专利名称：细胞裂解物的药用组合物及其生产和使用方法
技术领域：
本发明涉及一种包含不能生活的(nonviable)细胞裂解物和至少一种抗絮凝剂和/或抗沉降剂的药用组合物。本发明中含有细胞裂解物的药用组合物以溶液或悬液或冷冻干燥物的形式存在，尤其是，均化的细胞裂解物组合物以溶液或悬液或冷冻干燥物的形式存在。本发明进一步公布了生产和使用该药用组合物的方法。
背景技术：
在生产溶液或悬液形式的不能生活的细胞制剂中的药用组合物例如细胞裂解物时，经常会遇到聚集、絮凝和/或沉降这些问题。此问题导致产物不均一，致使质或者量的不一致，尤其当产物不得不分装到多个容器时。此外，它也可能导致多批产物彼此间的不均一。
例如，在生产诸如角质细胞裂解物的伤口愈合组合物，尤其是培养的人角质细胞裂解物时，生产过程中的均化作用(裂解)步骤过后就会看到溶液或者悬液中含有的细胞裂解物快速的聚集、絮凝和部分沉降。这样的聚集、絮凝和/或沉降导致细胞裂解物溶液或者悬液的不均一并进一步使其工艺流程复杂化，有时，这甚至能造成组合物无法用于预期目的。所以，有必要做一些改动，该改动可通过防止絮凝或者沉降在均化作用前或均化作用后辅助流程步骤。
众所周知，化学试剂刺激导致沉淀的蛋白絮凝或者聚集。美国专利号4,565,635描述了一种水溶性化学试剂“黄原胶”，已知可作为絮凝佐剂。类似地，美国专利号3,956,519描述了一种方法，其中水溶液中的蛋白被溶解的脱支低-DE麦芽糖糊精或者脱支支链淀粉诱导聚集。
在制药部门，黄原胶被用于制造冷冻干燥药用片剂，正如WOApplication No.9501782中所描述的，其中黄原胶促进液体混合物中的颗粒治疗剂悬浮并且对片剂应用时的分散质量和结构没有任何不良作用。
相反，US 6,010,719描述了用黄原胶作为增稠剂，它提高了悬液的粘性且适合用来阻止固体药物颗粒沉降。类似地，黄原胶也被用于悬浮大的生物颗粒来达到稳定流式细胞术中细胞悬液从而阻止沉降的目的(Cytometry 10803-806(1989))。另一个例子表明黄原胶的存在抑制了乳清蛋白分离物的聚集和分层从而得到均一混合物(FoodHydrocolloids 12469-479(1998))。
然而，所有这些例子适应于相对简单原封未动的细胞悬液或特定的蛋白。
另一方面，裂解细胞得到细胞裂解物，它释放各种形式的多种组分，形成诸如蛋白、糖蛋白、多糖、脂类、核酸等组分的非常复杂的混合物。所有这些组分可能彼此相互作用，极大地增加了复合物形成和絮凝的可能性，最终得到一个不稳定的溶液或者悬液以及这些组分一部分的沉降。
因此，可见仍然需要提供一种含有细胞裂解物的均一、稳定的药用组合物。一个此类组合物的例子含有角质细胞裂解物，其适于伤口愈合目的。仍然需要以溶液或者悬液的形式提供此类细胞裂解物的药用组合物，该组合物是均化的且如有需要可进一步干燥或者冷冻干燥处理。
发明概述本发明涉及一种包含细胞裂解物和至少一种抗絮凝剂和/或抗沉降剂的药用组合物。
本发明进一步提供了一种干燥或者冷冻干燥形式的均一药用组合物。
本发明提供一种包含细胞裂解物和至少一种抗絮凝剂和/或抗沉降剂的药用组合物，其中抗絮凝剂和/或抗沉降剂是黄原胶。
本发明进一步提供一种药用组合物，其中抗絮凝剂和/或抗沉降剂是黄原胶和麦芽糖糊精的组合。
此外，药用组合物可能含有缓冲试剂。可用于这方面的缓冲液的例子包括柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、或者其他任何本领域已知的适当缓冲液，优选临床可接受的缓冲试剂。
本发明进一步提供了生产基本没有不一致性的溶液或者悬液形式的细胞裂解物药用组合物的方法。此药用组合物的实例为角质细胞裂解物的均一冷冻干燥药用组合物。
本发明也提供了生产溶液或者悬液形式的角质细胞裂解物的均一、无菌组合物的方法。
本发明中的药用组合物可能在多种治疗应用中有用而且可能进一步包含一种制药上可接受的载体或者媒介物或者受体。一个实例是在对诸如烧伤或者皮肤溃疡的伤口处理中有用的角质细胞裂解物组合物。
本发明提供了一种促进伤口愈合的药用组合物；其中所述组合物包括不能生活的角质细胞裂解物和制药上可接受的媒介物。所述制药上可接受的媒介物为干粉、悬液或者溶液。此外，在这一点上，所述制药上可接受的媒介物为凝胶、乳膏、软膏或者除凝胶外的生物相容基质。
本发明也提供了一种处理哺乳动物表面伤口以促进愈合的方法，包括以下步骤(a)将药用组合物施于所述表面伤口；且(b)促进所述表面伤口的愈合。
