细胞或组织的玻璃化冷冻保存用工具的制作方法
【技术领域】
[0001 ]本发明设及在冷冻保存生物的细胞或组织等时使用的玻璃化冷冻保存用工具。
【背景技术】
[0002] 在各种各样的产业领域中需要生物的细胞或组织的优质保存技术。例如，在牛的 胚胎移植技术中使用的胚胎是配合受体牛(受胚牛）的发情周期进行移植的，为了配合发情 周期进行胚胎的移植，将胚胎冷冻保存，配合发情周期，将胚胎融解进行移植。而且，在人的 不孕治疗中，在从母体采集卵子或卵巢后，为了配合适合移植的时机而冷冻保存，在移植时 融解使用。
[0003] -般来说，从活体内采集的细胞或组织，例如即使是在培养液中也会逐渐失去活 性，因此，在活体外的细胞或组织的长期培养是不可取的。为此，不损害生物活性的长期保 存的技术是重要的。通过优异的保存技术，可W更加正确地分析所采集的细胞或组织。而 且，通过优异的保存技术，可W用于在保持更高的生物活性的状态下移植，有望提高移植后 的成活率。此外，也可W将在活体外培养的培养皮肤和在活体外构筑的类似于所谓细胞片 的移植用的人工组织按顺序生产保存，在必要时使用，不仅在医疗方面、在产业方面也是广 泛需求的技术。
[0004] 作为细胞或组织的保存方法，例如已知有缓慢冷冻法。在此方法中，首先，在使憐 酸缓冲生理盐水等的生理溶液中含有冷冻保护剂而得到的保存液中浸溃细胞或组织。作为 该冷冻保护剂，使用甘油、乙二醇等化合物。将细胞或组织在该保存液中浸溃后，通过W比 较慢的冷却速度(例如0.3~0.5°C/分钟的速度)冷却至-30~-35°C，使细胞内外或组织内 外的溶液充分冷却，粘度变高。在运样的状态下，如果将该保存液中的细胞或组织进一步冷 却至液氮的溫度(-196°C)的话，细胞内或组织内W及其外面的周围的少许溶液均发生变成 非晶固体的玻璃化。可W认为，因为通过玻璃化，细胞内外或组织内外固化，实质上分子的 运动消失，所W通过将玻璃化的细胞或组织在液氮中保存，可W半永久地保存。
[0005] 然而，在上述缓慢冷冻法中，因为需要W比较慢的冷却速度冷却，所W为了进行冷 冻保存的操作需要时间。而且，还存在需要用于进行溫度控制的装置或工具的问题。此外， 在上述缓慢冷冻法中，因为在细胞外或组织外的保存液中形成冰晶，所W细胞或组织可能 遭受该冰晶造成的物理性损害。
[0006] 作为解决在上述缓慢冷冻法中的问题点的方法，有人提议玻璃化保存法。玻璃化 保存法是利用了通过大量含有甘油、乙二醇、DMSO(二甲基亚讽)等冷冻保护剂降低水溶液 的凝固点，使得即使在冰点下也难W形成冰晶的原理的方法。将此水溶液在液氮中急速冷 却，可W不形成冰晶直接固体化。将运样的固体化称为玻璃化冷冻。而且，将大量含有冷冻 保护剂的水溶液称为玻璃化液。
[0007] 作为上述玻璃化保存法的具体操作为:在玻璃化液中浸溃细胞或组织，之后，冷却 至液氮的溫度(-196°C)。因为是如此简便且迅速的步骤，所W在用于冷冻保存的操作中不 需要时间，此外，不需要用于溫度控制的装置或工具。
[0008] 使用玻璃化保存法，细胞内外不产生任何冰晶，因此可W避免对于冷冻时和融解 时对细胞的物理性伤害(冻害），然而，玻璃化液中含有的高浓度的冷冻保护剂具有化学性 毒性，在细胞或组织的冷冻保存时，玻璃化液不超过必要量W上为好。同时，细胞或组织在 玻璃化液中暴露的时间、也就是到达冷冻的时间W短时间为好。进一步地，解冻后需要立即 将玻璃化液稀释。
[0009] 关于使用运些玻璃化保存法的细胞或组织的冷冻保存，有人给出了通过各种各样 的方法、使用各种各样的种类的细胞或组织的例子。例如，专利文献1显示，对于动物或人的 生殖细胞或体细胞的玻璃化保存法的应用，在冷冻保存、融解后的生存率的方面是极其有 用的。
[0010] 玻璃化保存法主要是用于人的生殖细胞而发展起来的技术，然而，最近也广泛地 探讨在iPS细胞和ES细胞上的应用。而且，非专利文献1显示，在果蛹胚胎的保存中玻璃化保 存法是有效的。进一步地，专利文献2或非专利文献2显示，在植物培养细胞和组织的保存 中，玻璃化保存法是有效的。运样，已经知道玻璃化保存法在大范围的各种各样的种的细胞 和组织中是有用的。
[0011] 作为用于更加有效地进行玻璃化保存法的工具和操作方法，专利文献3等尝试在 吸管中充满的玻璃化液中，将卵子或胚胎进行玻璃化冷冻保存，解冻时尽快与稀释液接触 提高再生率。
[0012] 专利文献4提议，将卵子或胚胎与玻璃化液一起放在玻璃化保存液除去材料上，通 过从下部吸引除去在卵子或胚胎的周围附着的多余的玻璃化液，W高的生存率冷冻保存的 方法。另外，也有记载作为玻璃化保存液除去材料有:金属丝网；由纸等天然物质或合成树 脂制成的膜状物且具有贯通孔的材料。
