专利名称：：一种利用盾叶薯蓣内生镰孢菌寡糖提高培养细胞薯蓣皂苷元产率的方法
技术领域：
：本发明涉及生物
技术领域：
，涉及一种促进盾叶薯蓣培养细胞生长和提高薯蓣皂苷元产率的方法，特别是涉及一种生产活性寡糖的微生物一盾叶薯蓣内生镰孢菌。技术背景采用植物细胞培养的方法可以大规模生产次生代谢产物，这些次生代谢产物可用作农药、医药、<七妆品、食品添加剂等。如何有效提高培养细胞中有用代谢产物的含量和产率，是植物次生代谢产物生产走向工业化生产的一个重要方面。有许多手段能有效地促进植物细胞生长和提高植物培养细胞中次生代谢产物的含量，如添加前体物质、改变营养条件、各种机械或物理的诱导作用、各种化学物质的调节等，其中采用来自植物或微生物的寡糖诱导子是一种有效的手段。许多人工合成或由多糖裂解而来的寡糖(oligosaccharide)(或称寡糖片段)具有促进植物生长发育、细胞形态建成、提高次生代谢产物含量和提高植物的抗病性等多种生物活性。已有许多从真菌和植物中获得寡糖的报道，但尚未见从植物内生真菌中获得活性寡糖来影响宿主植物次生代谢的报道。盾叶薯蓣(PZojcoreaz/wg,'6ere似"C.H.Wright)在分类上属于单子叶纲(Monocotyledoneae)百合目(Liliales)薯蓣科(Dioscoreaceae)薯蕷属，为我国特有的药用植物，分布于湖南、湖北、四川、甘肃等省区。盾叶薯蕷根状茎中含有多种内生真菌，它们与宿主植物长期互惠共存，相互影响，协同进化。本发明着重于盾叶薯蓣内生真菌寡糖的制备及其在细胞培养中提高薯蕷皂苷元产率方面的应用，为新型诱导子的开发和探讨内生真菌与宿主之间的相互关系提供依据。
发明内容本发明涉及一种镰孢菌(Fusan'iifnsp.),菌株代号为Dzfl7,现保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2008年4月29日，登记入册编号为2472。本发明涉及镰孢菌的分离和分类鉴定、真菌寡糖的制备，以及真菌寡糖对盾叶薯蓣培养细胞生长和薯蓣皂苷元形成的影响，有效提高薯蓣皂苷元的产率，提供如下的技术方法。1、内生镰孢菌Dzfl7的分离采集新鲜的盾叶薯蕷根状茎，采用内生真菌的分离和纯化技术，获得一株内生真菌，编号为Dzfl7。2、内生镰孢菌Dzfl7的形态特征(1)无性世代内生真菌Dzfl7菌株在PDA培养基上25。C培养，菌落白色夹杂紫色，圆形，产生大量紫色色素，分生孢子梗单生或轮生，瓶梗状，大孢子近镰刀形，23个隔，小孢子卵圆形，椭圆形，肾形无隔1个隔，孢子大小4.8nm22.8pmx2.3nm5.0nm。内生真菌Dzfl7的形态特征(见图1、图2、图3和图4)符合镰孢菌属(fkran',)真菌的形态特征。(2)有性世代未发现。3、内生镰孢菌Dzfl7的分子生物学特征运用PCR技术，扩增采用ITS通用引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')禾QITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')。将Dzfl7菌株的ITS序列提交到GenBank核酸序列库中注册获得序列号(accessionnumber)EU543260。同时将Dzfl7菌株的ITS序列与GenBank中其他真菌的ITS序列进行比对，找出相似性最高，亲缘关系最近的真菌，Dzfl7菌株的ITS序列与尖孢镰孢菌(尸w^W7'z/mac;^on/m)EF495237的ITS序列相似度为100%,聚在一个分支上的可信度为100%。其同源性的系统发育树图见图5。4、内生镰孢菌Dzfl7的发酵培养特征培养基液体马铃薯-葡萄糖(PD)培养基。培养温度25±1°C。是否光照否。培养时间14天。摇床转速150rptn。培养特征培养第6天，菌液略带淡紫色；培养第14天，菌液为黄白色。