专利名称：真鲷麦管玻璃化冷冻保存方法
技术领域：
本发明属海洋生物技术领域，通过真鲷胚胎玻璃化冷冻、液氮长期保存及解冻洗脱等技术获取正常复活胚胎。
背景技术：
鱼类胚胎冷冻保存研究约有20年历史。国内外学者对鱼类胚胎冷冻保存的损伤机理、冷冻降温速率、解冻复温、抗冻剂种类和毒性等方面进行了大量研究，并取得很大进展。目前鲤科鱼类胚胎在-100℃以上温度的冷冻保存已获得较稳定的复活率(张克俭等。三种淡水鱼类胚胎低温保存及其降温和复温速率的研究。水产学报1997，21(4)366-372)，鲑鳟鱼类胚胎亦突破-25℃的界限(Erdahl，D.A.，Preservation of spermatozoa and ova from freshwater fish.Thesis of the Universityof Minnesota1986)。鲤鱼(Zhang，X.S.，et al.A study on the cryopreservation of commoncarp embryos.Cryo Letters，1989，10271-278)、泥鳅(张克俭等，同上)在液氮区获得了个别冷冻复活胚胎，尽管以上实验还难以重复，但可以说是目前比较好的结果。由于鱼类胚胎尤其是海水鱼类胚胎体积大、含有大量的卵黄和水分等特点，给胚胎冷冻保存造成很大困难。玻璃化冷冻方法是近年来兴起的一种生物材料保存的新方法，以其冻存体积小、表面积大、操作方便快捷、设备要求简单等特点而表现了良好的应用前景。真鲷的胚胎冷冻保存对真鲷这种海水名贵鱼类的种质保存、遗传多样性保护和育种及其养殖业可持续发展具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供真鲷胚胎颗粒玻璃化冷冻保存方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为一种真鲷麦管玻璃化冷冻保存方法，选择真鲷心跳期至出膜前期胚胎，将其放入抗冻剂中后，在冰箱中预冷，利用麦管快速玻璃化方法直接投入液氮中保存，解冻时放入43℃快速水浴解冻，用洗脱溶液洗脱，最后放入海水中培育，获取复活胚胎。
选择真鲷心跳期至出膜前期胚胎时，真鲷胚胎心跳次数为60-140次/分钟。
抗冻剂以平衡盐溶液Cortland为基液，溶液中含有二甲基亚砜体积含量20.5％(V/V)+乙酰胺体积含量15.5％(V/V)+丙二醇体积含量10％(V/V)+聚乙二醇(PEG8000)质量体积比6％(W/V)多种抗冻剂混合使用。
真鲷胚胎在冰箱中预冷时，温度为0～4℃，预冷时间20～25分钟。
使用冷冻容器时，冷冻容器为麦管，体积0.4～0.6ml。
投入液氮保存时，加入辅助设施支撑铝条、铁球，麦管快速浸入液氮中。
水浴解冻时，在43℃水浴，快速解冻3～5秒。
洗脱时，在0.5mol/L蔗糖中浸泡9～11分钟。
本发明的优点在于1、真鲷心跳期胚胎与其它早期阶段的胚胎相比，对冷冻降温的耐受力最强；2、二甲基亚砜、乙酰胺、丙二醇、聚乙二醇多种渗透性抗冻剂和非渗透性抗冻剂混合使用，降低了玻璃化液浓度，从而减轻了对胚胎的毒性，同时提高玻璃化程度；3、麦管体积小，导热性好，易于实现玻璃化；4、快速玻璃化，避免了冰晶形成对胚胎的冷冻损伤；5、冷冻、解冻操作简便，克服大型仪器设备制约，益于广泛推广；本发明对真鲷心跳期胚胎，通过添加抗冻剂，采用快速麦管玻璃化冷冻、液氮保存、解冻、洗脱等步骤，获得复活胚胎。本发明真鲷胚胎冷冻保存对于真鲷的种质保存、遗传多样性和育种及可持续养殖等方面有着重要意义。
具体实施例方式
