一种细胞保存液及其制备方法、应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及临床医学技术领域，特别涉及一种细胞保存液及其制备方法、应用。
【背景技术】
[0002] 近年来，细胞治疗逐渐代替传统药物治疗，在各大疾病领域上发挥重要的作用。细 胞治疗是指利用某些具有特定功能的细胞的特性，采用生物工程方法获取和/或通过体外 扩增、特殊培养等处理后，使这些细胞具有增强免疫、杀死病原体和肿瘤细胞、促进组织器 官再生和机体康复等治疗功效，从而达到治疗疾病的目的。其中，间充质干细胞和免疫细胞 成为了疾病治疗的种子细胞。
[0003] 间充质干细胞（MSCs)是一群中胚层来源的具有自我更新和多向分化潜能的多能 干细胞，广泛分布于各种不同的组织中，如骨髓、外周血、脐血、脂肪、胎肺、胎肾等组织。动 物实验和临床研宄表明，MSCs不表达MHC-II类分子和FasL，不表达共刺激分子B7-l、B7-2， 低水平表达MHC-I类分子、⑶40,将MSCs与异基因单个核细胞或同种异体T淋巴细胞共培 养后不能引起同种异体T淋巴细胞显著增殖，说明MSCs具有低免疫原性和较低的抗原提呈 能力，为他们临床应用的安全性和有效性提供了可靠的理论依据，可成为理想的细胞治疗 材料，即使在HLA不匹配的个体间进行移植也不需要对宿主采用免疫抑制，这一新的细胞 种类的发现为许多疾病的细胞替代治疗和治愈带来了光明的前景。
[0004] 免疫细胞是指参与免疫应答或与免疫应答相关的细胞，包括淋巴细胞、树突 状细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞等。CIK细胞，即细胞因子诱导的杀伤细胞 (Cytokine-InducedKiller，CIK)是一种新型的免疫活性细胞，CIK增殖能力强，细胞毒作 用强，具有一定的免疫特性。由于该细胞同时表达CD3和CD56两种膜蛋白分子，故又称为 NK细胞（自然杀伤细胞）样T淋巴细胞，兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性，和NK细胞的 非MHC限制性杀瘤优点。该细胞对肿瘤细胞的识别能力很强，如同"细胞导弹"，能精确"点 射"肿瘤细胞，但不会伤及"无辜"的正常细胞。尤其对手术后或放化疗后患者效果显著，能 消除残留微小的转移病灶，防止癌细胞扩散和复发，提高机体免疫力，因此，CIK细胞被认为 是新一代的肿瘤过继细胞免疫治疗的首选方案。
[0005] 然而，种子细胞的生物活性直接影响了其治疗效果。因此，如何维持种子细胞的高 活力成为了治疗关键。在此之前，人们用生理盐水或葡萄糖溶液作为种子细胞的保存液，但 是由于缺乏营养、溶液等张力或等渗力存在差异等原因，导致种子细胞在长期保存或运输 中出现活力低下、大量溶胀死亡等现象。随后，人们进一步改善保存液的组成体系，添加了 如NaCl、KC1、柠檬酸钠、MgCl2、自体血小板等成分，如专利申请号为201210421365. 2的一种 细胞保存液，其制备方法是：称取NaCl、KCl、柠檬酸钠、葡萄糖、甘露醇、CaCl2、白蛋白、氨基 酸、维生素等，把上述物品溶于水中，形成保存液；如专利授权号为CN102948413B的一种 肝干细胞保存液，其制备方法是：取人血白蛋白、NaCl、葡萄糖酸钠、KC1、醋酸钠、MgCl2、氨 基酸、肝素钙等，把上述物品溶于水中，形成保存液；又如专利授权号为CN102349500B的 一种间充质干细胞自体保存液，其制备方法是：自体血液3000rpm离心8min，取上层血衆， 加入CaCl2溶液，颠倒后现成自体血小板裂解物，把自体溶液介质：血小板裂解物：维生素C注射液=95:4:1的比例混匀，形成保存液。
[0006] 虽然上述保存液在较长时间内很好的维持了种子细胞的活性。但保存液的成分复 杂，配制过程繁琐，且只适合保存间充质干细胞，并不能用于维持免疫细胞的活力，同时对 于间充质干细胞的保存效率也并未达到令人满意的效果。为了进一步的适应临床应用需 要，开发一种能在长时间的保存和运输中，其既能维持间充质干细胞的活力，又能保持免疫 细胞的生物活性的新保存液成为了当务之急。
【发明内容】
[0007] 有鉴于此，本发明提供了一种细胞保存液及其制备方法、应用。该细胞保存液对脐 带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞及免疫细胞等两种以上的种子细胞的活力和形态起到 优良维持作用，可长时间保存，维持其生物特性，从而显著提高种子细胞的治疗效果。
[0008] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0009] 本发明提供了一种细胞保存液，包括白蛋白、葡萄糖、维生素C和保存基础液；保 存基础液为复方电解质注射液和复方氨基酸注射液的混合物。
