一种细胞裂解方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学和生物技术领域，尤其涉及一种细胞裂解方法以及使用该 细胞裂解方法获得的细胞裂解物直接进行PCR的方法。
【背景技术】
[0002] 在过去数十年中，PCR已成为用于DNA分析的"役用马（working horse) "，因为 它允许指数扩增核酸。然而，进一步改善用于PCR分析的作业流程仍是挑战，特别是如果分 析仅可以对源于较小数目细胞的DNA执行。
[0003] 此外，在转基因动物细胞的筛选及鉴定过程中，要获得表达量高的细胞株或双敲 除的细胞株往往需要对许多细胞克隆进行PCR鉴定，而基因组DNA模板的制备对PCR的扩 增必不可少。传统的DNA抽提方法为酚-氯仿抽提法，但该方法耗时耗力，步骤繁琐，而且 酚-氯仿对人体有毒，因此该方法用的很少。目前DNA提取主要通过商业化的DNA提取试 剂盒。但是商业化试剂盒同样需要经过细胞裂解、DNA乙醇（异丙醇）沉淀和70%乙醇清 洗三步把DNA提取出来，耗费时间和精力，且成本较高。如果将细胞直接裂解后以裂解液作 为模板进行PCR，不仅节省时间精力，而且成本低廉，十分适合高通量细胞鉴定。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提出一种可以用于直接进行PCR的细胞裂解方法，以及用该裂 解方法的细胞裂解物直接进行PCR的方法；本发明的用细胞裂解物直接进行PCR的方法不 但能绕开DNA提取步骤，省时省力，而且其扩增效率高，以较少细胞的裂解物即能进行PCR 检测。
[0005] 为达此目的，本发明采用以下技术方案：
[0006] 第一方面，本发明提供了一种细胞裂解方法，所述方法包括：
[0007] (1)将待测细胞与细胞裂解液按比例进行混合；所述细胞裂解液包括Tris-HCl、 EDTA和蛋白酶K ;
[0008] (2)将步骤（1)所得混合物在30°C~70°C孵育5~30min，然后在92-98°C变性 8 ~12min〇
[0009] 对于上述细胞裂解方法：
[0010] 步骤（1)中，作为优选，所述细胞裂解液包括彡lOOmM的Tris-HCl、彡30mM的EDTA 和彡300 μ g/ml的蛋白酶K，其pH为7. 6-8. 4;
[0011] 进一步优选地，所述细胞裂解液包括10mM的Tris-HCl、10mM的EDTA和100μ g/ml 的蛋白酶K，其pH为7.8-8. 2 ;
[0012] 更进一步优选地，所述细胞裂解液包括10mM的Tris-HCl、10mM的EDTA和100μ g/ ml的蛋白酶K，其pH为8.0。
[0013] 此外，步骤⑴中，作为优选，待测细胞与细胞裂解液的混合比例为 800000-1500000个细胞/ml裂解液，优选为1000000个细胞/ml裂解液。
[0014] 步骤⑵中，作为优选，所述孵育为在40°C~60°C孵育5~30min，更优选在55°C 孵育5min。
[0015] 步骤（2)中，作为优选，所述变性为在94-96°C变性8~12min，更优选在95°C变性 10min〇
[0016] 上述细胞裂解方法中，所述待测细胞为动物细胞；优选地，所述待测细胞为猪、小 鼠或人类的各种细胞。
[0017] 第二方面，本发明提供了一种用细胞裂解物直接进行PCR的方法，该方法为：使 用如第一方面所述的细胞裂解方法裂解细胞，将所得细胞裂解物加入反应体系中直接进行 PCR。
[0018] 上述方法中，作为优选，每个PCR反应体系中使用500~60000个细胞的裂解产 物，更优选使用4000~30000个细胞的裂解产物，最优选使用20000个细胞的裂解产物。
[0019] 发明人发现，在用细胞裂解物直接进行PCR的实验中，从500~60000个细胞的裂 解物中都能扩增出目的条带，其中从4000~30000个细胞的裂解物中扩增的条带较亮，扩 增效率较好。因此，进行PCR检测的优选最低细胞裂解量为4000个细胞，最佳细胞裂解量 为20000个。
[0020] 在一个优选的实施方案中，每20 μ L PCR反应体系的组成如下：
[0021] 4μ L 5XHF buffer，0. 5μ L dNTP(各 2. 5mM)，0· 5μ L 上游引物，0· 5μ L 下游弓| 物，1 μ L细胞裂解液，0. 2 μ L phusion酶，用ddH20补足至20 μ L ;所述细胞裂解液的配方 为：10mM Tris-Cl(PH8.0)，10mM EDTA(PH8·0)，200μg/mL蛋白酶K。