这里公开的本发明是溶液或者悬液或者其冷冻干燥形式的细胞裂解物药用组合物，其进一步特征为基本不存在不一致性。该细胞裂解物溶液或者悬液或者其冷冻干燥形式包括黄原胶和/或麦芽糖糊精，该黄原胶和/或麦芽糖糊精作为抗絮凝剂用以防止可能沉降的溶液或者悬液中形成絮凝。
本发明公开了一种生产均化的药用组合物的方法，包括培养、裂解以及干燥细胞，该方法特征为，裂解后立即加入抗絮凝剂和/或抗沉降剂以稳定细胞裂解物混合物。所述试剂为黄原胶或黄原胶和麦芽糖糊精的组合，它可以防止可能会在溶液或者悬液中沉降的絮凝形成。而且，此方法可以任选地包括冷冻干燥或者干燥溶液或者悬液以获得无水产物。
发明详述本发明的药用组合物为溶液或者悬液形式的细胞裂解物组合物。这些含有细胞裂解物的药用组合物进一步包括了一种缓冲成分和至少一种抗絮凝剂和/或抗沉降剂。这些组合物可能经冷冻干燥或者干燥进一步处理，得到具有更加长期稳定性的基本无水的产物。
本发明的上下文中，术语“不一致性”指细胞裂解物组合物非均一的状况，其方式为一部分裂解物的组合物可能不同于另一部分裂解物的组合物。
术语“细胞裂解物”指通过裂解细胞获得的不能生活的细胞悬液或其级分。本发明的溶液或者悬液中的细胞裂解物可能是裂解步骤后获得的整个细胞、细胞部分或者任何级分或者它们的混合物。
细胞裂解物可以通过本领域技术人员熟知的多种方法中任何一种来获得。例如，整个细胞可以如US 6,126,935中描述的那样来获得。细胞的部分可以通过裂解整个细胞，将所得裂解物离心来获得，其中所得细胞裂解物的某些部分在沉淀部分，而所得细胞裂解物的某些其他部分在上清液中，且两部分只有一部分被使用。在US 6,126,935中公开了这种方法的一个例子。
术语“细胞裂解”指任何类型的细胞(即原核的或者真核的)并且包括用化学、生物、机械或者热处理等可能导致细胞生物组分释放的处理方法来破碎细胞(以溶液或者悬液形式存在)的细胞壁和/或细胞膜的作用。
现已开发并公布了许多机械裂解方法。其中包括压力、空化(cavitation)、声波或者超声波、机械振荡或者机械研磨(Sadeva，Biopharm 7(2)26-36，1994)。
细胞裂解物可以通过机械均化细胞获得。本发明角质细胞裂解物可以优选采用US 6,126,935中描述的方法获得。
应该明白，文中用到的术语“均化作用或者均化”是指通过以这样的方式使所述混合物均一来处理细胞裂解物混合物，从而保证上述混合物任何给定部分与同一混合物其它任一部分有相同的组成和理化性质。某些均化作用过程也会导致细胞裂解，在此意义上术语均化作用或者均化也可能指裂解。
本发明组合物中的细胞裂解物的浓度依组合物中细胞裂解物的类型而变化，同时也依其预期的应用变化。在这一点上，细胞裂解物浓度为0.02到5％w/v(百分数指细胞裂解物中总蛋白的重量百分数，用适当的蛋白定量分析确定)。优选地，细胞裂解物浓度为0.05到2％w/v。更优选地，细胞裂解物浓度为0.1到1％w/v。
本发明的溶液/悬液的液体成分可能为任何适于支持溶液或者悬液中细胞裂解物的液体。此类液体成分的实例为水、油或者乳浊液(诸如油包水或者水包油乳浊液)以及其它类似液体。
本发明涉及角质细胞裂解物药用组合物的情形中，预期会用到氯化钠等渗溶液(用来调节渗透性)、磷酸盐缓冲液和已裂解的细胞。优选地，补加一种lyoprotectant(诸如蔗糖、麦芽糖糊精、甘氨酸、山梨糖醇、海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇或者其它任何一种合适的lyoprotectant或者它们的组合)和一种柠檬酸盐缓冲液(诸如柠檬酸钠)的溶液来辅助随后冷冻干燥组合物。
此外，本发明的药用组合物还可能含有其它缓冲液或缓冲液系统。此类缓冲液的实例可能包括磷酸盐、柠檬酸盐或者其它任何一种可作为pH-缓冲液的组合物。
一个特殊的实施方案中，本发明涉及一种药用组合物，该组合物通过如下方法获得，该方法包括裂解细胞的步骤，而后向不能生活的细胞裂解物溶液或者悬液中加入至少一种抗絮凝剂和/或抗沉降剂。
在一个特殊的实施方案中，本发明提供了一种含有细胞裂解物和抗絮凝剂和/或抗沉降剂的药用组合物，其中抗絮凝剂/抗沉降剂为黄原胶。
黄原胶可以通过商业途径或者发酵得到。本发明中细胞裂解物的药用组合物中黄原胶的浓度为0.001到5％w/v，更优选0.01到1％w/v，最优选0.05到0.5％w/v。