本发明的保护范围不仅局限于下列实施例中。
(1)捞取同批自然产真鲷受精卵，放置海水温度18±1℃、微充气的孵化桶内培育，至心跳期胚胎，心跳次数60次/分钟以上(60-140次/分钟)；(2)用80目筛绢网捞取胚胎，用滤纸轻蘸吸去表面海水，放入抗冻剂中，抗冻剂为多种抗冻剂混合使用，含二甲基亚砜20.5％(体积含量)+乙酰胺15.5％(体积含量)+丙二醇10％(体积含量)+聚乙二醇6％(质量体积比，W/V，每100ml溶液中含6g聚乙二醇)，平衡盐溶液Cortland作为基液(即余量，pH＝8.28)，并快速吸入0.5ml麦管中，在0～4℃冰箱中预冷25分钟。
(3)将支撑铝条底部固定一直径约1.5cm的铁球，用来加快浸入液氮的速度。
(4)从冰箱中取2支麦管(共有胚胎96粒)，取出事先浸入液氮的支撑铝条，将麦管卡紧在支撑条上，快速投入液氮中。
(5)4小时后取出麦管，迅速放入43℃水浴锅中解冻，3～5秒钟后取出。
(6)剪断麦管两端，将内容物倒入80目筛绢的小漏斗上，过滤胚胎，与抗冻剂分离；
(7)将胚胎放入0.5mol/L蔗糖溶液中浸泡10分钟，然后再过滤，放入18±1℃的过滤海水中静水培育；(8)解冻后复活胚胎共2粒，复活率为2.1％，复活胚胎全部发育至仔鱼。
另外，经试验，真鲷胚胎在冰箱中预冷时，温度为0～4℃，预冷时间可以为20～25分钟；麦管体积可以为0.4～0.6ml；洗脱时，在0.5mol/L蔗糖中浸泡时间可以为9～11分钟，亦可达到本发明目的，由于其实施较为简单，故不再赘述。
权利要求
1.一种真鲷麦管玻璃化冷冻保存方法，其特征在于选择真鲷心跳期至出膜前期胚胎，将其放入抗冻剂中后，在冰箱中预冷，利用麦管快速玻璃化方法直接投入液氮中保存，解冻时放入43℃快速水浴解冻，用洗脱溶液洗脱，最后放入海水中培育，获取复活胚胎。
2.根据权利要求1所述真鲷麦管玻璃化冷冻保存方法，其特征在于选择真鲷心跳期至出膜前期胚胎时，真鲷胚胎心跳次数为60-140次/分钟。
3.根据权利要求1所述真鲷麦管玻璃化冷冻保存方法，其特征在于所述抗冻剂以平衡盐溶液Cortland为基液，溶液中含有二甲基亚砜体积含量20.5％(V/V)+乙酰胺体积含量15.5％(V/V)+丙二醇体积含量10％(V/V)+聚乙二醇质量体积比6％(W/V)。
4.根据权利要求1所述真鲷麦管玻璃化冷冻保存方法，其特征在于真鲷胚胎在冰箱中预冷时，温度为0～4℃，预冷时间20～25分钟。
5.根据权利要求1所述真鲷麦管玻璃化冷冻保存方法，其特征在于使用冷冻容器时，冷冻容器为麦管，体积0.4～0.6ml。
6.根据权利要求1所述真鲷麦管玻璃化冷冻保存方法，其特征在于投入液氮保存时，加入辅助设施支撑铝条、铁球，麦管快速浸入液氮中。
7.根据权利要求1所述真鲷麦管玻璃化冷冻保存方法，其特征在于水浴解冻时，在43℃水浴，快速解冻3～5秒。
8.根据权利要求1所述真鲷麦管玻璃化冷冻保存方法，其特征在于洗脱时，在0.5mol/L蔗糖中浸泡9～11分钟。
全文摘要
本发明属海洋生物技术领域，通过真鲷胚胎玻璃化冷冻、液氮长期保存及解冻洗脱等技术获取正常复活胚胎。本发明对真鲷心跳期胚胎，通过添加抗冻剂，采用快速麦管玻璃化冷冻、液氮保存、解冻、洗脱等步骤，获得复活胚胎。真鲷胚胎冷冻保存对于真鲷的种质保存、遗传多样性和育种及可持续养殖等方面有着重要意义。
文档编号C12N5/08GK1749392SQ20041005041
公开日2006年3月22日 申请日期2004年9月15日 优先权日2004年9月15日
发明者丁福红, 李军, 肖志忠 申请人:中国科学院海洋研究所