[0013] 专利文献5提议，通过将卵子或胚胎的周围附着的多余的玻璃化液使用滤纸等吸 收体吸收，W高的生存率进行冷冻保存的方法。
[0014] 专利文献6、专利文献7提议，在人的不孕治疗领域使用的所谓的被称作Cryotop法 的方法中，使用作为卵子附着固定用带的长方形的柔性且无色透明的膜，在该膜上将极少 量玻璃化液和卵子或胚胎一起在显微镜下使之附着、冷冻保存的方法。
[0015] 现有技术文献
[0016] 专利文献
[0017] 专利文献1:日本特许第3044323号公报
[0018] 专利文献2:日本特开2008-5846号公报
[0019] 专利文献3:日本特开平10-248860号公报
[0020] 专利文献4:国际公开第2011/070973号小册子
[0021] 专利文献5:日本特开2005-40073号公报
[0022] 专利文献6:日本特开2002-315573号公报
[0023] 专利文献7:日本特开2006-271395号公报
[0024] 非专利文献
[00巧]非专利文献 1:Stepo址US等，NaUire 345:170-172(1990)
[00%] 非专利文献2:酒井昭，低溫生物工学会誌42:61-68( 1996)
【发明内容】
[0027] 发明要解决的技术问题
[0028] 因为专利文献3提议的方法是在吸管中充满玻璃化液，所W存在到达冷冻的时间 长的问题。同时，可W冷冻保存的细胞或组织的大小受到吸管内径的限制，所W保存类似于 细胞片的片状组织是困难的。
[0029] 专利文献4提议的方法是通过除去附着在卵子或胚胎的周围的多余的玻璃化液， 提议W高的生存率将运些生殖细胞冷冻保存的方法。然而，专利文献4记载的方法因为在除 去多余的玻璃化液时需要从下部吸引操作，所W成为了烦杂的操作，在短时间内进行玻璃 化冷冻保存操作的情况下不合适。进一步地，如果从下部的吸引不充分，则存在多余的玻璃 化液残存的问题。
[0030] 专利文献5提议通过将附着在卵子或胚胎的周围的多余的玻璃化液吸收至滤纸等 吸收体中，W高的生存性冷冻保存运些生殖细胞的方法。然而，通过Cryotop法，例如在玻璃 化保存法应用于人的卵子或胚胎的情况下，特别是W高精度要求卵子或胚胎对吸收体附着 确认作业的正确性，然而，因为滤纸全光线透射率低，在一般使用的透过型光学显微镜下观 察吸收体上附着的卵子或胚胎是困难的，所W可靠地确认卵子或胚胎的附着是极其困难 的。而且，在冷冻保存后的融解作业时，也存在可靠地从吸收体上采集卵子或胚胎存在困难 的问题。
[0031] 专利文献6、专利文献7提议的方法在一定程度解决了专利文献5所提议的方法的 不适合的问题。专利文献6、专利文献7所提议的方法操作性好，提供了不占有冷冻保存空间 的紧凑的卵冷冻保存用具。该卵冷冻保存用具配备有在显微镜下可W观察人的卵子或胚胎 的柔性且无色透明的平坦的膜(卵附着固定用带），通过在该膜上将极少量(0.化1)玻璃化 液和卵子或胚胎一起滴下附着，可W冷冻保存卵子或胚胎。但是，运些膜的宽度通常为0.5 ~2mm，如果操作不熟练，将极少量的含卵子或胚胎的玻璃化液正确滴下附着非常困难。实 际上众多新手培养人员在卵子或胚胎的冷冻操作上首先受挫的是使用极少量液体将卵子 或胚胎放置于载片的操作。进一步地，在大量滴下玻璃化液的情况下，多余的玻璃化液在卵 子或胚胎的周围残留，由于玻璃化液自身的毒性，卵子或胚胎的生存性有降低的可能。因 此，需要有解决运些操作的难度和烦杂性的方法。
[0032] 本发明的主要课题是提供可W使细胞或组织的冷冻保存作业容易且可靠地进行 的玻璃化冷冻保存用工具。更具体地说，所述课题是提供玻璃化冷冻保存用工具，将细胞或 组织在玻璃化液中浸溃，在玻璃化液与细胞或组织一起在玻璃化液吸收体上滴下时，具备 为了吸收多余的玻璃化液的优异的吸收性能，可W使用透过型光学显微镜W适宜的可见性 (附着确认性)观察玻璃化液吸收体上的细胞或组织的玻璃化冷冻保存用工具。并且，本发 明除了具有为了吸收多余的玻璃化液的优异的吸收性能W外，其课题进一步提供在冷冻保 存后的融解操作时，能够W适宜的可见性观察该玻璃化冷冻保存用工具上所放置的细胞或 组织的玻璃化冷冻保存用工具。
[0033] 解决技术问题的手段
[0034] 本发明者等为了解决上述课题而积极探讨的结果发现，上述各种技术性课题可W 通过具有W下构成的细胞或组织的玻璃化冷冻保存用工具来解决。
[0035] (I)细胞或组织的玻璃化冷冻保存用工具，所述玻璃化冷冻保存用工具含有使用 折射率为