5、内生镰孢菌Dzfl7多糖和寡糖的制备Dzfl7菌丝多糖含量为224.56mg/gdw,得率为2.785g/L;菌丝寡糖含量为56.25mg/gdw，得率为0.698g/L;菌液多糖得率为0.625g/L;菌液寡糖得率为0.124g/L。6、盾叶薯蓣细胞悬浮培养特征培养基MS培养基。培养温度25±1°C。是否光照否。培养时间16天26天不等。摇床转速120ipm。培养特征细胞均匀分散，成微团，悬浮培养液不产生色素。7、内生镰孢菌Dzfl7寡糖对培养细胞生长和薯蓣皂苷元形成的影响在盾叶薯蓣细胞悬浮培养第16天，添加浓度为30mg/L的内生镰孢菌Dzfl7菌丝寡糖，继续悬浮培养8天，细胞干重为3.401g/L、薯蕷皂苷元含量为1.535mg/gdw、薯蕷皂苷元产率为5.221mg/L;而对照(即不添加寡糖的处理)的细胞干重为2.851g/L、薯蕷皂苷元含量为0.730mg/gdw、薯蓣皂苷元产率为2.081mg/L。内生镰孢菌Dzfl7寡糖能有效地促进培养细胞中薯蓣皂苷元的形成。图l:内生真菌Dzfl7菌落正面。图2:内生真菌Dzfl7菌落背面。图3:内生真菌Dzfl7的菌丝、分子孢子梗和分生孢子。图4:内生真菌Dzfl7的分生孢子。图5:内生真菌Dzfl7同源性的系统发育树图。本发明的优点本发明首次明确了内生镰孢菌Dzfl7菌株的微生物学分类地位，同时发现从该菌制备的寡糖能促进盾叶薯蓣细胞生长及其薯蓣皂苷元的含量，从而有效提高培养细胞中薯蓣皇苷元的产率。本发明的目的是利用植物内生真菌资源，获得活性寡糖，作为诱导子，有效提高培养细胞中次生代谢产物的含量和产率，为新型诱导子的开发和探讨内生真菌与宿主之间的相互关系提供依据。为了更好地理解本发明，下面结合本发明的实施例进一步说明本发明的实质性内容，但本发明的内容并不局限于此。具体实施方式实施例l:内生真菌Dzfl7的分离采集新鲜的盾叶薯蓣根状茎，表面先用70%乙醇处理30s,然后用0.2%氯化荥处理20min以进行彻底的表面灭菌，无菌条件下去除表皮，将根状茎分成约0.5cmx0.5cmx0.5cm大小的块段，摆放在PDA培养基上，每皿l块，在25。C，光照条件下培养7天~20天，从每个菌落的边缘挑取一小段菌丝接种到PDA培养基上进行纯化培养，连续纯化培养45次，至菌落形态一致。将纯化后的菌株在PDA斜面上保存，其中一株内生真菌的编号为Dzfl7。实施例2:内生真菌Dzfl7菌株的发酵工艺本发明采用的是摇床发酵，500mL体积的三角瓶中盛马铃薯-葡萄糖(PD)培养基200mL，将预先培养好的Dzfl7菌丝接种到已灭菌的培养基中，在25。C、150rpm下暗培养14天，得总发酵液20L，采用高速离心(离心力为8000g,离心时间20min)的方法将菌丝和菌液分开，得菌丝体鲜重490.0g,于-20。C保存备用。实施例3:内生真菌Dzfl7菌株的形态特征观察内生真菌Dzfl7菌株在PDA培养基上25。C培养，菌落白色夹杂紫色，圆形，产生大量紫色色素，分生孢子梗单生或轮生，瓶梗状，大孢子近镰刀形，23个隔，小孢子卵圆形，椭圆形，肾形无隔1个隔，孢子大小4.8pm22.8|imx2.3nm5.0nm。内生真菌Dzfl7的形态特征见图1图4。在培养条件下，未发现Dzfl7的有性世代。实施例4:内生真菌Dzfl7菌株ITS序列分析与分子鉴定首先将在平板上活化的Dzfl7菌株的菌丝转移到PDA液体培养基中，悬浮培养5天后获得新鲜的菌丝，采用常规的分子生物学方法提取真菌基因组DNA。运用PCR技术，DNA扩增采用ITS通用引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')。DNA测序所用的引物分别为ITS1和ITS4,采用ABIPRISM3730测序仪，分别进行正向(5'—3')和反向(3'—5')双向测序。反向序列经DNAMAN软件反向互补后与正向序列拼接形成5'—3'完整序列。