专利名称：一种提高绵羊成熟卵母细胞玻璃化冷冻后发育能力的方法
技术领域：
本发明涉及动物胚胎生物技术领域，特别是涉及提高绵羊卵母细胞的发育的方 法，本申请称之为 Electric-Chemical-Electric, ECE 法。
背景技术：
卵母细胞冷冻保存不仅对于濒临物种的保存具有重要意义，而且可以为基础研究 提供了大量可利用的材料。近年来，玻璃化冷冻法保存卵母细胞获得了优于传统慢速冷冻 法的效果。许多报道利用玻璃化冷冻法保存了不同动物的卵母细胞，而且在一些报道中也 获得健康的后代。但是，目前绵羊卵母细胞玻璃化冷冻的成功率仍然较低，相对于新鲜的卵 母细胞，玻璃化冷冻后的卵母细胞发育能力很低。有报道表明，玻璃化冷冻过程会对动物卵 母细胞造成多种损伤，例如细胞骨架的破坏、皮质颗粒的提前释放以及透明带超微结构的 变化。这些变化严重阻碍了正常的受精过程，使精子不能进入卵母细胞而受精，采用显微注 射可以提高精子进入卵母细胞的比率，但是玻璃化冷冻后的卵母细胞发育能力很低，需要 额外的刺激才能启动其正常发育，目前用于卵母细胞的激活多用化学激活方法，但是化学 激活后，很容易照成孤雌激活胚胎，不能形成正常的二倍体胚胎。
发明内容
针对上述领域的缺陷，本发明提供一种提高了玻璃化冷冻后绵羊卵母细胞的发育 能力的方法，其孤雌激活胚胎比率减少，而正常的二倍体胚胎比率大大提高，同时与常规的 体外受精方法相比，其卵裂率和囊胚率分别提高到13. 7%和6. 8%。一种提高绵羊成熟卵母细胞玻璃化冷冻后发育能力的方法，包括绵羊成熟卵母细 胞的显微注射受精和受精卵的激活步骤，其特征在于所述受精卵的激活包括如下步骤 1.将显微注射后的绵羊成熟卵母细胞在直流脉冲(2. 4kv/cm, IOus)下刺激1次；2.放入添 加了 5mMionomycin的SOF培养液中5分钟；3.在SOF培养液中3小时；4.移入添加了 1. 9 mM6-dimethylaminopurine (6-DMAP)的 SOF 培养液中 1. 5 小时；5.用直流脉冲(2. 4kv/cm, IOus)再刺激1次。所述SOF 培养液成分如下107· 63nM NaCl+7.16mM KC1+1.19mM KE,P04+1. 51mMMgS04+l. 78mM CaCl2. 2H,(K25. OOmM NaH003+5. 35nM 乳酸钠 +7. 27nM 丙酮酸钠 +0. 20mM 谷氨酰胺 +20. O μ L/nL 必需氨 基酸混合液+10. O μ L/nL非必需氨基酸混合液+0. 34πΜ柠檬酸钠+2. 77πΜ肌醇+100IU/nL青霉素 +100IU/nL 链霉素 +0. 2mg/nL 酚红。所述绵羊成熟卵母细胞的显微注射受精是利用显微操作仪将单个绵羊精子直接 注射到玻璃化冷冻后的绵羊成熟卵母细胞。所述绵羊成熟卵母细胞的显微注射受精包括如下步骤(1)用0. 2%透明质酸酶 将存活的绵羊成熟卵母细胞的颗粒细胞去除，(2)再将卵母细胞移入显微操作液滴中，显微 操作液滴是添加了 25mM Hepes和10%血清的SOF培养液，(3)在显微镜下将单个精子注射 到绵羊成熟卵母细胞中。
本发明受精卵的激活采用直流脉冲_化学激活_直流脉冲的方式进行激活，正常 的二倍体胚胎有明显的提高，孤雌激活胚胎减少。同时经过本方法处理后，提高了玻璃化冷 冻后的绵羊卵母细胞单精子注射后的发育能力，与常规的体外受精方法相比，卵裂率和囊 胚率分别提高了 13. 7%和6.8%。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。1.主要仪器设备显微操作仪、CO2培养箱、恒温台、视体显微镜、恒温箱、超净台。2.玻璃化冷冻后的绵羊卵母细胞准备在显微镜下挑选存活的绵羊成熟卵母细胞，用0.2%透明质酸酶脱去颗粒细胞， 在体视显微镜下选择存在第一极体的、胞质均勻一致的卵母细胞，置于含有10%血清的 HC03-199液中待用。3.显微注射成熟卵母细胞的显微注射是在显微操作仪上进行。将10枚脱去颗粒细胞的成熟 卵母细胞放入操作液滴的一端，操作液滴由添加25mMfepeS和10%血清的SOF培养液组成， 用持卵针吸住一枚卵母细胞，调整极体的位置，使其第一极体位于时钟12点的位置。