在特定实施方案中，本发明涉及角质细胞裂解物的药用组合物，应用黄原胶可帮助防止角质细胞裂解物溶液或者悬液在使用或者进一步处理前或者过程当中絮凝和沉降。因此，避免了溶液或者悬液中形成不一致。这有助于进一步处理和利用角质细胞裂解物溶液或者悬液制成用于伤口愈合的组合物，例如，处理皮肤溃疡或者烧伤。
在一个特殊的实施方案中，本发明提供了一种含有细胞裂解物和抗絮凝剂和/或抗沉降剂的药用组合物，其中抗絮凝剂/抗沉降剂为麦芽糖糊精。
本发明溶液/悬液中麦芽糖糊精浓度为0.01到10％w/v。或者；也可以使用浓度为0.5到2％w/v的麦芽糖糊精。
在这一点上，应该注意在某些情形中，希望本发明的组合物有一个特定的pH和/或保持在特定的pH范围。例如，对于本发明中角质细胞的药用组合物，优选组合物的pH基本维持在6.8。因此，可用一种缓冲溶液来达到这一目的。在这方面有用的缓冲液的实例包括柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液或者本领域已知的其它任何一种适当缓冲液，优选那些也被临床接受的。最终溶液或者悬液中含有的缓冲液的确切浓度将根据包括缓冲液强度和组合物所需的pH等多种因素而变化。但是，在此可以预见，当涉及角质细胞裂解物悬液时，本发明的组合物中缓冲液终浓度为5到200mM，优选10到100mM，更优选20到50mM。这可以通过向组合物中加入缓冲液浓缩贮存液来实现，例如加入浓度大约1500mM的贮存液。
在需要干燥或者冻干本发明的药用组合物，特别是本发明溶液/悬液时，它们可能还要包括蔗糖。本发明组合物中蔗糖浓度根据组合物类型和组合物的用途而变化。在这一点上，蔗糖浓度为1到30％w/w，优选2到20％w/w，更优选5到10％w/w。这可以通过向组合物中加入蔗糖粉或者蔗糖浓缩贮存液来实现，例如加入浓度大约50％的贮存液。很明显，除了蔗糖也可以使用另一种适当浓度的lyoprotectant，诸如甘氨酸、海藻糖、山梨糖醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇或者其它任何一种本领域已知的适当的lyoprotectant或者它们的组合。
本发明的药用组合物可能进一步包含了所涉及的特殊细胞裂解物和/或组合物的预期用途需要的其它不同成分。
本发明的溶液/悬液也有可能进一步包含了附加的组分，它们中的一些是取得生物(细胞)材料的结果。这些成分的实例包括蛋白、培养基、洗涤介质和其它易于絮凝和/或沉降或者促使其它组分絮凝和/或沉降的有机和/或无机材料。
这些附加的组分的确切浓度主要依赖于组合物、组合物的用途以及涉及的确切的附加组分而变化。
在特殊的实施方案中，本发明涉及一种生产均化的药用组合物的方法，包括培养、裂解和干燥细胞的步骤，所述方法的特征在于，裂解之后立即加入抗絮凝剂和/或抗沉降剂以稳定细胞裂解物混合物。
在特殊实施方案中，本发明涉及一种生产均化的药用组合物的方法，包括培养、裂解和干燥细胞的步骤，所述方法的特征在于，裂解之后立即加入黄原胶作为抗絮凝剂和/或抗沉降剂以稳定细胞裂解物混合物。
在特殊实施方案中，本发明涉及一种生产均化的药用组合物的方法，包括培养、裂解和干燥细胞的步骤，所述方法的特征在于，裂解之后立即加入黄原胶与麦芽糖糊精的混合物作为抗絮凝剂和/或抗沉降剂以稳定细胞裂解物混合物。
在特殊实施方案中，本发明涉及一种生产溶液或者悬液或者冷冻干燥的溶液或者悬液形式的多种生物材料的药用组合物的方法，其中含有生产溶液或者悬液或者冷冻干燥的溶液或者悬液形式的细胞裂解物组合物时用到的组合物。用本发明的方法生产溶液或者悬液或者冷冻干燥的溶液或者悬液形式的角质细胞裂解物组合物是一特殊应用。
通过组合(例如，混合)细胞裂解物和一种或者多种适合的可能为液体形式的赋形剂来形成溶液或者悬液，其中细胞裂解物可通过任何一种本领域技术人员已知的方法获得。这可以通过任何一种本领域技术人员已经熟知的方法实现，该方法适于应用特殊生物材料和/或包括在内的液体组分。在此可以预期(正如上文讨论的)，尤其在涉及到角质细胞的情形中，细胞裂解物的溶液或者悬液会通过下面的方式形成，即，分别或者同时得到细胞裂解物和赋形剂(可能为液体形式)，以能形成细胞裂解物溶液或者悬液的方式混合细胞物质和赋形剂。
角质细胞裂解物可以制备成0.9％(w/w)氯化钠、磷酸缓冲盐溶液或者其它任何一种合适介质的等渗溶液的形式。然后将细胞裂解物机械均化，如有需要于-70℃保存。然后解冻冷冻的均化物并通过添加赋形剂进行补充，该赋形剂由6.5％终浓度的蔗糖(作为lyoprotectant)和30mM终浓度的柠檬酸盐组成。
