用于基因快速检测的细胞裂解液的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种用于基因快速检测的细胞裂解液。
【背景技术】
[0002] 聚合酶链式反应（PolymeraseChainReation，PCR)是体外酶促合成特异DNA片段 的一种方法，为最常用的分子生物学技术之一。自1985年穆勒发明聚合酶链式反应（PCR) 以来，生物科学家的研究方式逐渐被改变。这项能在短时间内获得大量DNA片段的技术，在 法医学、DNA克隆、基因组分析、遗传病和传染病诊断中发挥着巨大作用。
[0003] PCR技术一经问世就被迅速而广泛地用于分子生物学的各个领域。它不仅可以用 基因的分离、克隆和核苷酸序列分析，还可以用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的 研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病的诊断，肿瘤机制的探索，法医鉴定等诸多方面。 例如：与许多疾病相关的单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP)决定 了人类疾病的易感性和药物反应的差异性，对群体遗传学、制药业、法医学、癌症及遗传性 疾病甚至进化的研究都将产生不可估量的影响。通过研究SNP图谱，可以更深刻地认识癌 症、糖尿病、血管性疾病和某些精神性疾病等发病率高的多基因疾病的发生机制。
[0004] PCR反应体系中包括DNA聚合酶、dNTPs、PCR缓冲液、Mg2+、引物等，在反应时加入 相应的模板DNA即可。目前，进行PCR反应都最常用的样本是血液，血痕，带毛囊的毛发，口 腔粘膜细胞等，其它如精斑，混合斑，肌肉，牙齿，骨骼，甚至胎儿的羊水等，但是样本不能直 接用于PCR反应，需要加入从样本中提取纯化的DNA作为模板。如果采用血液样本，从采血 到提取纯化DNA完成，至少需要4个小时、效率较低。现有的细胞裂解方法包括化学裂解、 酶裂解和机械裂解，化学裂解和酶裂解通常是比较温和的方法，通常会很少使DNA断裂，是 提取纯化DNA中常用的方法。目前还没一种细胞裂解方法直接应用于PCR。因此，直接将细 胞作为模板加入PCR反应混合液中进行反应，则在PCR过程中细胞裂解不彻底，并且细胞裂 解之后的细胞碎片以及一些蛋白酶会对PCR反应造成阻碍，导致基因扩增效率低或实验失 败。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是提供一种反应快速、效率高的用于基因快速扩增或检 测的细胞裂解液。
[0006] 为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：用于基因快速检测的细胞裂 解液，所述的细胞裂解液的原料由十二烷基硫酸钠、聚乙二醇辛基苯基醚组成。
[0007] 采用本发明技术方案的用于基因快速检测的细胞裂解液，细胞裂解液的作用是 溶解细胞质和细胞膜，破坏分子间许多微弱的化学键，分解一些蛋白酶，降低细胞裂解之后 产生的杂质对PCR反应的影响。所述的细胞裂解液的原料由十二烷基硫酸钠、聚乙二醇辛 基苯基醚组成。聚乙二醇辛基苯基醚是一种非离子型表面活性剂，十二烷基硫酸钠是一种 能够使蛋白质变性的强阴离子去污剂。在细胞和分子生物学领域，十二烷基硫酸钠，简称 SDS，经常被用于核酸抽提操作中破坏细胞壁及裂解核酸与蛋白复合物，在较高温度下，破 坏蛋白质与DNA的结合，使DNA释放出来。聚乙二醇辛基苯基醚简称Triton X-100,被用 于分解蛋白酶，聚乙二醇辛基苯基醚在基因工程中还用作限制性内切酶的缓冲液的成分之 一。为了解决细胞裂解在基因检测过程中裂解不彻底，细胞碎片以及一些蛋白酶会对PCR 反应造成阻碍，造成实验失败的问题，发明人在通过多次试验，把细胞裂解液的成分以一定 的比例混合加在PCR反应混合液中，实现了直接以口腔细胞为模板进行PCR反应，从而可 在PCR反应的过程中省略提纯DNA的步骤，且避免污染样品，从而节约时间，通过SDS和 Triton X-100混合组成，可以实现裂解细胞以及降低细胞破裂之后细胞碎片对PCR的影 响，简化实验步骤，检测过程仅需要约lh。
[0008] 进一步，所述的细胞裂解液的原料终浓度为： 十二烷基硫酸钠〇. 005-0. 015%w/v 聚乙二醇辛基苯基醚 0.001-0. 03%w/v。
[0009] 进一步，所述的细胞裂解液的原料终浓度为： 十二烷基硫酸钠〇. 〇〇5%w/v 聚乙二醇辛基苯基醚0. 01%w/v。
[0010] 进一步，所述的细胞裂解液的原料终浓度为： 十二烷基硫酸钠0. 〇〇9%w/v 聚乙二醇辛基苯基醚0. 02%w/v。
[0011] 进一步，所述的细胞裂解液的原料终浓度为： 十二烷基硫酸钠0. 〇〇5%w/v 聚乙二醇辛基苯基醚0. 001%w/v。
