专利名称：新型牛卵母细胞体外成熟培养液的制作方法
技术领域：
本发明涉及胚胎工程领域，特别是涉及牛卵母细胞体外成熟液。
背景技术：
作为胚胎生物工程技术研究的基础之一的牛卵母细胞体外成熟培养技术，自上世纪30年代起至今，许多科学研究人员在牛卵母细胞体外生长、发育领域做了大量工作，对牛卵母细胞培养条件进行了广泛而深入地研究，并取得了较大的进展，目前牛卵母细胞体外成熟(hv"ramatrue ， IVM)培养技术体系已建立，但由于卵母细胞成熟机理、成熟调控方面尚存在
许多尚未阐明和一些亟待解决的问题，以致目前现行方法存在对卵母细胞质量要求高，体外受精率和囊胚形成率低等问题。
羊膜形成于原肠胚之前的受精第8天，羊膜组织细胞保持有前原肠胚胚胎细胞的可塑性，羊膜组织主要由来源于外胚层的羊膜上皮(amniotic epithelial cells, AECs)和来源于中胚层的羊膜间充质(amniotic mesenchyme cells, AMCs) 2类细胞组成(Whittle WL, Gibb W, ChallisJR.: The characterization of human amnion epithelial and mesenchymal cells: the cellularexpression, activity and glucocorticoid regulation of prostaglandin output. Placenta. 2000May;21(4):394-401.)，羊膜上皮细胞具有三种胚原基层细胞的分化潜能，内胚层(肝、胰)、中胚层(心肌细胞)和外胚层(神经细胞)(MikiT，LehmannT,CaiH，etal.: Stem CellCharacteristics of Amniotic Epithelial Cells. Stem Cells. 2005 Aug 4; [Epub ahead of print])。羊膜上皮细胞具有合成释放儿茶酚胺(Elwan MA. :Synthesis of dopamine fromL-3,4-dihydroxyphenylalanine by human amniotic epithelial cells. Eur J Pharmacol. 1998 Jul3 l;354(l》Rl-2; Elwan MA, Ishii T, Sakuragawa N. et al.: Characterization of the dopaminetransporter gene expression and binding sites in cultured human amniotic epithelial cells. NeurosciLett. 2003 May 15;342(l-2):61-4.)、乙酰胆碱(Horikoshi T, Fujii T， Kawashima K, et al.:Acetylcholine increase in amniotic fluid of experimental rats for intrauterine growth retardation.Life Sci. 2003 Mar 28; 72(18-19): 2145-9; Uchida S， Suzuki Y， Araie M， Kashiwagi K, et al.:Factors secreted by human amniotic epithelial cells promote the survival of rat retinal ganglion cells.Neurosci Lett. 2003 Apr 24;341(l):l-4.)神经递质的神经生物学功能，还可以分泌神经营养因子等生物活性物质，具有神经营养功能。目前已检测到脑源性神经营养因子(brain-derivedneurotrophic factor, BDNF)、 NT-3、神经生长因子(nerve growth factor, NGF)和睫状神经营 养因子(ciliary neurotrophic factor, CNTF) (Uchida S, Suzuki Y, Araie M, Kashiwagi K， et al.: Factors secreted by human amniotic epithelial cells promote the survival of rat retinal ganglion cells, Neurosci Lett. 2003 Apr 24;341(l):l-4; Marvin KW, Keelan JA, Eykholt RL, et al.: Expression of angiogenic and neurotrophic factors in the human amnion and choriodecidua. Am J Obstet Gynecol. 2002 Sep;187(3):728-34.)，提示羊膜组织通过分泌释放神经营养因子进入羊水，对胚胎神经发 育的早期阶段具有重要调节作用(Uchida S, Inanaga Y, Kobayashi M, et al.: Neurotrophic function of conditionedmedium from human amniotic epithelial cells. J Neurosci Res. 2000 Nov 15;62(4):585-卯.)。此外，羊膜上皮细胞还可以分泌合成TGF、 EGF、 bFGF禾P HGF等生长因 子，因此应该可以运用去细胞羊膜基质作为滋养层促进体外培养胚胎干细胞的分化，运用羊 膜组织提取物促进未成熟卵细胞体外成熟。综上所述，羊膜上皮细胞可能分泌的已知和某些 未知生物活性物质，能够正向调节培养细胞的生物学特性。
发明内容
针对牛卵母细胞受精率低和囊胚形成率低的问题，结合羊膜上皮细胞的特点，本发明提 供一种新型牛卵母细胞体外成熟培养液，提高了牛卵母细胞成熟率、卵母细胞受精率和囊胚 形成率。
新型牛卵母细胞体外成熟培养液，其特征在于在IVM培养基内添加羊膜上皮细胞或/ 和羊膜上皮细胞培养液的上清液。
所述羊膜上皮细胞培养液的上清液为培养5-7天的羊膜上皮细胞的上清液。 所述羊膜上皮细胞培养液的上清液的加入量为100ml IVM培养基中加入2-20ml羊膜上皮 细胞培养液的上清液.
