[0026] 本发明的另一目的在于提供一种利用本试剂盒进行检测的方法，包括以下步骤： [0027] (1)病毒RNA的提取；
[0028] (2)试剂配置:在标明编号的PCR反应管中加入扩增反应液16.OyL、引物和探针混 合液3. OyL、待检模板5. OyL和酶混合液1. OyL;阳性标准品反应管和阴性标准品反应管中各 加入5.0μΙν^准品；
[0029] (3)PCR扩增：将上述PCR反应管混匀、离心后置于荧光定量PCR仪上，设置扩增程 序：①50°C30min，②95°C10min，③95°C15sec，④55°C45sec，其中③-④循环40次，④收集 信号.
[0030] (4)PCR反应结束后，检测PCR反应体系的荧光信号值，阈值设定原则以阈值线刚好 超过阴性标准品样本荧光值最高点，荧光通道优先FAM和HEX通道.
[0031] 结果判读:在仪器正常、阳性标准品和阴性标准品均正常的情况下进行结果分析， 阳性标准品Ct < 35.0，阴性标准品Ct 2 38.0，PCR扩增有效.
[0032] FAM通道：1)阳性:待测样本检测结果Ct< 35.0,扩增曲线呈S型且有明显指数增长 期，判断为H5亚型禽流感病毒阳性;2)阴性:待测样本检测结果Ct>38.0,判断为H5亚型禽 流感病毒阴性;3)可疑:待测样本结果35.0<Ct<3