专利名称：红细胞深低温保存预处理液、冷冻保护液及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及细胞冷冻保存技术，具体涉及一种红细胞深低温保存的方法，以及该方法中用到的红细胞预处理液和红细胞冷冻保护液。
背景技术：
输血治疗是临床挽救伤员生命的重要治疗手段。足量的血液供应是降低伤病员伤亡率的重要保障。临床上长期保存红细胞的方法是-80℃或-196℃深低温保存，FDA认为红细胞的深低温保存期可长达10年以上。目前的深低温保存主要采用高浓度的甘油作为保护剂，但解冻后需要复杂的洗涤程序以去除甘油，这需要耗费大量的时间和人力。目前临床常规的洗脱甘油时间为3小时左右，这可能会延误伤病员的最佳救治时间，甚至危及其生命，另外，甘油等渗透性保护剂对人体也具有一定的毒性作用。
从上世纪50年代开始，在采用甘油进行深低温保存红细胞研究的同时，人们也发现这种方法存在一定的弊端，因此一些研究者开始尝试采用毒副作用较低的非渗透性保护剂，主要是外源性大分子物质，如羟乙基淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和右旋糖苷来保存人红细胞，并取得一些结果。但是尽管大分子物质能提高保护液的玻璃态转变温度，但由于其无法进入细胞内，因此对细胞内膜，包括膜骨架系统不能起到保护作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的、不需要甘油作为保护剂、对细胞内膜具有保护作用的红细胞深低温保存方法。
该红细胞深低温保存方法，包括以下步骤1)将新鲜红细胞离心洗涤去除白细胞和血小板；2)取洗涤后的浓集红细胞与预处理液混合在水浴中孵育；所述红细胞预处理液，含有0.2M-1M小分子糖，154mM氯化钠，1.06mM磷酸二氢钾，和5.6mM磷酸氢二钠，所述小分子糖为选自海藻糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖和甘露醇中的一种或几种。
3)在孵育后的细胞中加入冷冻保护液，或在孵育后的细胞悬液中加入冷冻保护成分，混匀，在-80℃或-196℃下保存；其中所述冷冻保护成分为选自羟乙基淀粉、右旋糖苷、聚蔗糖和聚乙烯吡咯烷酮中的一种或多种的大分子物质，所述冷冻保护液为含有所述冷冻保护成分的基础缓冲液。
上述红细胞低温保存方法中，所述冷冻保护成分还包括选自海藻糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖和甘露醇中的一种或多种的小分子糖；所述冷冻保护成分还包括人血白蛋白。
上述细胞低温保存方法中，所述步骤2)孵育温度为4℃-40℃，孵育时间为1h-4h。
本发明另一目的在于提供上述红细胞深低温保存方法中所用的红细胞预处理液。
该红细胞预处理液，含有0.2M-1M小分子糖，154mM氯化钠，1.06mM磷酸二氢钾，和5.6mM磷酸氢二钠，所述小分子糖为选自海藻糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖和甘露醇中的一种或几种。所述细胞预处理液中，还含有2.0mM腺嘌呤。
本发明再一目的在于提供上述红细胞深低温保存方法中所用的红细胞冷冻保护液。
该红细胞冷冻保护液，含有6wt％-40wt％的大分子物质，0～500mM小分子糖，154mM氯化钠，1.06mM磷酸二氢钾，5.6mM磷酸氢二钠，其中所述大分子物质为羟乙基淀粉、右旋糖苷、聚蔗糖和聚乙烯吡咯烷酮中的一种或多种，所述小分子糖为海藻糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖和甘露醇中的一种或多种。
上述红细胞冷冻保护液中，还含有2wt％-5wt％的人血白蛋白。还含有2.0mM腺嘌呤。
采用以上方案，本发明将小分子碳水化合物导入红细胞内，从而实现了非渗透性保护剂对红细胞膜的保护作用，而后与外源性大分子物质和蛋白保护成分相结合实现对红细胞的深低温保存。
本发明避免了红细胞深低温保存过程中对人体有毒副作用的渗透性保护剂(如甘油)的使用，从而大大简化了解冻后红细胞的洗涤程序，甚至可以完全避免洗涤。本发明对于及时挽救临床危重或需要紧急输血的病人具有重要意义。
