一种大额牛细管冷冻精液制作方法及应用
【专利说明】
[0001]技术领域:
本发明涉及牛的细管冷冻精液制作。
[0002]【背景技术】:
细管冷冻精液是指将经过处理后的精液盛装于塑料细管内，经过超低温快速冷冻后浸泡在液氮中长期保存，并可随时取用的冷冻精液。
[0003]釆精前种公牛的准备:种公牛外貌特征应符合品种的国家标准，乳用种公牛一般16月龄开始试采精，肉用种公牛一般18月龄开始试采精。在种公牛配种频繁的情况下，应增加动物性饲料，因为蛋白质有利于精液和精子的形成.按照饲养管理规程，种公牛还要做好补饲、放牧、运动、驱虫、防疫、修蹄及采精训练等日常工作。
[0004]
【发明内容】
:
大额牛是一种仍处于半野生半家养的畜类，为国家二级保护野生动物，在我国仅产于云南省贡山独龙族怒族自治县独龙江一带。大额牛细管冷冻精液(以下简称冻精)是指将采集到的大额牛新鲜精液，经过处理后，把精液封装在微型(0.25ml)塑料细管内，利用液氮为冷源，按特定的程序和冷冻速度进行冷冻，使精液以冻结的形式保存于超低温环境下，达到长期保存大额牛精液的目的。大额牛细管冻精的制作有利于其遗传物质的长期保存，防止大额牛种群种质衰退和基因丢失。
[0005]【具体实施方式】:
大额牛细管冻精的制作方法为:
1.大额牛公牛的选择:用于制作细管冻精的公牛要选择体型大，大额牛特征明显的公牛进行人工驯化和调教。
[0006]2.采精调教:应用性引诱方法进行采精调教，通过性引诱对大额牛公牛反复进行性刺激，使公牛产生性反射，表现性行为，进行假阴道采精训练，待公牛性兴奋强烈并爬跨台畜(或同伴)时，及时接近公牛，抚摩公牛臀部、外阴部及包皮，当公牛性兴奋充分时用预备好的假阴道采精。
[0007]3.采精方法:假阴道法，用假阴道采精时，假阴道内胎温度为38?42°C，适当调节假阴道压力和润滑度。首次采精时采精员要注意人畜安全、沉着冷静、胆大心细、操作熟练、自然，站于公牛右侧，当公牛爬跨时，捕捉最佳时机顺势采精，防止采精时造成公牛的不快而影响正常采精和形成恶癖。
[0008]4.大额牛冷冻稀释液的配制:准确称量所需试剂，混合、溶解、过滤和消毒待用。
[0009]5.细管冻精制作设备:相差显微镜，分光光度计，MRS-3自动分装机，程控冷冻仪，液氮生物容器，液氮，微型塑料细管，拇指管，电冰箱，低温操作柜，细管冷冻架，玻片，量筒，量杯，离心试管，恒温水浴锅，移液器和稀释液等。
[0010]6.大额牛精液的处理；采集到的大额牛精液首先用刻度离心管或用称重法测定采精量；测定精子密度:取0.7%NaCl溶液3960微升于比色皿中，然后取大额牛原精40微升加入NaCl溶液使两者充分混匀，放入分光光度计比色槽测定精子密度；用相差显微镜检查原精活力。
[0011]7.大额牛精液的稀释:原精活力60%以上，精子密度2.0亿/ml以上的大额牛精液用冷冻稀释液稀释，每剂量精子总数为015?0.20亿，有效精子数450?800万。精液的分装:稀释后的大额牛精液用MRS-3自动分装机在室温下分装在微型塑料细管内，封口和印字。大额牛细管精液的平衡:分装后的细管精液放置于电冰箱在+4°C的温度下平衡2?4小时。
[0012]8.大额牛细管精液的冷冻:平衡后的大额牛精液在+4°C左右温度下整齐放在细管冷冻架上，然后把细管冷冻架和精液放入-130?_140°C的液氮蒸汽中冷冻6?10分钟，然后把冻结后的细管冻精浸入液氮中进行超低温冻结。或用程控冷冻仪冷冻，冷冻曲线为:+ 4°C至-10°C，冷冻速度为 5°C /mn.-10°C至 _100°C，冷冻速度为 40°C /mn._100°C至-140°C,冷冻速度为20°C /mn，然后把冻结后的细管冻精浸入液氮中进行超低温冻结。
[0013]9.大额牛细管冻精的解冻检查和保存:冷冻后的大额牛细管冻精随机抽取I?2支，立即放入40±2°C的水浴中解冻5?20秒，检查解冻活力，解冻活力可达35?45%，解冻活力30%以上的大额牛细管冻精包装放入液氮中长期保存。