用注 射针在精子操作滴中吸入1个精子，将注射针移入卵母细胞操作滴中，并将精子推到注射 针尖端，注射针从3点位置穿入卵母细胞深部，回吸少量卵母细胞质，再将精子注入卵母细 胞，将注射针轻轻从卵母细胞中撤出，注射后，将卵母细胞移入液滴的一边直到显微注射完 毕，将注射后的卵母细胞置于培养箱中保存lh。4.受精卵激活当所有卵母细胞注射完毕后进行激活处理。激活处理方法为1.将显微注射 后的绵羊成熟卵母细胞在直流脉冲(2. 4kv/cm，IOus)下刺激一次；2.放入添加了 5mM ionomycin的SOF培养液中5分钟；3.在SOF培养液中3小时；4.移入添加了 1. 9mM 6-dimethylaminopurine (6-DMAP)的 SOF 培养液中 1.5 小时；5.用直流脉冲(2. 4kv/cm, IOus)再刺激1次。5.胚胎发育激活后，胚胎进行培养，培养方法为将受精卵在添加了 10%血清的SOF培养液中 培养7天。每2天半换液。观察胚胎发育情况，统计卵裂率和囊胚率。从2008年1月至2009年10月，经ECE法处理后，玻璃化冷冻后的绵羊卵母细胞 单精子注射后的胚胎发育能力大大提高，与常规的体外受精方法相比，卵裂率和囊胚率分 别提高到13.7%和6.8%。同时，比较了不同处理后的胚胎的染色体倍性，结果发现，利用 ECE法处理后，正常倍性胚胎的比例(71.5%)明显高于普通的化学激活方法(45.4%)，且 与体外受精组没有明显差异，这说明，本方法有利于玻璃化冷冻后的绵羊卵母细胞单精子 注射后胚胎的正常发育，实验结果如下表一玻璃化冷冻后的绵羊成熟卵母细胞在不同受精方法下的发育情况
权利要求
一种提高绵羊成熟卵母细胞玻璃化冷冻后发育能力的方法，包括绵羊成熟卵母细胞的显微注射受精和受精卵的激活步骤，其特征在于所述受精卵的激活包括如下步骤1.将显微注射后的绵羊成熟卵母细胞在2.4kv/cm，10us的直流脉冲下刺激1次；2.放入添加了5mMionomycin的SOF培养液中5分钟；3.在SOF培养液中3小时；4.移入添加了1.9mM6 dimethylaminopurine 的SOF培养液中1.5小时；5.用2.4kv/cm，10us的直流脉冲再刺激1次。
2.根据权利要求1所述的方法，所述S0F培养液成分如下107.63mM NaCl+7. 16mM KC1+1. 19mM KH2P04+1. 51mM MgS04+l. 78mM CaCl2. 2H20+25. OOmM NaHC03+5. 35mM 乳酸钠 +7. 27mM丙酮酸钠+0. 20mM谷氨酰胺+20. 0 u L/mL必需氨基酸混合液+10. 0 u L/mL非必需 氨基酸混合液+0. 34mM柠檬酸钠+2. 77mM肌醇+100IU/mL青霉素+ 100IU/mL链霉素+0. 2mg/ mL酚红。
3.根据权利要求1所述的方法，所述绵羊成熟卵母细胞的显微注射受精是利用显微操 作仪将单个绵羊精子直接注射到玻璃化冷冻后的绵羊成熟卵母细胞。
4.根据权利要求3所述的方法，所述绵羊成熟卵母细胞的显微注射受精包括如下步 骤(1)用0.2%透明质酸酶将存活的绵羊成熟卵母细胞的颗粒细胞去除，(2)再将卵母细 胞移入显微操作液滴中，显微操作液滴是添加了 25mM Hepes和10%血清的S0F培养液，(3) 在显微镜下将单个精子注射到绵羊成熟卵母细胞中。
全文摘要
本发明涉及“一种提高绵羊成熟卵母细胞玻璃化冷冻后发育能力的方法”，属于生物技术领域，包括绵羊成熟卵母细胞的显微注射受精和受精卵的激活步骤，本发明受精卵的激活采用直流脉冲-化学激活-直流脉冲的方式，实验证明玻璃化冷冻后的绵羊卵母细胞单精子注射后采用本发明的激活方法，其胚胎发育能力大大提高，与常规的体外受精方法相比，卵裂率和囊胚率分别提高到13.7％和6.8％。同时，比较了不同处理后的胚胎的染色体倍性，结果发现，利用ECE法处理后，正常倍性胚胎的比例(71.5％)明显高于普通的化学激活方法(45.4％)，且与体外受精组没有明显差异。
文档编号C12N5/075GK101948799SQ20101027043
公开日2011年1月19日 申请日期2010年9月1日 优先权日2010年9月1日
发明者张家新 申请人:张家新