本发明方法中，细胞裂解物的浓度以及加到组合物中的液体组分的浓度将依据组合物中细胞裂解物的类型和预期的用途而变化。
可以用任何一种适当的、本领域技术人员熟知的方式向细胞裂解物悬液或者溶液中添加黄原胶。例如，可以在有助于溶解并在溶液或者悬液中均匀分散的条件下向溶液或者悬液中加入固态的黄原胶，或者可以在加入到细胞裂解物悬液/溶液以前，先将其溶于液体，诸如水中。正如上文提到的，均化作用之后立即加入黄原胶允许它发挥抗絮凝/抗沉降的特性，无需把黄原胶加到均化作用步骤，那样会给它的粘性带来负面影响。
在特殊实施方案中，本发明中生产溶液或者悬液形式细胞裂解物组合物的方法可能在加入黄原胶以前进一步包括了均化本发明的细胞裂解物形成的组合物。
可以采用任何一种已知的适当的且为本领域技术人员熟知的均化技术进行均化，包括机械方法和化学方法，且在裂解所需细胞所需的方法条件下。
在这一点上，用高压均化作用来均化溶液或者悬液对角质细胞裂解物溶液/悬液尤其重要。此类均化作用可用任何适当的设备，诸如细胞破碎机(cell breaker)(Constant Systems，英国)来进行。在此特定实施方案中，均化作用在4到20℃2000巴压力下进行。产物为悬液形式的细胞裂解物。在这一点上应该注意，传统上抗絮凝剂在均化前加到细胞裂解物组合物中。这样做是为了简化过程且帮助阻止均化过程中的絮凝。但是，这可能也会对抗絮凝剂的粘性性质产生负面影响，尤其当用黄原胶作为抗絮凝剂时，会造成组合物形成不一致。
令人惊奇的是，这里我们已经发现，在均化作用之前组合物中没有必要存在抗絮凝剂和/或抗沉降剂。我们已经发现，如果在(高压)均化作用以后立即向组合物中加入抗絮凝剂和/或抗沉降剂，组合物中的絮凝依然能被基本阻止同时抗絮凝剂的粘性性质不会受负面影响。本发明中生产溶液或者悬液形式的细胞裂解物组合物的方法可能进一步由向本发明的细胞裂解物组合物中加入上面也曾提到的浓度的柠檬酸盐缓冲液和/或蔗糖(二者可以像上面描述的那样获得)组成。
正如此处公开的，本发明的组合物和方法尤其适用于且尤其有利于形成溶液或者悬液形式的角质细胞裂解物的药用组合物。在这一点上，角质细胞裂解物可以如US 6,126,935中描述的那样获得。
在特定实施方案中，在此公布的是溶液或者悬液形式的细胞裂解物的药用组合物，尤其是溶液或者悬液形式的角质细胞裂解物，或者它们的冷冻干燥形式，其浓度为0.2到50mg/ml，优选5到20mg/ml，更优选1到10mg/ml(提供的浓度指裂解物中的蛋白浓度)。这些细胞裂解物的溶液/悬液包含黄原胶作为抗絮凝剂，以阻止形成可能会在溶液或者悬液中沉降的絮凝。本发明的细胞裂解物的药用组合物(溶液或悬液形式)中黄原胶的终浓度为0.001到5％w/v，更优选0.01到1％w/v，最优选0.05到0.5％w/v。
在特定实施方案中，本发明的细胞裂解物的药用组合物可能进一步包含麦芽糖糊精作为抗絮凝剂，以阻止形成可能会在溶液或者悬液中沉降的絮凝。
在一个实施方案中，本发明的细胞裂解物的药用组合物中麦芽糖糊精的终浓度为0.01到10％w/v，更优选0.1到5％w/v，最优选0.5到2％w/v。
在另一个实施方案中，本发明的细胞裂解物的药用组合物可能进一步包含柠檬酸盐缓冲液和/或蔗糖。
在特定实施方案中，本发明的细胞裂解物的药用组合物可能进一步包含赋形剂，尤其是形成凝胶的赋形剂。
在本发明的特定实施方案中，本发明的细胞裂解物组合物被均化。
在本发明的另一个特定的实施方案中，均化的组合物可能进一步进行干燥处理。干燥可以以本领域已知的多种方法进行，诸如蒸发、真空干燥、喷雾干燥、流化床干燥、红外线干燥、微波干燥或其它除去溶液或者悬液中水分的方法，只要干燥过程对最终组合物的性质没有负面影响。冷冻干燥是许多去除水分优选方法中的一个。
在本发明关于这方面的特定实施方案中，本发明的方法用来制造溶液或者悬液形式的细胞裂解物组合物，尤其是，溶液或者悬液形式，可能是干燥形式的角质细胞裂解物组合物。
在一个实施方案中，加到本发明细胞裂解物的药用组合物中的黄原胶的终浓度为0.001到5％w/v。在另一个实施方案中，黄原胶的浓度可能为0.05到0.5％w/v。
在特定实施方案中，本发明生产溶液或者悬液形式的细胞裂解物组合物的方法可能进一步包括向细胞裂解物组合物中加入麦芽糖糊精，从而麦芽糖糊精作为抗絮凝剂，阻止形成可能会在溶液或者悬液中沉降的絮凝。
在特定实施方案中，加到本发明的细胞裂解物药用组合物中的麦芽糖糊精终浓度为0.01到10％w/v。对大多数应用而言，麦芽糖糊精浓度0.5到2％w/v可能就足够了。