[0022] 优选地，所述PCR反应程序如下：
[0023] 98°C，30s ; (98°C，10s ;6(TC，20s ;72°C，30s ~2min ;) X30 ~35 个循环；72。〇， lOmin ; 16°C,2min〇
[0024] 本发明的用细胞裂解物直接进行PCR的方法可扩增出长度达3200bp的DNA。
[0025] 第三方面，本发明提供了如第一方面所述的细胞裂解方法或如第二方面所述的用 细胞裂解物直接进行PCR的方法在转基因动物细胞检测中的应用。
[0026] 本发明提供的用细胞裂解物直接进行PCR的方法，无需提取动物细胞DNA ;与现有 的PCR方法相比，本发明的PCR方法绕开DNA提取步骤，省时省力，能够简单、快速、高效处 理各种动物细胞直接进行PCR扩增鉴定。使用该方法，仅需一步处理动物细胞样品，然后直 接取1 μ L处理液为模板完成PCR扩增。该方法特别适用于转基因动物细胞高通量细胞鉴 定。
【附图说明】
[0027] 图1为不同配方裂解液的细胞裂解物的PCR扩增结果；
[0028] 图2为不同Tris-HCl浓度、蛋白酶Κ浓度的裂解液的细胞裂解物的PCR检测结 果；
[0029] 图3为不同EDTA浓度的裂解液的细胞裂解物的PCR检测结果；
[0030] 图4为不同裂解温度的细胞裂解物的PCR检测结果；
[0031] 图5为不同裂解时间的细胞裂解物的PCR检测结果；
[0032] 图6为不同裂解细胞量的细胞裂解物的PCR检测结果；
[0033] 图7为本发明的细胞直接PCR对于不同扩增长度的扩增效果；
[0034] 图8为以细胞裂解物为模板与以DNA为模板进行的PCR的效果比较；
[0035] 图9为使用本发明的细胞直接PCR法检测转基因动物细胞；
[0036] 图10为图9的PCR产物的酶切鉴定基因剪切效率。
【具体实施方式】
[0037] 以下实施例仅用于说明本发明，而不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精 神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明的范围。
[0038] 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0039] 以下实施例中所用各引物的序列信息见表1。
[0040] 表1引物序列信息表
[0041]
[0042]
[0043] 实施例1四种某础细朐裂解液配方（IX)
[0044] 裂解液 1:10mM Tris-Cl (PH8. 0)，10mM EDTA(PH8. 0)，200 μ g/mL 蛋白酶 K，5 % SDS ；
[0045] 裂解液 2 : lOmM Tris-Cl (ΡΗ8· 0)，lOmM EDTA (ΡΗ8· 0)，200 μ g/mL 蛋白酶 K，5 % SDS,0. 1M KC1 ；
[0046] 裂解液 3 :10mM Tris-Cl (PH8. 0)，lOmM EDTA(PH8. 0)，200 μ g/mL 蛋白酶 K,
[0047] 裂解液 4 : lOmM Tris-Cl (PH8. 0)，lOmM EDTA (PH8. 0)，200 μ g/mL 蛋白酶 K，0· 1M KC1 ；
[0048] 0. 25 %胰酶消化PK15细胞，PBS清洗一次，2000rpm离心5min，去上清，加 500 μ LPBS重悬细胞，用Countstar自动细胞计数仪计数，取30000个PK15细胞，分别放入 6个1.5ml离心管中，加PBS补足到18 μ L，然后分别取上述4种不同的10X细胞裂解液 2 μ L，混匀，阴性对照直接加20 μ L PBS重悬细胞，55°C温育lOmin，95°C变性lOmin，直接取 1 μ L消化液作为模版，以提取的PK15细胞DNA为阳性对照模板，以未经裂解液处理的PK15 细胞为阴性对照模板，以ddH20为空白对照，以GHR2-F/R引物（序列信息见表1)进行PCR 扩增，扩增猪GHR基因452bp片段。
[0049] PCR 反应体系：5XHF buffer，0.5yL dNTP(各 2.5禮），0.5以1^上游引物，0.54 1^ 下游引物，1 μ L细胞裂解液（lOOng PK15细胞总