把所得的ITSrDNA序列提交至UGenBank数据库(NationalCenterforBiotechnologyInformationWebsite,http:Vwww.ncbi.nlm.nih.gov)，获得序列号(accessionnumber)EU543260。利用Blast工具进行序列比对，找出相似性最高，亲缘关系最近的真菌，Dzfl7菌株的ITS序列与尖孢镰孢菌(i^^W娜o;c;^oram)EF495237的ITS序列相似度为100%,其同源性的系统发育树图见图5。根据Blast比对结果，从中抽取与所分离的内生真菌Dzfl7菌株序列相似性高的菌株的序列，采用ClustalX1.8软件进行序列对准，再用MEGA软件计算遗传距离，然后利用距离依靠法中的邻位相连法(Neighbor-joining,NJ)构建进化树，计算Bootstrap值来评价系统发育树的可靠性。Dzfl7同源性的系统发育树图见图5，Dzfl7菌株与尖孢镰孢菌(fWar/鹏o;g邵on^)聚在一个分支上的可信度为100%。实施例5:内生真菌Dzfl7多糖的制备内生真菌Dzfl7多糖的制备分菌丝多糖制备和菌液多糖制备两种。菌丝多糖的制备步骤摇培14天的真菌悬浮培养液(20L)，采用高速离心(离心力为8000g，离心时间20min)的方法将菌丝和菌液分开，得到的菌丝干燥至恒重248g(干重)，依次用蒸馏水、100mmol/L磷酸缓冲液(pH7.2)、500mmol/L磷酸缓冲液(pH7.2)冲洗后，在250mL的500mmol/L磷酸缓冲液(pH7.2)中研磨，然后用500mL500mmol/L磷酸缓冲液(pH7.2)洗4次，抽滤，反复冻融。菌丝体再分别经蒸馏水，甲醇:氯仿=1:1(v/v)、丙酮冲洗，用氯仿:正丁醇=5:1(v/v)不断搅动30min40min去蛋白(采用紫外分光光度法，检验蛋白是否去除干净)，冷冻干燥。按1:100(w/v)重新悬浮于重蒸水中，然后在高温煮提20min。然后经过0.22滤膜过滤，浓縮，然后在蒸馏水中透析48h(MW=8000Da),得到菌丝多糖，冰冻干燥，得到55.69g,含量为98.0%以上。菌液多糖制备步骤采用高速离心(离心力为8000g，离心时间20min)得到的菌液20L，在40。C下真空浓縮(原来的20倍)，加入氯仿乙醇-l:l(v/v)提取脱脂(每次12h)，用氯仿正丁醇=5:1(v/v)不断搅动30min~40tnin去蛋白(在紫外分光光度计上，检验蛋白是否去除干净)。然后加入3倍体^^、的95%乙醇(4。C醇析24h)(重复三次)，然后在37000g离心10min。沉淀再用适量蒸馏水溶解，加入(100mL120mL)水得到的悬浮液，20。C下在蒸馏水中透析48h(截留分子量为8000Da),然后通过离心得到上清液，干燥，得到12.50g，含量为98.0%以上。实施例6:内生真菌Dzfl7寡糖的制备内生真菌Dzfl7寡糖的制备分菌丝寡糖制备和菌液寡糖制备两种。菌丝寡糖的制备步骤取1g实施例5中制备的干燥菌丝多糖，加入20mL2mol/L三氟乙酸(Trifluoroacedcacid,TFA),在密闭的容器中于85°C下水浴2.5h(期间不断振摇)后，放入到冰水中终止反应。然后过滤掉不溶的物质。在35。C40。C浓縮，去除剩余的TFA。得到的浓浆，溶解到100mL的蒸馏水中，然后用lmol/L的NaOH溶液中和，在45。C旋转蒸发至干，得到250.5mg菌丝寡糖，含量为98.5%以上。菌液寡糖的制备步骤取lg实施例5中制备的干燥菌液多糖，加入20mL2mol/LTFA,在密闭的容器中于85°C下水浴2.5h(期间不断振摇)后，放入到冰水中终止反应。然后过滤掉不溶的物质。在35。C40。C浓縮，去除剩余的TFA。得到的浓浆，溶解到100mL的蒸馏水中，然后用1mol/L的NaOH溶液中和，在45。C旋转蒸发至干，得到198.5mg菌液寡糖，含量为98.5%以上。