[0010] 本发明通过研宄发现：将白蛋白、葡萄糖、维生素C、复方电解质注射液和复方氨 基酸注射液混合，从而形成了成分稳定、营养物质多元、溶液渗透体系缓冲力强的细胞保存 液，该细胞保存液不仅可为种子细胞提供充足的营养物质，还能很好的维持种子细胞的活 力及其原有细胞形态及生物特性。该保存液用于维持种子细胞活力的关键是提供种子细胞 合适的生存环境及营养供给，保证移植的种子细胞在保存液中长时间的存活。因此，细胞保 存液中的成分成为提高种子细胞活力至关重要的因素。
[0011] 在本发明中，间充质干细胞和免疫细胞在本发明提供的细胞保存液中保存48h 后，其活力仍然能够保持在90%以上，形态也没有出现变化。可见，本发明的细胞保存液对 两种以上的种子细胞的活力和形态起到优良维持作用，维持其生物特性，从而显著提高种 子细胞的治疗效果。
[0012] 作为优选，在细胞保存液中，白蛋白的体积百分浓度为1 %?5 %，葡萄糖的体积 百分浓度为3 %?8 %，维生素C的体积百分浓度为0. 1 %?0. 5 %。
[0013] 优选地，在细胞保存液中，白蛋白的体积百分浓度为1%，葡萄糖的体积百分浓度 为5 %，维生素C的体积百分浓度为0. 5 %。
[0014] 作为优选，复方电解质注射液与复方氨基酸注射液的体积比为（I: 1)?（1:2)。
[0015] 优选地，复方电解质注射液与复方氨基酸注射液的体积比为1: 1。
[0016] 在本发明提供的一些实施例中，复方氨基酸注射液包括L-脯氨酸、L-丝氨酸、 L-丙氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-门冬氨酸、L-酪氨酸、L-谷氨酸、L-苯丙氨酸、L-精 氨酸、L-赖氨酸、L-缬氨酸、L-苏氨酸、L-组氨酸、L-色氨酸、L-蛋氨酸、L-胱氨酸和甘氨 酸。
[0017] 在本发明提供的一些实施例中，复方氨基酸注射液是由18种氨基酸与山梨醇配 制而成的灭菌水溶液，复方氨基酸注射液的组分为：每500mL含：L-脯氨酸（C5H9NO2)O. 50g; L-丝氨酸（C3H7NO3)O. 50g;L-丙氨酸（C3H7NO2)I.OOg;L-异亮氨酸（C6H13NO2)I. 76g;L-亮 氨酸（C6H13NO2) 2. 45g;L-门冬氨酸（C4H7NO4)I. 25g;L-酪氨酸（C9H11NO3)O. 13g;L-谷氨酸 (C5H9NO4)O. 38g;L-苯丙氨酸（C9H11NO2) 2. 67g;L-精氨酸盐酸盐（C6H14N4O2 4(:1)2. 50g;L-赖 氨酸盐酸盐（C6H14N2O2 ?HC1) 2. 15g;L-缬氨酸（C5H11NO2)L80g;L-苏氨酸（C4H9NO3)L25g; L-组氨酸盐酸盐（C6H9N3O2 ?HCl?H2O)I. 25g;L-色氨酸（C11H12N2O2)O. 45g;L-蛋氨 酸（C15H11NO2S)I. 13g;L-胱氨酸（C6H12N2O4S2)O. 05g;甘氨酸（C2H5NO2) 3. 80g;山梨醇 (C6H14O6) 25.OOg;亚硫酸氢钠（NaHSO3) 0.25g。辅料为注射用水。
[0018] 在本发明提供的一些实施例中，复方电解质注射液包括氯化钠、葡萄糖酸钠、醋酸 钠、氯化钾和氯化镁。
[0019] 在本发明提供的一些实施例中，复方电解质注射液的组分为：每IOOOmL含氯化钠 5. 26g、葡萄糖酸钠5. 02g、醋酸钠3. 68g、氯化钾0. 37g、氯化镁0. 30g。
[0020] 本发明还提供了本发明的细胞保存液的制备方法，包括如下步骤：
[0021] 取复方电解质注射液和复方氨基酸注射液混合，获得保存基础液；
[0022] 将白蛋白、葡萄糖、维生素C与保存基础液混合，获得细胞保存液。
[0023] 作为优选，在细胞保存液制备方法中，白蛋白的体积百分浓度为1 %?5%，葡萄 糖的体积百分浓度为3%?8%，维生素C的体积百分浓度为0. 1 %?0. 5%。
[0024] 优选地，在细胞保存液制备方法中，白蛋白的体积百分浓度为1%，葡萄糖的体积 百分浓度为5 %，维生素C的体积百分浓度为0. 5 %。
[0025] 作为优选，在细胞保存液制备方法中，复方电解质注射液与复方氨基酸注射液的 体积比为（I: 1)?（1:2)。
[0026] 优选地，在细胞保存液制备方法中，复方电解质注射液与复方氨基酸注射液的体 积比为1:1。
[0027] 在本发明提供的一些实施例中，复方氨基酸注射液包括L-脯氨酸、L-丝氨酸、 L-丙氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-门冬氨酸、L-酪氨酸、L-谷氨酸、L-苯丙氨酸、L-精 氨酸、L-赖氨酸、L-缬氨酸、L-苏氨酸、L-组氨酸、L-色氨酸、L-蛋氨酸、L-胱氨酸和甘氨 酸。
[0028] 在本发明提供的一些实施例中，复方氨基酸注射液是由18种氨基酸与山梨醇配 制而成的灭菌水溶液，复方氨基酸注射液的组分为：每500mL含：L-脯氨酸（C5H9NO2)O. 50g; L-丝氨酸（C3H7NO3)O. 50g;L-丙氨酸（C3H