在特定实施方案中，本发明包括一种生产均化的药用组合物的方法，包括细胞培养、裂解以及干燥的步骤，所述方法的特征在于，通过高压均化作用裂解后立即加入黄原胶和/或麦芽糖糊精的混合物作为抗絮凝剂和/或抗沉降剂以稳定细胞裂解物混合物。
在特定实施方案中，本发明包括一种生产均化的药用组合物的方法，包括角质细胞培养、裂解以及干燥的步骤，所述方法的特征在于，通过高压均化作用裂解后立即加入黄原胶和/或麦芽糖糊精的混合物作为抗絮凝剂和/或抗沉降剂以稳定角质细胞裂解物混合物。
在本发明的另一方面，公开于此的是以本发明的方法获得的本发明的溶液或者悬液形式的细胞裂解物的药用组合物。
在本发明此方面的一个特定实施方案中，公开于此的是以本发明的方法获得的溶液或者悬液形式的角质细胞裂解物的药用组合物。在进一步的特定实施方案中，含有角质细胞裂解物的药用组合物为冷冻干燥或其它干燥形式。
在本发明另一个特定的实施方案中，公开于此的是一种通过施用含有有效量细胞裂解物或细胞裂解物级分的组合物来治疗伤口的方法。而且，组合物可以通过多种不同载体系统和药物剂量形式施用，例如乳膏、软膏、凝胶、粉末、喷雾剂、溶液、悬液、乳浊液、冻干粉末、气溶胶。
在另一个特定实施方案中，公开于此的是一种溶液或者悬液形式的细胞裂解物的组合物，获取方法包括形成溶液或者悬液形式的细胞裂解物，向溶液或者悬液形式的细胞裂解物组合物中加入至少一种抗絮凝剂和/或至少一种抗沉降剂，稳定已加入至少一种抗絮凝剂和/或至少一种抗沉降剂的细胞裂解物溶液或者悬液的组合物。
在特定实施方案中，公开于此的是本发明的细胞裂解物溶液或者悬液的组合物，获取方法包括在向不能生活的细胞裂解物溶液或者悬液的组合物中加入至少一种抗絮凝剂和/或至少一种抗沉降剂之前裂解细胞的步骤。高压均化作用可能为此类裂解方法之一。
在特定实施方案中，公开于此的是本发明的细胞裂解物溶液或者悬液的组合物，获取方法包括在向不能生活的细胞裂解物溶液或者悬液的组合物中加入浓度为0.001到5％w/v，更优选0.01到1％w/v，最优选0.05到0.5％w/v的黄原胶作为一种抗絮凝剂和/或至少一种抗沉降剂之前裂解细胞的步骤。高压均化作用可能为此类裂解方法之一。
在特定实施方案中，公开于此的是本发明的细胞裂解物溶液或者悬液的组合物，获取方法包括在向不能生活的细胞裂解物溶液或者悬液的组合物中加入浓度为0.001到5％w/v，更优选0.01到1％w/v，最优选0.05到0.5％w/v的黄原胶以及浓度为0.01到10％w/v，更优选0.5到2％w/v的麦芽糖糊精的组合混合物作为一种抗絮凝剂和/或至少一种抗沉降剂之前裂解细胞的步骤。高压均化作用可能为此类裂解方法之一。
在另一个实施方案中，本发明生产溶液或者悬液形式(可能是干燥或者冷冻干燥形式)的细胞裂解物的组合物的方法可能进一步由在向其中加入黄原胶后对细胞裂解物的组合物进行灭菌处理组成。这种灭菌可以通过化学处理、热处理(包括使用微波能)或者照射，诸如紫外线、γ射线或者电子束照射进行。当用γ射线或者电子束照射时，对组合物的灭菌优选在干燥(诸如冷冻干燥或者喷雾干燥)以后进行，以使可能对组合物的生物活性造成的影响最小化。
在描述了本发明的细胞裂解物组合物及其生产方法之后，现在给出下面的实施例仅是为了说明的目的而不意味着也不应该将其看作是限制性的。
对上面公开的组合物、程序、使用和方法可能会作一些不脱离本发明基本精神的改动。所以，本领域技术人员应该清楚，在附加的权利要求范围内，可能会以不同于此出特别描述的方式对本发明进行应用。
实施例实施例1培养人角质细胞以及制备角质细胞裂解物从新生儿包皮分离角质细胞。为使表皮和真皮分离，使包皮样品在含有25U/mL的分散酶(Dispase)的溶液中4℃温育过夜。收集表皮部分并进一步在含有0.05％胰蛋白酶和0.02％的EDTA的溶液中于37℃温育处理30分钟，以获得单个角质细胞。然后加入胰蛋白酶抑制剂中和胰蛋白酶，将细胞离心、重悬于含DMSO的深低温保藏溶液并在液氮中深低温保藏。