图1为深低温保存红细胞解冻后溶血率比较图；图2为透射电镜观察冷冻后红细胞形态的比较图片。
具体实施例方式发明人研究中发现，不使用甘油作为保护剂，现有保护液只能保护红细胞外膜，不能对细胞内膜起到保护作用，这样引起膜脂双层结构以及膜骨架等超微结构在冷冻过程受到损伤，从而导致溶血率增加。
基于此，为达到同时保护红细胞内膜的目的，本发明提出的红细胞深低温保存的方法，首先对需保存的红细胞进行预处理。该预处理过程是将红细胞在预处理液中进行孵育，使红细胞预处理液中的小分子碳水化合物先导入红细胞内，在细胞冷冻过程中发挥对红细胞内膜的保护作用。
本发明提供的红细胞预处理液，是在基础缓冲液基础上加入小分子糖组成。
基础缓冲液组方该基础缓冲液中含有154mM氯化钠，1.06mM磷酸二氢钾，5.6mM磷酸氢二钠。也可以含有2.0mM腺嘌呤。该基础缓冲液主要用于调整缓冲液的PH值和渗透压，作为配制预处理液和冷冻保护液的基础液，加入腺嘌呤可以作为ATP合成的底物，从而维持红细胞ATP水平。
在上述基础缓冲液中，加入小分子糖形成红细胞预处理液，该红细胞预处理液组方含有0.2M-1M小分子糖，154mM氯化钠，1.06mM磷酸二氢钾，5.6mM磷酸氢二钠。也可以含有2.0mM腺嘌呤；所述小分子糖为选自海藻糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖和甘露醇中的一种或几种。
本发明所述的预处理，温度为4℃-40℃，孵育时间为1h-24h。
在上述预处理的基础上，本发明提出的红细胞深低温保存的方法，还进一步包括将预处理后的红细胞与冷冻保护液混合后进行深低温保存的过程。
该冷冻保护液，是在上述基础缓冲液的基础上加入冷冻保护成分，该冷冻保护成分有对红细胞外膜具有保护作用的大分子物质，具有提高保护液玻璃化程度、防止膜脂质氧化和膜相变与稳定膜蛋白等功能的人血蛋白，还可以包括对红细胞内膜具有保护作用的小分子糖，三种保护功能的保护成分可以选择性加入或全部加入。该冷冻保护液的组方在冷冻保护液中含有6wt％-40wt％的大分子物质，如羟乙基淀粉、右旋糖苷、聚蔗糖或聚乙烯吡咯烷酮中的一种或多种，0～1000mM小分子糖，如海藻糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖或甘露醇等，2wt％-5wt％人血白蛋白，154mM氯化钠，1.06mM磷酸二氢钾，5.6mM磷酸氢二钠，2.0mM腺嘌呤。其中大分子物质、小分子糖和人血白蛋白为冷冻保护成分。
本发明的细胞深低温保存的方法，具体采用如下步骤1)将新鲜红细胞离心洗涤去除白细胞和血小板；2)取洗涤后的浓集红细胞与预处理液混合在水浴中孵育；3)在孵育后的细胞悬液中加入冷冻保护成分，或者将孵育后的细胞悬液离心去除上清液后加入冷冻保护液，混匀，在-80℃或-196℃下保存。
冷冻保存后细胞，使用时在40℃水浴中快速解冻即可使用。具体操作如下实施例取健康自愿者静脉血50毫升，加肝素抗凝，离心洗涤去除白细胞和血小板。将洗涤后的浓集红细胞与基础缓冲液和小分子糖组成的预处理液150毫升混合，在4-40℃水浴中孵育1-4h后，离心去上清，然后转入含10wt％-40wt％大分子保护成分的冷冻保护液75毫升后，于-80℃或-196℃保存1周(或者向预处理后的红细胞悬液中直接加入大分子保护成分，冷冻保存)。解冻细胞时，将样品取出，40℃水浴中快速解冻，测定红细胞的溶血率等指标。
其中预处理以及冷冻保护过程参见表1。
表1
注*标注的实施例是在预处理后的细胞悬液中直接加入冷冻保护成分；没有标注的实施例是将预处理后的细胞悬液经离心分离后取得红细胞，再投入冷冻保护液中。
将经以上实验冷冻保存的细胞解冻后，不必经过洗涤程序，直接测定红细胞的各项指标，测定结果参见表2。
表2
通过表2实验数据说明，采用本发明方法对血细胞进行冷冻保存，细胞回收率可以达到80％以上，溶血率约为20％，红细胞变形指数在0.3左右，符合保存血标准。
部分实验红细胞在深低温保存解冻后溶血率的影响参见图1。图中，对照组为表1中的参照组，不含糖组为表1中的比较例，海藻糖组为表1中实施例1，葡萄糖组为表1中实施例7。从图1可以看出，经过海藻糖和葡萄糖预处理后冷冻的红细胞解冻后的溶血率显著低于参照组和比较例。