所述羊膜上皮细胞为l-7代的羊膜上皮细胞。 所述羊膜上皮细胞为人或牛的羊膜上皮细胞。
所述IVM培养基为M199+10% FBS+10吗/ml FSH+0.1吗/ml LH+l吗/ml E2。
利用上皮细胞的特性，我们在体外培养羊膜上皮细胞，最后分离得到羊膜上皮细胞和羊 膜上皮细胞培养液的上清液，将其添加到IVM培养液中构成新型牛卵母细胞体外成熟培养 液。羊膜上皮细胞和羊膜上皮细胞培养液的上清液对牛卵母细胞成熟进行正向调节，羊膜上
皮分泌、合成牛卵母细胞体外成熟生物活性物质，从而提高牛卵母细胞成熟率，实验证明
与原IVM培养液相比，新型牛卵母细胞体外成熟培养液能提高卵母细胞受精率和囊胚形成本发明在常规的IVM培养液中添加羊膜上皮细胞或其培养上清液，建立牛未成熟卵母细 胞IVM培养新体系，以提高IVM牛卵母细胞质量和成熟率，解决目前培养方法中受精率低 和囊胚形成率低的问题。
图1体外培养牛卵母细胞成为成熟卵细胞的方法流程示意图
具体实施例方式
下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明。 实施例1
1、卵母细胞体外成熟培养方法(羊膜上皮细胞培养液的上清液作为IVM培养基添加物) U羊膜上皮细胞培养上清液-体外成熟(AECS-IVM)添加物及培养基制备 l丄l约lmm3的牛或人羊膜剪成碎片，在含0.125^Trypsins (胰酶)的D-hank's， 37'C震摇 30min，转速400 600rpm;
l丄2以细胞筛过滤混悬液，收集羊膜上皮细胞；
12丄3按常规浓度(细胞数在105~106个/瓶)接种羊膜上皮细胞于75cmH音养瓶；
l丄4体外培养羊膜上皮细胞，取5-7天内的培养上清液；
1.1.5离心去细胞及细胞碎片，4°C， 1500—2500rpm， 15-30分钟；
l丄6取上清液，去沉淀物，0.22pm过滤器过滤上清液，分装储于存-80'C深低温冰箱，作为备用。
1.1.7 AECS-IVM培养基制备每100ml IVM培养基(M199+10% FBS+10^g/ml FSH+0.1吗/ml LH+l吗/ml E2)，添加培养羊膜上皮细胞上清液2-20ml， 1N NaOH调节pH7.4-7.8， 4。C储存待用。
1.2未成熟牛卵子的体外成熟培养 1.2.1常规采集、收集牛卵母细胞；
1.2.2牛卵母细胞AECS-IVM培养基中在充分平衡2小时，用含HEPES的AECS-IVM培养基 洗三遍，不含HEPES的AECS-IVM培养基洗两遍。
1.3 体外成熟(IVM)
1.3.1将处理好的牛卵母细胞上述AECS-IVM培养基中，再一起将其放入C02培养箱内培养 22小时，培养条件38.5。C,4.5。/()C02饱和湿度。
1.3.2整个操作过程尽量縮短时间，从检卵到入培不超过30分钟，以60枚计算。1.3.3培养22小时后检测鉴定成熟卵母细胞情况，卵母细胞外围的颗粒细胞会出现明显的扩散 现象，而且可看到第一极体。
1.4体外受精(IVF) 1.4.1常规准备精液；
1.4.2常规处理IVM牛卵细胞，选择成熟牛卵母细胞置IVM培养基中，体外受精备用。 1.4.3受精时将成熟牛卵母细胞和准备的精液放入IVF培养盘，放入C02培养箱，培养19-32 小时。培养条件38.5'C,4.5。/。C02饱和湿度。
1.5体外培养(IVC)
将IVF液滴中受精卵母细胞捡出，放入IVC液滴中，放入C02培养箱中进行培养。每隔48
小时更换培养液一次。
培养第一天出现2-细胞胚胎
培养第二天出现4-细胞胚胎
培养第三天出现8-细胞胚胎
培养第四天出现16-细胞胚胎
培养第五天出现32-细胞胚胎
培养第六天出现晚桑及早期囊胚
培养第七天出现囊胚。
实施例2
1、卵母细胞体外成熟培养方法(羊膜上皮细胞作为IVM培养基添加物) U培养羊膜上皮细胞作为IVM滋养细胞
l丄l约lmm3的羊膜剪成碎片，在含0.125%Trypsins D-hank's， 37'C震摇30min，转速400 600rpm
l丄2以细胞筛过滤混悬液，收集羊膜上皮细胞 l丄3按常规浓度接种羊膜上皮细胞于75cmn音养瓶