实施例7:盾叶薯蓣细胞悬浮培养本发明采用的是摇床培养，300mL体积的三角瓶中盛MS(MurashigeandStoog)培养基100mL，将预先培养好的盾叶薯蓣愈伤组织接种到己灭菌的培养基中，在25°C、120rpm下暗培养16天26天不等，悬浮细胞收获采用的过滤的形式，将收获的悬浮细胞冻干，按实施例8中描述的方法，测定薯蓣皂苷元的含量。实施例8:盾叶薯蓣细胞中薯蓣皂苷元含量的测定采用高效液相色谱法(HPLC)分析培养细胞中薯蓣皂苷元的含量。悬浮培养的滤液中未检测到薯蓣皂苷元。具体步骤如下-培养细胞中薯蓣皂苷元的制备经不同处理的盾叶薯蓣悬浮细胞，过滤，冰冻干燥，研磨，准确称取200mg,加入15mL的2mol/LH2S04溶液，然后加入35mL异丙醇(使反应液中异丙醇的终含量为70%)。在80。C下回流7h,加入15mL去离子水，分别用50mL正己垸萃取四次，合并萃取液，用lmoJ/LNaOH溶液洗两次，再用去离子水洗两次，最后将正己烷部分减压浓缩，用乙腈溶解，过滤，用10mL容量瓶定容备用。高效液相色谱分析条件岛津LC-10AT型HPLC(Shimadzu)，光电二极管阵列检测器(PhotoDiodeArray,PDA),安捷伦C18液相色谱柱(AgilentTC-C18,250mmx4.6mm)，薯蕷皂苷元的标准品纯度98%,乙腈(Fisher色谱纯)，水(重蒸水)，其他试剂均为分析纯。标准曲线的确定准确称取4.7mg薯蓣皂苷元的标准品于5mL容量瓶中，用乙腈充分溶解并定容，分别取OmL，0.01mL、0.02mL、0.03mL、0.05mL和0.08mL于10mL的容量瓶中，用乙腈定容，然后分别取10nL进样，流动相为乙腈:水=90:10(v/v);流速1.0mL/min;紫外检测波长为208nm;柱温为19。C。以HPLC的峰面积为y，以每次进样的薯蓣皂苷元的质量(吗)为i,获得线性回归方程J^4018687+2856，相关系数及=0.9984。植物培养细胞样品中薯蓣皂苷元含量的测定:取上述定容的正己烷萃取部分10nL，进样,按上述HPLC条件进行薯蕷皂苷元的分析，根据上述线性回归方程进行定量计算。实施例9:内生真菌Dzfl7多糖和寡糖对盾叶薯蓣细胞生长薯蕷皂苷元含量的影响根据实施例5中步骤制备内生真菌Dzfl7的菌丝和菌液多糖。按实施例6中的步骤制备内生真菌Dzfl7的菌丝和菌液寡糖。称取一定量的菌丝多糖或寡糖，用无菌的蒸馏水溶解，在无菌条件下过滤除菌，在细胞悬浮培养第16天，添加寡糖或多糖，使悬浮培养液中寡糖和多糖的浓度为30mg/L。继续培养8天后收获。盾叶薯蓣培养细胞千重、薯蓣皂苷元含量和产率的结果见表l。在30mg/L的浓度下，菌丝或菌液多糖对细胞的生长有一定的抑制作用。菌丝或菌液寡糖对细胞生长的影响不明显，但能明显提高薯蓣皂苷元的含量和产率。经菌丝寡糖处理的悬浮培养细胞，薯蓣皂苷元的产率为5.006mg/L,为对照(1.597mg/L)的3.135倍。表1内生真菌Dzfl7多糖和寡糖对盾叶薯蓣细胞生长薯蓣皂苷元含量的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注接种量:10gfw/L;多糖或寡糖的浓度均为30mg/L，对照为相同体积无菌的MS液体培养基；培养时间培养第16天添加，然后继续培养8天；每个处理均重复三次。实施例10:内生真菌Dzfl7菌丝寡糖及其添加时间对盾叶薯蓣细胞生长薯蓣皂苷元含量的影响根据实施例9中的结果，采用内生真菌Dzfl7菌丝寡糖及其不同浓度，考察不同添加时间对盾叶薯蓣细胞生长薯蓣皂苷元含量的影响，结果见表2。在寡糖浓度为0mg/L40mg/L六个梯度中，无论寡糖与培养细胞共培养时间为4天，8天，还是12天，均以30mg/L的寡糖浓度能有效地提高薯蓣皂苷元的产率；在三种不同的添加时间处理U2d+I2d、16d+8d、20d+4d)中，以培养第16天添加30mg/L浓度的菌丝寡糖，能有效地提高薯蓣皂苷元的产率。