专利名称：一种根特异性启动子及其重组表达载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物基因工程领域，具体的说，是涉及一种根特异性启动子及其重 组表达载体。
技术背景真核生物基因的表达受到转录前、转录水平、转录后加工、转运、翻译水平以 及蛋白活性的调控，其中转录水平的调控是基因表达中最基本的环节，启动子是基 因表达所必需的，决定了外源基因表达的空间、时间和表达的强度，是人们利用基 因工程和转基因技术定向改造植物的重要限制因素。大多数真核生物基因组内编码序列只占其基因组DNA的1% — 10%，而非编 码序列中很大一部分序列起到基因表达调控作用，启动子序列在非编码序列中占有 很大的比例。按照启动子的作用方式可将其分为3类，即组成型启动子、诱导型启 动子和组织特异性启动子，其中，组织特异性启动子又称为器官特异性启动子。当前通过转基因手段来获得基因修饰生物(genomic modified organism, GM0)， 从而改变植物尤其是作物的生长特性、果实品质已经成为现代农业的重要组成部 分。在转基因植物中，最常用的启动子为组成型启动子，即利用CaMV 35S启动子 驱动目的基因在各组织中高水平表达。某些情况下这对于植物的生长发育可能会造 成一些不利的影响，不利于实现人们改造植物的目的。例如，利用CaMV 35S启动 子驱动DREB1A基因转化拟南芥植株后，转基因植株的抗旱性、耐盐性大大提高， 但是由于该基因的过度异位表达，使得正常状况下的植株生长严重受到抑制，表现 为植株矮化、叶片短小。组织特异性启动子可以驱动目的基因在根、茎、叶、花甚至是气孔特异表达。 根部是植物从土壤中吸收水分和营养的主要器官，根特异性启动子可以驱动其下游 的目的基因特异表达在根部。通过转基因手段，可以将已经分离的与K+吸收相关的 转运器特异地超表达于根部，将有效地提高施肥效率。目前已经成功鉴定分离出多 种S、 P、 K转运器，如AKT1和SULTR等，利用根特异性启动子驱动这些基因在 根部表达，可以提高养分的生物利用率。同时，许多经济作物是以根作为储藏器官， 如土豆，可以将与淀粉和糖类代谢相关的基因在根部特异的增强其表达水平，从而提高其利用价值。随着功能基因组学研究的发展，更多的功能基因被克隆，但是要获得更好的转 基因植株，选择适当的启动子使其在特异部位.高效表达是首先要考虑的问题。 发明内容本发明的目的是提供一种植物根特异性启动子。本发明提供的植物根特异性启动子，名称为SP，是如下a)或b)或c)的DNA 分子a) 由序列表中序列1所示的脱氧核糖核苷酸序列组成的DNA分子；b) 在严格条件下与a)限定的DNA序列杂交且能调控目的基因在植物的根中特 异表达的DNA分子；c) 与a)限定的DNA序列具有90X以上的同源性且能调控目的基因在植物的 根中特异表达的DNA分子。所述步骤c)中的启动子，与a)的启动子最好有95%以上的同源性。 上述植物根特异性启动子能调控目的基因在植物根部的维管束组织中表达。 含有本发明的启动子的表达盒、重组载体、转基因细胞系和重组菌也属于本发 明的保护范围。所述表达盒从上游至下游依次为本发明的启动子、目的基因和转录终止子。 扩增所述SP启动子全长及其任意片段的引物对也属于本发明的保护范围。 所述重组表达载体具体可为如图1所示的表达载体或将图1所示的表达载体的 GUS基因替换为所需的目的基因得到的载体。本发明所述SP启动子和所述重组表达载体可用于培育在植物根中特异表达目 的基因的转基因植物。将含有所述SP启动子的重组表达载体转入单子叶植物或双子叶植物中时，可 在单子叶植物或双子叶植物的根中高效表达目的基因；所述植物优选为拟南芥。实验证明，本发明的启动子驱动目的基因在根中特异表达。通过在线数据库比 对分析，结果发现，该845bp的DNA序列中含有两个已知的根特异性表达的顺式作 用元件。ATATT是一种根特异性相关的元件，称为rootmotif，是根瘤农杆菌中rolA 基因启动子的片段。在AtSBP3启动子中含有13个ATATT顺式作用元件。在该启动 子序列中还包含一个木质部特异表达的顺式作用元件ACAAAGAA。本发明提供的根特异性启动子可以替代35S启动子应用于转基因植株，使目的基因定位于根部，或者作为启动子的一部分，连接其它顺式作用元件后获得其它特 性，如增强表达活性或增加诱导表达能力，从而广泛应用于以此为目的的转基因过 程。