解冻后，用3T3饲养成纤维细胞技术(Rheinwald J和Green H.Cell(1975)6331-344Serial cultivation of strains of human epidermalkeratinocytesthe formation of keratinizing colonies from single cells)或者在可购得的低钙角质细胞培养基中培养分离的角质细胞。经过培养，在含有氯化钠和磷酸盐缓冲液的等渗溶液中通过机械刮取收集细胞，机械均化并在-70℃冷冻。解冻后，向所得的粗裂解液(BulkUnprocessed Product)中补充lyoprotectant(蔗糖)和柠檬酸盐缓冲液并用细胞破碎机(Constant Systems，英国)进一步通过高压均化作用进行处理。然后将所得的悬液(Bulk Formulated Lysate)装瓶和冻干。
实施例2用黄原胶和/或麦芽糖糊精防止絮凝和沉降如实施例1中描述的那样制备未处理的大量(bulk)裂解物(BUP)。配制的大量产物组成了200克BUP(含有大约2mg/ml的总蛋白)，向其中加入了13克蔗糖粉。把该材料分成3等分试样，处理如下等分试样IA用Constant Systems高压均化器于800巴压力处理(一个循环)。经过处理后，向12.5ml的均化材料中补充下列任何一个-1.25ml的水(IAl)-0.33ml 20％w/v Lutrol F127溶液(IA2)-1.25ml 1％w/v黄原胶/10％w/v麦芽糖糊精的溶液(IA3)-1.25ml 1％w/v黄原胶/10％w/v麦芽糖糊精的溶液和0.32ml 20％w/v Lutrol F127溶液(IA4)等分试样IB用Constant Systems高压均化器于2000巴压力处理(一个循环)。经过处理后，向12.5ml的均化材料中补充下列任何一个-1.25ml的水(IBl)-0.33ml 20％w/v Lutrol F127溶液(IB2)-1.25ml 1％w/v黄原胶/10％w/v麦芽糖糊精的溶液(IB3)-1.25ml 1％w/v黄原胶/10％w/v麦芽糖糊精的溶液和0.32ml 20％w/v Lutrol F127溶液(IB4)等分试样II再分成4个25ml的等分试样，先补充下列任何一个
-2.5ml的水(II1)-0.65ml 20％w/v Lutrol F127溶液(II2)-2.5ml 1％w/v黄原胶/10％w/v麦芽糖糊精的溶液(II3)-2.5ml 1％w/v黄原胶/10％w/v麦芽糖糊精的溶液和0.65ml20％w/v Lutrol F127溶液(II4)然后将这些配好的样品经过高压均化器，压力为800巴(II1A，II2A，II3A，II4A)或者2000巴(II1B，II2B，II3B，II4B)。把已处理过的配制的大量产物的等分试样装入15ml干净塑料试管中，2-8℃放置不动。对于本实施例以及后面的实施例，要在固定的时间间隔对絮凝或沉降进行目测，采用0-5级计分系统(0/0＝没有絮凝/沉降，5/5最大絮凝/沉降，5/0最大絮凝，没有沉降，等等)。
4℃进行2小时后估计结果并总结在表1表1
L＝Lutrol F127；M＝麦芽糖糊精；X＝黄原胶；1，几乎没有任何可见的絮片，均一无沉降；2，均化作用后可能很差的Lutrol-MX混合。
本实施例表明1％的麦芽糖糊精和0.1％黄原胶的组合抑制裂解物材料絮凝和沉降。但是，令人惊讶的是这一有益效果只有当添加剂在高压均化作用之后而不是之前加入的时候才能够观察到。而且，加入麦芽糖糊精和黄原胶不会对裂解物的生物活性带来负面干扰。
实施例3用黄原胶/麦芽糖糊精阻止浓缩裂解物悬液絮凝和沉降如实施例1中描述的那样完成未经处理的大量裂解物(BUP)的制备。
-配制的大量产物制备如下1)向105ml BUP中加入87.5ml柠檬酸盐缓冲液(120mM，pH6.8)溶液12)向128ml溶液1中加入15克蔗糖粉(溶液2)-制剂A(无抗絮凝剂)将64ml溶液2在800巴压力下用Constant Systems均化器处理，然后补充52ml水。
-制剂B(有抗絮凝剂)将64ml溶液2在800巴压力下用Constant Systems均化器处理，然后补充29ml水和23ml含有5％麦芽糖糊精和0.5％黄原胶的溶液。
3)制剂C(有抗絮凝剂，没有蔗糖)将64ml溶液1在800巴压力下用Constant Systems均化器处理，然后补充29ml水和23ml含有5％麦芽糖糊精和0.5％黄原胶的溶液。
经过处理后，样品在4℃保存24小时，用0-5级(0＝没有絮凝/沉降，5＝最大絮凝/沉降)对絮凝/沉降进行计分。样品也要冻干，通过电子束灭菌进行处理并估计定生物活性。结果示于表2表2
S蔗糖6.5％；C柠檬酸盐30mM，pH 6.8；M麦芽糖糊精1％；X黄原胶0.1％；H，均化作用后；L，冻干后；L+E，冻干和31 kGy电子束照射后。