[0012] 进一步，所述的细胞裂解液的原料终浓度为： 十二烷基硫酸钠0. 〇15%w/v 聚乙二醇辛基苯基醚0. 003%w/v。
【附图说明】
[0013] 下面结合附图和实施例对本发明技术方案进一步说明： 图1是本发明实施例二的荧光检测结果； 图2是本发明实施例二的检测结果一； 图3是本发明实施例二的检测结果二； 图4是本发明实施例二的检测结果三； 图5是本发明实施例一的检测结果一； 图6是本发明实施例一的检测结果二； 图7是本发明实施例一的检测结果三； 图8是本发明实施例四的检测结果一； 图9是本发明实施例四的检测结果二； 图10是本发明实施例四的检测结果三； 图11是本发明实施例七的检测结果一； 图12是本发明实施例七的检测结果二； 图13是本发明实施例七的检测结果三； 图14是本发明实施例八的检测结果； 图15是本发明实施例九的检测结果。
【具体实施方式】
[0014] 本发明用于基因快速检测的细胞裂解液可应用于基因扩增和基因快速检测。比如 CYP2C19*2基因型快速检测、ABCB1基因型快速检测、牛线粒体基因的PCR扩增、玉米甘油 醛-3-磷酸脱氢酶基因的PCR扩增中 ： 一、用CYP2C19*2基因型快速检测和ABCB1基因型快速检测分别说明本发明。
[0015] 按照23ul的反应体系配制50支试剂，以下所指的终浓度是指各组分在23ul体系 中的浓度，ul/支是指各个组分在试剂管中的含量。
[0016] 以下实验操作均在生物安全柜中进行，保证无污染。
[0017] 实施例一至实施例六为CYP2C19*2基因型的检测。
[0018] CYP2C19是CYP450酶第二亚家族中的重要成员，在肝脏中大量表达，参与多种药 物的代谢。由于CYP2C19基因具有单核苷酸多态性，因此CYP2C19酶活性存在显著的个体 差异和种族差异。其最常见的两种突变是CYP2C19*2和CYP2C19*3,它们都属与非同义突 变，所以能直接影响该酶对药物的代谢能力。CYP2C19*2 (681G>A，rs244285)变异，导致翻 译过程中产生一个异常的剪接位点从而产生一个截短的无功能的蛋白质。在药物代谢过程 中，该突变会使一些药物的血药浓度升高，如抗凝血药物氯吡格雷、抗抗癫痫药物苯妥英钠 等，使患者出现不良的药物反应。
[0019] CYP2C19*2突变基因型有纯合子A/A和杂合子G/A两种，其野生型基因型为G/G。 纯合子A/A患者对药物的代谢类型属于慢代谢型，杂合子G/A患者对药物的代谢类型属于 中等代谢型，而野生型G/G患者对药物的代谢属于正常代谢型。通过确定患者的基因型，就 可以判定患者的药物代谢类型，从而帮助医生正确选择合适的药物并合理调整药物剂量， 提高药物使用有效性，降低毒副作用。
[0020](一)、细胞裂解液的配制：配置1000U1的细胞裂解液试剂，试剂原料及其终浓度如 表1所示，十二烷基硫酸钠（SDS)和聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100)购自上海普洛麦 格生物制品有限公司，初始浓度分别为0. lg/ml、l. 0655g/ml。
[0021] 表 1
【主权项】
1. 用于基因快速检测的细胞裂解液，其特征在于：所述的细胞裂解液的原料由十二烷 基硫酸钠、聚乙二醇辛基苯基醚组成。
2. 如权利要求1所述用于基因快速检测的细胞裂解液，其特征在于：所述的细胞裂解 液的原料终浓度为： 十二烷基硫酸钠〇. 005-0. 015%w/v 聚乙二醇辛基苯基醚 0.001-0. 03%w/v。
3. 如权利要求2所述用于基因快速检测的细胞裂解液，其特征在于：所述的细胞裂解 液的原料终浓度为： 十二烷基硫酸钠〇. 〇〇5%w/v 聚乙二醇辛基苯基醚0. 01%w/v。
4. 如权利要求2所述用于基因快速检测的细胞裂解液，其特征在于：所述的细胞裂解 液的原料终浓度为： 十二烷基硫酸钠〇. 〇〇9%w/v 聚乙二醇辛基苯基醚0. 02%w/v。
5. 如权利要求2所述用于基因快速检测的细胞裂解液，其特征在于：所述的细胞裂解 液的原料终浓度为： 十二烷基硫酸钠〇. 〇〇5%w/v 聚乙二醇辛基苯基醚0. 001%w/v。
6. 如权利要求2所述用于基因快速检测的细胞裂解液，其特征在于：所述的细胞裂解 液的原料终浓度为： 十二烷基硫酸钠〇. 〇15%w/v 聚乙二醇辛基苯基醚0. 003%w/v。
【专利摘要】本发明公开了一种用于基因快速检测的细胞裂解液，包括PCR反应混合液，PCR反应混合液原料包括DNA聚合酶、dNTPs、上游引物、下游引物、突变型分子信标、野生型分子信标、MgCl2、PCR缓冲液和细胞裂解液。本发明提供一种与PCR反应混合液配合可以实现以细胞为模板进行基因扩增或检测的细胞裂解液及其应用方法。
【IPC分类】C12Q1-68
【公开号】CN104673914
【申请号】CN201510078877
【发明人】任晓东, 罗志超
【申请人】重庆京因生物科技有限责任公司
【公开日】2015年6月3日
【申请日】2015年2月13日