图1为重组表达载体pCAMBIA1391-SP的物理图谱 图2为SP启动子驱动GUS基因在拟南芥根中特异表达 图3为SP启动子驱动GUS基因在根部表达的显微照片具体实施方式
实施例l、 SP启动子序列的获得以1周龄哥伦比亚生态型野生型拟南芥植株为实验材料，提取其基因组DNA并 以其为模板，从公布的拟南芥基因组数据库中设计引物，PCR扩增SP启动子序列。 在引物两端分别引入^a/^I和^^ I酶切位点，引物序列如下上游 5' -ACGGGATCCACCATTCACGGTAGGTTCTTTTAT-3'，引入A柳〃I酶切位点；下游 5' -ACGGAATTCTCTTGCGTTTACTGTTTTTGC-3'，引入I酶切位点。对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，切下目的条带纯化回收，将酶切产 物连接到pGEM-T Easy载体上并转化大肠杆菌DH10(3感受态细胞，挑取在A卿抗 性平板上长出的单克隆，提取质粒、酶切鉴定并进行测序，将转入SP启动子序列 的质粒命名为p-SP。测序结果表明，扩增得到的SP启动子的脱氧核糖核苷酸序列 如序列表中序列1所示。实施例2、携带SP启动子和GUS基因的重组表达载体的构建将质粒p-SP和质粒pCAMBIA1391 (购自pCAMBIA公司)37"C条件下分别用 和双酶切3h，酶切产物分别进行1%琼脂糖凝胶电泳分析，回收845bp 的SP启动子序列和12kb的质粒pCAMBIA1391酶切后的大片段，用T4 DNA连接 酶4。C连接过夜。连接产物转化大肠杆菌DH10(3感受态细胞，挑取在Kan抗性平板 上长出的单克隆，提取质粒，进行PCR鉴定和酶切鉴定。将获得的重组表达载体 命名为pCAMBIA1391-SP，重组表达载体pCAMBIA1391-SP的物理图谱如图1所 示。实施例3、 SP启动子驱动GUS基因在拟南芥根中特异表达一、重组表达载体pCAMBIA1391-SP转化野生型拟南芥将实施例2构建的重组表达载体pCAMBIA1391-SP转化根癌农杆菌GV3101感受态细胞，挑取在Rif和卡那霉素(Kan)抗性平板上生长的单菌落进行PCR鉴 定。将含有重组表达载体pCAMBIA1391-SP的农杆菌用Floral dip法转化哥伦比亚 生态型野生型拟南芥，收获该当代转基因拟南芥植株的种子(Ti代)，在添加25mg/L 潮霉素(Hyg)的MS培养基上筛选阳性苗。收获该L代转基因拟南芥的种子(T2代)，将T2代转基因拟南芥种子播种到上述培养基中，对长出的T2代转基因拟南芥的10d龄幼苗和成熟植株的各器官进行GUS基因的检测。 二、 GUS染色分析GUS染液的配制(lmL):称取lmg的X-Gluc，加入1-2滴N,N-二甲基甲酰胺 至X-Gluc完全溶解，然后加入pH 7.0的0.1mol/L磷酸缓冲液980 (iL、 5mmo1 /L的 铁氰化钾10和5mmo1 /L的亚铁氰化钾10 ^L，将混合物搅拌均匀，最后加入1 |uL Triton X-謂。选取转入SP启动子序列的T2代转基因拟南芥的10d龄幼苗、成熟植株的不同 组织，分别放入装有100)iLGUS染液的EP管中，37。C温浴4h，用50%和70%的 酒精依次洗脱12h，之后在体视镜和显微镜下观察转基因拟南芥各器官的染色情况， 并通过CCD摄取图像。转入SP启动子序列的丁2代转基因拟南芥的10d龄苗染色 后的体视镜下观察结果如图2所示，其显微镜下观察结果如图3所示。图2表明， 转入SP启动子序列的T2代转基因拟南芥的根部有蓝色的着色，说明SP启动子驱 动GUS基因仅在根部表达，即SP启动子为根特异性启动子。图3表明SP启动子驱 动GUS基因在根部的维管束组织中表达。