图2显示了透射电镜观察糖类对红细胞冷冻保护的效果。其中，正常红细胞为新鲜分离未经任何处理的红细胞，无糖冷冻组为表1比较例解冻后红细胞，海藻糖冷冻组为表1中实施例1解冻后红细胞，葡萄糖冷冻组为表1中实施例7解冻后红细胞。由图2可以看出，正常红细胞的形态呈圆盘状；经过葡萄糖或海藻糖吸收(预处理)后再冷冻保存的红细胞的形态与新鲜红细胞相似，尤其是用海藻糖预处理组，其红细胞形态与新鲜红细胞形态最为接近；而不经过糖吸收处理的冷冻保存的红细胞(比较例)的细胞膜破损严重(如箭头所指细胞)，不同程度地发生血红蛋白的泄漏。
从以上实验可以确知，经过本发明方法，血细胞经过预处理后，对红细胞内膜形成了保护，较未进行预处理的(参见比较例)，小分子糖类对细胞内膜具有明显保护作用，可以有效降低解冻后的红细胞溶血率，而且可以对红细胞的变形性提供一定的保护作用；另一方面，由于本发明在冷冻保存中没有使用甘油，避免了甘油对人体的毒副作用，并且细胞解冻后不需要经过复杂的洗涤程序，简化了操作，为输血患者争取了宝贵的救治时间。
权利要求
1.一种红细胞预处理液，含有0.2M-1M小分子糖，154mM氯化钠，1.06mM磷酸二氢钾，和5.6mM磷酸氢二钠，所述小分子糖为选自海藻糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖和甘露醇中的一种或几种。
2.根据权利要求1所述红细胞预处理液，其特征在于，还含有2.0mM腺嘌呤。
3.一种红细胞冷冻保护液，含有6wt％-40wt％的大分子物质，0～500mM小分子糖，154mM氯化钠，1.06mM磷酸二氢钾，5.6mM磷酸氢二钠，其中所述大分子物质为羟乙基淀粉、右旋糖苷、聚蔗糖和聚乙烯吡咯烷酮中的一种或多种，所述小分子糖为海藻糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖和甘露醇中的一种或多种。
4.根据权利要求3所述红细胞冷冻保护液，其特征在于，还含有2wt％-5wt％的人血白蛋白。
5.根据权利要求3或4所述红细胞冷冻保护液，其特征在于，还含有2.0mM腺嘌呤。
6.一种用权利要求1或2所述预处理液进行红细胞深低温保存方法，包括以下步骤1)将新鲜红细胞离心洗涤去除白红细胞和血小板；2)取洗涤后的浓集红细胞与所述预处理液混合在水浴中孵育；3)在孵育后的红细胞中加入冷冻保护液，或在孵育后的红细胞悬液中加入冷冻保护成分，混匀，在-80℃或-196℃下保存；其中所述冷冻保护成分为选自羟乙基淀粉、右旋糖苷、聚蔗糖和聚乙烯吡咯烷酮中的一种或多种的大分子物质，所述冷冻保护液为含有所述冷冻保护成分的基础缓冲液。
7.根据权利要求6所述红细胞低温保存方法，其特征在于，所述冷冻保护成分还包括选自海藻糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖和甘露醇中的一种或多种的小分子糖。
8.根据权利要求6或7所述红细胞低温保存方法，其特征在于，所述冷冻保护成分还包括人血白蛋白。
9.根据权利要求6或7所述红细胞低温保存方法，其特征在于，所述步骤2)孵育温度为4℃-40℃，孵育时间为1h-4h。
10.根据权利要求8所述红细胞深低温保存方法，其特征在于，所述步骤2)孵育温度为4℃-40℃，孵育时间为1h-4h。
全文摘要
本发明公开了一种红细胞深低温保存的方法，以及该方法中用到的红细胞预处理液和红细胞冷冻保护液。该方法是将红细胞在预处理液中孵育后，再用冷冻保护液保护后冷冻，其中，预处理液是在基础缓冲液基础上添加小分子糖组分，而冷冻保护液是在原大分子保护液基础上添加小分子糖与白蛋白组分。本发明不使用甘油，而是借助小分子糖对红细胞内膜实施保护，协同大分子物质与白蛋白等有效组分，对红细胞内膜和外膜均形成保护，免除甘油保护后的细胞洗涤过程，并有效提高细胞回收率以及降低解冻后的红细胞溶血率。
文档编号A61K47/26GK1857312SQ200610066310
公开日2006年11月8日 申请日期2006年3月28日 优先权日2006年3月28日
发明者权国波, 韩颖, 刘敏霞, 郭永, 张亮, 王艳, 王捷熙, 刘安 申请人:中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所