一种检测禽流感病毒及其h9、n2亚型的引物及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测禽流感病毒及其H9、N2亚型的引物及其应用，属于生物技术 领域。
【背景技术】
[0002] 禽流感（avian influenza，AI)是由禽流感病毒（AIV)感染宿主后引起从无症 状带毒到全身性败血等不同临诊症状的一类重要传染病，危害严重，能够对养禽业造成毁 灭性的影响，是世界各国重点检疫和防范的对象。H9N2亚型AIV是低致病性禽流感病毒 (Lowly pathogenic avian influenza virus，LPAIV)，可引起呼吸道症状、产蛋率下降等， 在其继发其它病毒或细菌混合感染的情况下则可引起更严重的损失。自上个世纪90年代 末，H9N2亚型AIV在亚洲南部、非洲南部、欧洲以及中东地区均有报道。目前仍在我国大范 围流行并形成地方流行性疾病，其发病率占总禽流感发病率的90%以上。H9N2亚型AIV不 仅能对我国养禽业造成损失，还能跨越种属屏障由禽类直接或间接传染给哺乳动物甚至人 类，具有重大公共卫生意义。N2亚型是能导致禽类感染的常见NA亚型，在我国主要是H9N2 亚型，但是其它N2亚型禽流感同样应引起引起人们的重视，如H5N2亚型禽流感在历史上曾 多次爆发，仇保丰等调查发现华东地区家鸭内的绝大多数N2亚型的AIVs发生了 NA基因的 重排并且正处于不断的进化状态。
[0003] 目前检测AIVs常见方法主要是利用传统的病原学分离鉴定与血清学试验，该方 法耗时较长且敏感性较差，并不能同时检测多种亚型。多重RT-PCR以其操作简单快捷、特 异性好、敏感性高的优点，在临床上具有较高的应用价值。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种检测禽流感病毒及其H9、N2亚型的引物及其应用。
[0005] 本发明提供一组引物，由如下（1)-(6)所示的DNA分子组成：
[0006] (1) SEQ ID No. 1 所示的 DNA 分子；
[0007] (2) SEQ ID No. 2 所示的 DNA 分子；
[0008] (3) SEQ ID No. 3 所示的 DNA 分子；
[0009] (4) SEQ ID No. 4 所示的 DNA 分子；
[0010] (5) SEQ ID No. 5 所示的 DNA 分子；
[0011] (6) SEQ ID No. 6 所示的 DNA 分子。
[0012] -种鉴定或辅助鉴定待测样品中禽流感病毒及待测样品中H9亚型和/或N2亚型 禽流感病毒的试剂盒也属于本发明的保护范围，该试剂盒包含上述引物。
[0013] -种鉴定或辅助鉴定待测样品中禽流感病毒及待测样品中H9亚型和/或N2亚型 禽流感病毒的方法也属于本发明的保护范围，包括如下步骤：以待测样品的cDNA为模板， 以上述引物为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；如果PCR扩增产物含有大小为667bp 的条带，则待测样品候选为含有禽流感病毒的样品；如果PCR扩增产物同时含有大小分别 为667bp和313bp的条带，则待测样品候选为含有H9亚型禽流感病毒的样品；如果PCR扩 增产物同时含有大小分别为667bp和45lbp的条带，则待测样品候选为含有N2亚型禽流感 病毒的样品；如果PCR扩增产物同时含有大小分别为667bp、451bp和313bp的条带，则待测 样品候选为含有H9N2亚型禽流感病毒的样品；
[0014] 所述大小为667bp的条带是以SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6所示的DNA分子为引 物进行PCR扩增得到的；
[0015] 所述大小为451bp的条带是以SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示的DNA分子为引 物进行PCR扩增得到的；
[0016] 所述大小为313bp的条带是以SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示的DNA分子为引 物进行PCR扩增得到的。
[0017] 上述方法中，所述PCR的反应体系如下：2XPCR扩增缓冲液12. 5uL，浓度均为 25pmol/uL的SEQ ID No. 1所示的DNA分子和SEQ ID No. 2所示的DNA分子各0. 5 μ L，浓度 均为25pmol/uL的SEQ ID No. 3所示的DNA分子和SEQ ID No. 4所示的DNA分子各0. 7 μ L， 浓度均为25pmol/uL的SEQ ID No. 5所示的DNA分子和SEQ ID No. 6所示的DNA分子各 〇· 4 μ L，模板cDNA luL，加 ddH20补足体系至25uL ;
[0018] 所述2XPCR扩增缓冲液的商品名称为2XEasyTaq PCR SuperMix，购自北京全式 金生物技术有限公司，产品目录号为AS111-02。
[0019] 上述任一所述的方法中，所述PCR的反应程序如下：94°C 5min ;94°C 40s， 54°C 40s，72°C lmin，35 个循环；72°C延伸 10min，最后 4°C结束反应。
[0020] 上述引物在制备鉴定或辅助鉴定待测样品中禽流感病毒及待测样品中H9亚型和 /或N2亚型禽流感病毒的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
[0021] 上述试剂盒在制备鉴定或辅助鉴定待测样品中禽流感病毒及待测样品中H9亚型 和/或N2亚型禽流感病毒的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
[0022] 上述任一所述的应用中，所述禽流感病毒为如下任一种亚型：H9N2、H1N2、H3N2、 H4N2、H5N2、H6N2、H7N2。