这些数据表明在柠檬酸盐缓冲液存在下加入1％麦芽糖糊精/0.1％黄原胶可以抑制低浓度裂解物絮凝和沉降达24小时。但是，当使用更高浓缩的裂解物并省去柠檬酸盐缓冲液的时候，均化作用后1.5小时就已经出现明显的絮凝和沉降了。数据进一步证实了麦芽糖糊精和黄原胶对裂解物生物活性无负面影响且与电子束照射相容(尽管裂解物的内在生物活性被照射降低)。
实施例4用黄原胶或者黄原胶/麦芽糖糊精阻止含有不同浓度蛋白的裂解物悬液絮凝和沉降-如实施例1中描述的那样制备未经处理的大量裂解物(BUP)制备配制的大量产物1.制剂3XA和3XB-BUP(大约0.98mg/ml) 94克-300mM柠檬酸盐缓冲液pH6.820克-蔗糖粉13克-水33克通过高压均化器于2000巴处理-经过处理后，裂解物分成2个80克的等分试样，向其中加入20克含5％麦芽糖糊精/0.5％黄原胶的溶液(制剂3XA)或者20克含0.5％黄原胶的溶液(制剂3XB)。
2.制剂1XA和1XB-BUP(大约0.98mg/ml)30.3克-300mM柠檬酸盐缓冲液pH6.8 20克-蔗糖粉 13.2克-水 96.5克通过高压均化器于2000巴处理-经过处理后，裂解物分成2个80克的等分试样，向其中加入20克含5％麦芽糖糊精/0.5％黄原胶的溶液(制剂1XA)或者20克含0.5％黄原胶的溶液(制剂1XB)。
3.制剂0.3XA和0.3XB向25克制剂1XA中加入下列成分制备制剂0.3XA-蔗糖 3.25克
-300mM柠檬酸盐缓冲液pH6.8 5克-PBS缓冲液31.75克-5％麦芽糖糊精/0.5％黄原胶10克向25克制剂1XB中加入下列成分制备制剂0.3XB-蔗糖3.25克-300mM柠檬酸盐缓冲液pH6.85克-PBS缓冲液 31.75克-5％麦芽糖糊精/0.5％黄原胶 10克该材料保存在4℃，在不同的时间点估计絮凝/沉降。进一步估计该材料的生物活性。结果总结在表3表3
(*)由于此裂解物制剂的生物活性通常很低，生物测定结果可能不可靠；M麦芽糖糊精1％；X黄原胶0.1％；C柠檬酸盐缓冲液30mM，pH6.8；S蔗糖6.5％。
本实施例表明，在不同的蛋白终浓度，单纯黄原胶的抗沉降和絮凝的效率与麦芽糖糊精和黄原胶的组合相当。
实施例5用黄原胶或者黄原胶/麦芽糖糊精阻止裂解物悬液絮凝和沉降以及加入抗絮凝剂的时间选择效应-如实施例1中描述的那样制备未经处理的大量裂解物(BUP)制备配制的大量产物1.制剂A和B(无蔗糖)-BUP(大约2.74mg/ml)27.9克-300mM柠檬酸盐缓冲液pH6.8 20克
-水 112.1克通过高压均化器于2000巴进行均化作用处理。
将均化的材料分成每份80克的2个等分试样，向其中加20克含5％麦芽糖糊精/0.5％黄原胶的溶液(制剂A)或者20克含0.5％黄原胶的溶液(制剂B)。
2.制剂C-J(含有蔗糖)-BUP(大约2.74mg/ml)111.5克-300mM柠檬酸盐缓冲液pH6.8 80克-蔗糖粉 52.1克-水 398.1克将混合物分成每份80克的8个等分试样。
-2个等分试样补充20克含5％麦芽糖糊精/0.5％黄原胶的溶液(制剂I)或者20克含0.5％黄原胶的溶液(制剂J)随后经高压均化器于2000巴处理。
-6个等分试样先经高压均化器于2000处理，随后补充抗絮凝剂添加剂，可以选择在均化作用之后立即加入(制剂G、H)或者在均化作用以后5分钟(制剂E、F)或者30分钟加入(制剂C、D)。用到的添加剂可以是20克含5％麦芽糖糊精/0.5％黄原胶的溶液(制剂C、E、G)也可以是20克含0.5％黄原胶的溶液(制剂D、F、H)。
将处理过的样品保存在4℃并用0-5级估计絮凝/沉降。也检测样品的生物活性。结果总结在表4中表4
(*)由于此裂解物制剂的生物活性通常很低，生物测定结果可能不可靠；M麦芽糖糊精1％；X黄原胶0.1％；C柠檬酸盐缓冲液30mM，pH6.8；S蔗糖6.5％。
本实施例表明，黄原胶具有与麦芽糖糊精/黄原胶的组合相似的抑制裂解物悬液絮凝和沉降的功效。也证实了抗絮凝剂需在高压均化作用这一步之后加入才能有效这一惊人的发现。为了使随后的絮凝最小化，优选在均化作用之后尽可能快地加入抗絮凝剂。