表2内生真菌Dzfl7菌丝寡糖及其添加时间对盾叶薯蓣细胞生长薯蓣皂苷元含量的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注接种量10gfW/L;所有对照均为无菌MS液体培养基，每个处理均重复三次。实施例11:内生真菌Dzfl7菌丝寡糖对培养细胞中薯蓣皂苷元合成的动态变化在实施例9和实施例IO的实验结果基础上，在细胞悬浮培养第16天，添加30mg/L的菌丝寡糖，考察内生真菌Dzfl7菌丝寡糖对培养细胞中薯蕷皂苷元合成的动态变化，测定培养第16天(16d+0d)，分别继续培养2天(16d+2d)、培养4天(16d+4d)、培养6天U6d+6d)、培养8天(16d+8d)、培养IO天(16d+10d)培养细胞中薯蓣皂苷元合成的动态变化(结果见表3)。在添后菌丝寡糖(30mg/L)0-4天内薯蓣皂苷元的产率急速增加，近乎于直线形，在第4天的时候达到4.170mg/L,在此后一直到第8天到薯蓣皂苷元也是增加的，只不过是增加的幅度没有前4天大，当到第8天的时候达到最大值5.210mg/L，在第IO天的时候已经有下降的趋势，薯蓣皂苷元产率为4.708mg/L。各个培养时期，添加菌丝寡糖的处理都比与对照高，16d+2d、16d+4d、16d+6d、16d+8d、16d+10d添加菌丝寡糖的薯蓣皂苷元的产率分别是2.351mg/L、4.170mg/L、4.681mg/L、5.210mg/L和4.708mg/L,分别是对照的3.912、5.080、3.294、3.383和3.745倍。表3内生真菌Dzfl7菌丝寡糖对培养细胞中薯蓣皂苷元合成的动态变化<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注接种量10gfw/L，对照为未加诱导子的处理，每个处理均重复三次。权利要求1.一株产活性寡糖的盾叶薯蓣内生真菌，其特征是命名为镰孢菌(Fusariumsp.)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，登记入册编号为CGMCCNo.2472。2、一种按权利要求1所述的内生真菌的分离方法，通过严格的表面消毒，从植物内部分离出来的，并通过形态和分子鉴定，将ITSrDNA序列提交到GenBank数据库，获得序列号EU543260。3、一种从按权利要求1所述的内生真菌中制备寡糖。4、一种制备权利要求3中的内生真菌寡糖的方法取干燥的菌丝或菌液多糖，加入一定体积的2mol/L三氟乙酸，在密闭的容器中于85。C下水浴2.5小时(期间不断振摇)后，放入到冰水中终止反应。然后过滤掉不溶的物质。低温浓縮，去除剩余的三氟乙酸。得到的浓浆，溶解到蒸馏水中，然后用lmol/L的氢氧化钠溶液中和，在45。C旋转蒸发至干，得到菌丝或菌液寡糖。5、权利要求3中的内生真菌寡糖用于制备促进植物培养细胞的生长和提高细胞培养物中代谢产物的产率在盾叶薯蓣细胞悬浮培养一段时间后，添加一定浓度的寡糖，继续悬浮培养一段时间，能有效促进培养细胞的生长和提高薯蓣皂苷元的含量。全文摘要本发明涉及一种产活性寡糖的盾叶薯蓣内生镰孢菌。本发明所述的内生真菌Dzf17是从盾叶薯蓣中采用内生真菌分离技术分离获得的，经微生物分类鉴定为镰孢菌(Fusariumsp.)，该菌株已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，登记入册编号为CGMCCNo.2472。本发明首次从盾叶薯蓣中分离出产活性寡糖的内生真菌，并明确了内生镰孢菌Dzf17菌丝寡糖能促进宿主盾叶薯蓣培养细胞的生长，提高细胞培养物中薯蓣皂苷元的产率。文档编号C12P19/00GK101270337SQ20081011206公开日2008年9月24日申请日期2008年5月21日优先权日2008年5月21日发明者周立刚,张瑞芬,彭友良,李培琴,王蓟花,赵江林申请人:中国农业大学