[0023] 本发明根据基因库中H9亚型AIV的HA基因、N2亚型AIV的ΝΑ基因以及AIV Μ基 因序列，分别设计了 3对针对Η9亚型AIV的ΗΑ基因和Ν2亚型AIV的ΝΑ基因及所有AIV的 Μ基因的保守序列的引物，建立了 AIV Η9、Ν2亚型和Μ基因的三重RT-PCR检测方法。应 用本发明提供的方法对Η9Ν2亚型AIV模板进行RT-PCR扩增，可得到3条目的条带，分别为 313bp(H9-AIV)、451bp(N2-AIV)和 667bp(M gene);对非 Η9 亚型的 Ν2 亚型 AIV 模板进行扩 增，出现2条特异性扩增条带，即451bp (N2-AIV)和667bp (M gene);对非N2亚型的H9亚 型AIV模板进行扩增，出现2条特异性扩增条带，即313bp (H9-AIV)和667bp (M gene);对 非H9、N2亚型AIV模板进行扩增则只出现一条目的条带，即667bp (M gene);对其它禽呼吸 道病原体进行PCR扩增，结果均为阴性。敏感性试验结果表明本发明的方法最低检出限为 10pg/ μ L。应用本发明所建立的三重RT-PCR方法对120份临床病料进行检测的结果与病 毒分离鉴定结果相一致。
[0024] 因此，本发明建立的三重RT-PCR是一种简便、快速、有效的检测AIV且能同时进行 H9、N2亚型AIV分型检测的技术，具有较好的应用前景。
【附图说明】
[0025] 图1为特异性检测结果。
[0026] 图2为三重RT-PCR对20株H9N2亚型AIV的扩增结果。
[0027] 图3为敏感性检测结果。
[0028] 图4为临床样品检测结果。
【具体实施方式】
[0029] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0030] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0031] 病毒DNA/RNA抽提试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司，产品目录号为 ER201-01。
[0032] 2XEasyTaq PCR SuperMix购自北京全式金生物技术有限公司，产品目录号为 AS111-02。
[0033] AMV反转录酶、5XAMV Buffer均购自宝生物工程（大连）有限公司，产品目录号 为 2621。
[0034] H9N2 亚型 AIV(A/turtledove/Guangxi/49B6/2013(H9N2))在文献"Xu Q，Xie Z X, Xie L J, et al. Characterization of an Avian Influenza Virus H9N2Strain Isolated from a Wild Bird in Southern China[J]. Genome Announc. 2014Jun 19 ；2(3). pii : e00600-14. doi : 10. 1128/genomeA. 00600-14. "中公开过，公众可从广西壮族自治区兽 医研究所获得。
[0035] H1N1 亚型 AIV(A/Duck/Guangxi/030D/2009(H1N1))在文献"彭宜，谢芝勋，郭 捷，等.利用RT-LAMP可视化检测技术检测H1亚型禽流感病毒及N1、N2亚型的分型"，病 毒学报，2013, 29 (2) : 154-159. "中公开过，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
[0036] H1N2 亚型 AIV(A/Sparrow/Guangxi/GXs-l/2012(HlN2))在文献"郭捷，谢 芝勋，彭宜，等.一株鸟源H1N2型禽流感病毒全基因序列分析[J].中国兽医学 报，2014, 34 (6) :874-820. "中公开过，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
[0037] H：3N2 亚型 AIV(A/Duck/Guangxi/N42/2〇〇9(H3N 2))在文献"Peng Yl，Xie Z, Liu J, et al.Visual detection of H3subtype avian influenza viruses by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay. Virology Journal，2011，8:337. "中公开过，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
[0038] H3N6 亚型 AIV (A/Pigeon/Guangxi/020P/2009 (H3N6))序列信息收录于 NCBI 基因 库，登录号为 KM186122-KM186129。
[0039] H3N8 亚型 AIV(A/Goose/Guangxi/020G/2009(H3N8))在文献"Liu T，Xie Z, Song D, et al. Genetic Characterization of a Natural Reassortant H3N8Avian Influenza Virus Isolated from Domestic Geese in Guangxi, Southern China. Genome Announc. 2014, 2 (4) : e00747-14. "中公开过，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
[0040] H4N2 亚型 AIV(A/duck/Guangxi/12roi7/2012(H4N2))序列信息收录于 NCBI 基因 库，登录号为 KJ881013-KJ881020。
[0041] H4N5 亚型 AIV(A/Duck/HK/668/79(H4N5))在文献"Zhixun Xie, Yao-shan Pang,Jiab