实施例6使用黄原胶，麦芽糖糊精或者黄原胶/麦芽糖糊精阻止裂解物悬液絮凝或者沉降以及在均化作用前或均化作用后添加的效果-如实施例1中描述的那样制备未经处理的大量裂解物(BUP)通过添加终浓度6.5％的蔗糖(制剂1、2、3)或者浓度为5％的麦芽糖糊精(制剂4、5)制备配制的大量产物。随后在800巴压力下均化悬液并补充下面一种(百分数指终浓度)制剂1麦芽糖糊精1％，黄原胶0.1％制剂2麦芽糖糊精1％制剂3黄原胶0.1％制剂4无添加剂制剂5黄原胶0.1％经过处理后，将该材料保存在4℃，在不同的时间点估计絮凝/沉降。结果总结在表5表5
M麦芽糖糊精1％或5％；X黄原胶0.1％；S蔗糖6.5％。
本实施例表明，麦芽糖糊精和黄原胶的组合阻止絮凝比单独黄原胶更有效。单独使用麦芽糖糊精能对絮凝起到有限的抑制但无法长期抑制沉降。
实施例7在有或者没有蔗糖存在的情况下用黄原胶/麦芽糖糊精阻止不同浓度的裂解物悬液絮凝和沉降-如实施例1中描述的那样制备未经处理的大量裂解物(BUP)制备配制的大量产物1. 制剂A和B(蔗糖)-BUP(大约3.1mg/ml) 30ml-150mM柠檬酸盐缓冲液pH6.8 20ml-蔗糖粉 6.5克通过高压均化器于800巴进行均化作用处理。
将均化的材料分成每份25ml的2个等分试样，向其中加入25ml水(制剂A)或者15ml水以及10ml含5％麦芽糖糊精/0.5％黄原胶的溶液(制剂B)。
2.制剂C(无蔗糖)-BUP(大约3.1mg/ml) 15ml-150mM柠檬酸盐缓冲液pH6.8 10ml通过高压均化器于800巴进行均化作用处理。
向均化的材料中加入15ml水以及10ml含5％麦芽糖糊精/0.5％黄原胶的溶液(制剂B)。
3.制剂D(更高蛋白浓度，无柠檬酸盐缓冲液)-BUP(大约3.1mg/ml 45ml-蔗糖粉 3.7克通过高压均化器于800巴进行均化作用处理。
向均化的材料中加入12ml含5％麦芽糖糊精/0.5％黄原胶的溶液(制剂B)。
将样品保存在4℃并在不同的时间点估计絮凝和沉降，检测生物活性。结果总结在表6中表6
M麦芽糖糊精1％；X黄原胶0.1％；C柠檬酸盐缓冲液30mM，pH6.8；S蔗糖6.5％。
本实施例表明，1％麦芽糖糊精/0.1％黄原胶的组合显著抑制裂解物絮凝和沉降至少达均化作用后23小时。有蔗糖存在会稍微改善麦芽糖糊精/黄原胶的效果。经过更长时间的温育(96小时)后，甚至在麦芽糖糊精/黄原胶存在的情况下也会发生沉降和絮凝，尤其当蛋白浓度更高时。麦芽糖糊精和黄原胶的存在不影响裂解物的生物活性。
权利要求
1.包含不能生活的细胞裂解物和至少一种抗絮凝剂和/或抗沉降剂的药用组合物。
2.权利要求1中的药用组合物，其中抗絮凝剂和/或抗沉降剂为黄原胶。
3.权利要求1和2中的药用组合物，其中抗絮凝剂和/或抗沉降剂为黄原胶和麦芽糖糊精的组合。
4.权利要求1到3中的药用组合物，进一步包含缓冲试剂。
5.干燥形式的权利要求1到4中的药用组合物。
6.冷冻干燥形式的权利要求1到4中的药用组合物。
7.权利要求1到6中的药用组合物，其中细胞裂解物为角质细胞裂解物。
8.权利要求1到7中的药用组合物，其中所述组合物进一步包含了制药上可接受的载体/赋形剂/媒介物。
9.用于促进伤口愈合的权利要求1到8中的药用组合物，其中所述组合物包含不能生活的细胞裂解物和制药上可接受的媒介物。
10.权利要求8和9中的药用组合物，其中所述的制药上可接受的媒介物是一种干粉、悬液或者溶液。
11.权利要求8和9中的药用组合物，其中所述的制药上可接受的媒介物是凝胶、乳膏、软膏或者生物相容基质。
12.生产均化的药用组合物的方法，包括培养、裂解以及干燥细胞的步骤，所述方法的特征在于，裂解后立即加入抗絮凝剂和/或抗沉降剂以稳定细胞裂解物混合物。
13.权利要求12中的方法，其中通过冷冻干燥来干燥细胞。
14.权利要求12和13中的方法，其中细胞裂解物为角质细胞裂解物。
15.权利要求12到14中的方法，其中抗絮凝剂和/或抗沉降剂为黄原胶。
16.权利要求12到15中的方法，其中抗絮凝剂和/或抗沉降剂为黄原胶和麦芽糖糊精的组合。
17.权利要求1到11中的组合物在治疗烧伤或者皮肤溃疡中的用途。
全文摘要
本发明涉及一种包含不能生活的细胞裂解物和至少一种抗絮凝剂和/或抗沉降剂的药用组合物。本发明中含有细胞裂解物的药用组合物以溶液或悬液或冷冻干燥物的形式存在，尤其是，均化的细胞裂解物组合物以溶液或悬液或冷冻干燥物的形式存在。本发明进一步公开了生产和使用该药用组合物的方法。
文档编号A61P17/00GK1720064SQ200380104974
公开日2006年1月11日 申请日期2003年11月25日 优先权日2002年12月3日
发明者C·韦尔韦特, J·-P·雷蒙, B·德莱, P·德韦勒 申请人:基因创新有限公司