l丄4体外培养牛或人羊膜上皮细胞，倾出上清液，加入100ml IVM培养基(M199+10% FBS+10昭/mlFSH+0.1吗/mlLH+l吗/mlE2)，作为羊膜上皮细胞-体外成熟(AEC-IVM)培养
体系1.2未成熟牛卵子的体外培养 1.2.1常规采集、收集牛卵母细胞；
1.2.2牛卵母细胞AEC-IVM培养基中在充分平衡2小时，用含HEPES的AEC-IVM培养基洗 三遍，不含HEPES的AEC-IVM培养基洗两遍。
1.3 体外成熟(IVM)
1.3.1将处理好的牛卵母细胞放入AEC-IVM培养基中，再一起放入C02培养箱内培养22小时， 培养条件38.5°。，4.5%<:02饱和浓度。
1.3.2整个操作过程尽量縮短时间，从检卵到入培不超过30分钟；以60枚计算。
1.3.3培养22小时后检测鉴定成熟牛卵细胞，成熟卵母细胞情况，卵母细胞外围的颗粒细胞会
出现明显的扩散现象，而且还会看到第一极体(包裹较严的不容易看清)。
1.4体外受精(IVF) 1.4.1常规准备精液；
1.4.2常规处理IVM牛卵细胞，选择成熟牛卵母细胞置IVM培养基中，体外受精备用。 1.4.3受精时将IVF培养盘放入C02培养箱，培养19-32小时。
1.5体外培养(IVC)
将IVF液滴中受精卵母细胞捡出，放入IVC液滴中，放入C02培养箱中进行培养。每隔48
小时更换培养液一次。
培养第一天出现2-细胞胚胎
培养第二天出现4-细胞胚胎
培养第三天出现8-细胞胚胎
培养第四天出现16-细胞胚胎
培养第五天出现32-细胞胚胎
培养第六天出现晚桑及早期囊胚
培养第七天出现囊胚。
对照组用上述IVM培养基，不添加任何其它物质，培养方法及操作与实施例1同。实验结 果见表1
表l培养基处理卵 母 细胞数成熟率 (%)受精率 (%)囊胚率 (%)
常规IVM培养基16675.3a (125/166)48.8a (81/166)28.3a (47/166)
加入羊膜上皮细胞 上清液的IVM培养 基21389.2b (1術213)59.2b (126/213)35.2a (75/213)
加入羊膜上皮 细胞的IVM培养基23588.5b (208/235)59.6b (140/235)36.2a (85/235)
上表用t检验进行统计分析。同一栏数值中具有不相同上标字母a、 b表示差异显著(PO.05) 从上表可以看出，实施例1添加了培养羊膜上皮细胞上清液的IVM培养基和实施例2中添加 了羊膜上皮细胞的IVM培养基，较常规IVM培养基成熟率大大提高，且在统计学意义上有 显著差异(P<0.05)，在受精率上也有显著差异(PO.05);而囊胚率在统计学上没有差异 (P〉0.05)，但在数值上有较大的提高。
权利要求
1、新型牛卵母细胞体外成熟培养液，其特征在于在IVM培养基中添加羊膜上皮细胞或/和羊膜上皮细胞培养液的上清液。
2、 根据权利要求1所述的新型牛卵母细胞体外成熟培养液，所述羊膜上皮细胞培养液 的上清液为培养5-7天的羊膜上皮细胞的上清液。
3、 根据权利要求2所述的新型牛卵母细胞体外成熟培养液，所述羊膜上皮细胞培养液 的上清液的加入量为100mlIVM培养基中加入2-20ml羊膜上皮细胞培养液的上清液。
4、 根据权利要求1所述的新型牛卵母细胞体外成熟培养液，所述羊膜上皮细胞为1-7 代的羊膜上皮细胞。
5、 根据权利要求1所述的新型牛卵母细胞体外成熟培养液，所述羊膜上皮细胞为人或 牛的羊膜上皮细胞。
6.根据权利要求1所述的新型牛卵母细胞体外成熟培养液，所述IVM培养基为 M199+10% FBS+10吗/ml FSH+0.1吗/ml LH+l吗/ml E2。
全文摘要
本发明涉及“新型牛卵母细胞体外成熟培养液”属于胚胎工程领域。本发明在常规的IVM培养液中添加羊膜上皮细胞或其培养液的上清液，建立牛未成熟卵母细胞IVM培养新体系，以提高IVM牛卵母细胞质量和成熟率，解决目前培养方法中受精率低和囊胚形成率低的问题。
文档编号C12N5/06GK101591637SQ20081011259
公开日2009年12月2日 申请日期2008年5月26日 优先权日2008年5月26日
发明者李荣旗 申请人:李荣旗