[0014]10.大额牛细管冻精的使用:冷冻解冻后活力达30%以上的大额牛细管冻精即可用于人工授精，适当降低每剂量有效精子数，不影响大额牛细管冻精输精受胎率，情期受胎率可达50%以上。
【主权项】
1.大额牛选择体型大的公牛，其特征是明显的公牛进行人工驯化和调教。
2.采精调教，其特征是应用性引诱方法进行采精调教，通过性引诱对大额牛公牛反复进行性刺激，使公牛产生性反射，表现性行为，进行假阴道采精训练，待公牛性兴奋强烈并爬跨台畜(或同伴)时，及时接近公牛，抚摩公牛臀部、外阴部及包皮，当公牛性兴奋充分时用预备好的假阴道采精。
3.采精方法，其特征是假阴道法，用假阴道采精时，假阴道内胎温度为38?42°C，适当调节假阴道压力和润滑度，首次采精时采精员要注意人畜安全、沉着冷静、胆大心细、操作熟练、自然，站于公牛右侧，当公牛爬跨时，捕捉最佳时机顺势采精，防止采精时造成公牛的不快而影响正常采精和形成恶癖。
4.大额牛冷冻稀释液的配制，其特征是准确称量所需试剂，混合、溶解、过滤和消毒待用。
5.细管冻精制作设备，其特征是相差显微镜，分光光度计，MRS-3自动分装机，程控冷冻仪，液氮生物容器，液氮，微型塑料细管，拇指管，电冰箱，低温操作柜，细管冷冻架，玻片，量筒，量杯，离心试管，恒温水浴锅，移液器和稀释液等。
6.大额牛精液的处理，其特征是采集到的大额牛精液首先用刻度离心管或用称重法测定采精量，测定精子密度:取0.7%NaCl溶液3960微升于比色皿中，然后取大额牛原精40微升加入NaCl溶液使两者充分混匀，放入分光光度计比色槽测定精子密度，用相差显微镜检查原精活力。
7.大额牛精液的稀释，其特征是原精活力60%以上，精子密度2.0亿/ml以上的大额牛精液用冷冻稀释液稀释，每剂量精子总数为015?0.20亿，有效精子数450?800万，精液的分装:稀释后的大额牛精液用MRS-3自动分装机在室温下分装在微型塑料细管内，封口和印字，大额牛细管精液的平衡:分装后的细管精液放置于电冰箱在+4°C的温度下平衡2?4小时。
8.大额牛细管精液的冷冻，其特征是平衡后的大额牛精液在+4°C左右温度下整齐放在细管冷冻架上，然后把细管冷冻架和精液放入-130?_140°C的液氮蒸汽中冷冻6?10分钟，然后把冻结后的细管冻精浸入液氮中进行超低温冻结。或用程控冷冻仪冷冻，冷冻曲线为:+ 4°C至-10°C，冷冻速度为 5°C /mn.-10°C至 _100°C，冷冻速度为 40°C /mn.-100°C至-140°C，冷冻速度为20°C/mn，然后把冻结后的细管冻精浸入液氮中进行超低温冻结。
9.大额牛细管冻精的解冻检查和保存，其特征是冷冻后的大额牛细管冻精随机抽取I?2支，立即放入40±2°C的水浴中解冻5?20秒，检查解冻活力，解冻活力可达35?45%，解冻活力30%以上的大额牛细管冻精包装放入液氮中长期保存。
10.大额牛细管冻精的使用，其特征是冷冻解冻后活力达30%以上的大额牛细管冻精即可用于人工授精，适当降低每剂量有效精子数，不影响大额牛细管冻精输精受胎率，情期受胎率可达50%以上。
【专利摘要】大额牛是一种仍处于半野生半家养的畜类，为国家二级保护野生动物，在我国仅产于云南省贡山独龙族怒族自治县独龙江一带。大额牛细管冷冻精液（以下简称冻精）是指将采集到的大额牛新鲜精液，经过处理后，把精液封装在微型（0.25ml)塑料细管内，利用液氮为冷源，按特定的程序和冷冻速度进行冷冻，使精液以冻结的形式保存于超低温环境下，达到长期保存大额牛精液的目的。大额牛细管冻精的制作有利于其遗传物质的长期保存，防止大额牛种群种质衰退和基因丢失。
【IPC分类】A01N1-02
【公开号】CN104542572
【申请号】CN201310496109
【发明人】毛翔光, 赵家才, 马燕茹, 何永富, 李雯, 鲁增荣, 雷衡, 李春平, 王春兰, 孙开兰
【申请人】云南省种畜繁育推广中心, 云南恒翔家畜良种科技有限公司
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2013年10月22日