序列表〈160> 1〈210〉 1〈211> 845<212> 醒<213〉 拟南芥(乂ra歸ops/s細/Zawa)〈400〉 1cattcacggtaggttcttttattcgctctcactgataatcctttaatatgcaactcaaag60atttgaacctcatgtgaacgttctatgaatatcgttacagata^c犯cggtttaatgac120accgac犯tggggac卿gtggttgatcaatacaag8Latg180actctacaagtagactagaaattt"tagca^cctctttattttacaattatcttgttaagg240attagcaaatgtgaaccagttcttactccattgttaatataagctgcatatatctttgtt300catca^ct8gggatttccaagttctgcagcax:tatggal:Bcttattgagtctaatagaat360caMaattgga^g^gca^gttaaaccggtcaaaagacctaagtatgttggagggtttgag420atatcttgacattctgtgttt卿ggaaggctagatgttgatacaatattgtataatttg■ttatccgttc犯tccaaaagcatttaagtgcgatgtaaagtgatggtttt540ttctagttta犯tgatteigtctcactctctagtcgat￡Lg￡Latattgceiac600ttgtttataaatttgattaggtgagctatg3tt3gt3gtgcataaatacattatctatga660gacaaag3犯cgtgataggttattgttttt"tcttgtttgcgtctggcatatgtatgt8t3720aaaccaaatatcaagcagaacatatgcgattttcaaaatgtgggcggtgctgaaaacata780tattagtttactccaacttgcagaatatttgagtatattaatgcaa^aiacagtaaacgca840卿gc84权利要求
1. 一种启动子，是如下a)或b)或c)的DNA分子a)由序列表中序列1所示的脱氧核糖核苷酸序列组成的DNA分子；b)在严格条件下与a)限定的DNA序列杂交且能调控目的基因在植物的根中特异表达的DNA分子；c)与a)限定的DNA序列具有90％以上的同源性且能调控目的基因在植物的根中特异表达的DNA分子。
2、 含有权利要求1所述的启动子的外源目的基因的表达盒。
3、 含有权利要求1所述的启动子或权利要求2所述的外源目的基因的表达盒 的重组表达载体。
4、 根据权利要求3所述重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体的出 发载体为质粒pCAMBIA1391。
5、 根据权利要求3或4所述的重组表达载体，其特征在于所述重组表达载 体为如下l)或2)的表达载体1) 如图l所示的表达载体；2) 将图1所示的表达载体的GUS基因替换为所需的目的基因得到的表达载体。
6、 含有权利要求1所述的启动子或权利要求2所述的表达盒或权利要求3-5中任一所述的重组表达载体的转基因细胞系或重组菌。
7、 权利要求1所述的启动子或权利要求2所述的表达盒或权利要求3-5中任 一所述的重组表达载体在培育在植物根中特异表达目的基因的转基因植物中的应 用。
8、 根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述植物为单子叶植物或双子 叶植物。
9、 根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述植物为拟南芥。
10、 扩增权利要求1所述的启动子全长及其任意片段的引物对。
全文摘要
本发明公开了一种根特异性启动子及其重组表达载体。该启动子，是如下a)或b)或c)的DNA分子a)由序列表中序列1所示的脱氧核糖核苷酸组成的DNA分子；b)在严格条件下与a)限定的DNA序列杂交的DNA分子；c)与a)限定的DNA序列具有90％以上的同源性且能调控目的基因在植物的根中特异表达的DNA分子。本发明还公开了含有该启动子的重组表达载体，该重组表达载体可应用于培育在植物根中特异表达目的基因的转基因植物。
文档编号C12N1/15GK101280313SQ20081011221
公开日2008年10月8日 申请日期2008年5月21日 优先权日2008年5月21日
发明者飞 任, 张秀清, 王学臣, 陈乃芝, 陈其军, 魏鹏程 申请人:中国农业大学