一种草莓黄萎病菌孢子悬浮液的制备方法
【专利摘要】本发明公开一种草莓黄萎病菌孢子悬浮液的制备方法，所述方法包括以下步骤：采集草莓黄萎病病株，分离、纯化和筛选出草莓黄萎病的致病菌；将分离的黄萎病病菌接种到PDA培养基平板培养和活化；将含有活化的病菌的琼脂块取下，加入液体VL培养基+2.0％的蔗糖中震荡培养，经纱布过滤和滤纸抽真空过滤以去除剩余的菌丝，滤液备用；将滤液离心，弃上清，用2ml无菌水重悬沉淀，即得到草莓黄萎病菌孢子悬浮液。本发明采用液体培养基接种和培养方式，能够较快长满整个液体培养基，节省人力和物力的消耗。本发明接种量少，孢子产生的速度快、生长快，同一病菌同批次、不同批次间制备孢子量差异小，方法稳定性好。
【专利说明】
一种草莓黄萎病菌孢子悬浮液的制备方法
技术领域
[0001]本发明属于微生物技术领域，具体是一种草莓黄萎病菌孢子悬浮液的制备方法。
【背景技术】
[0002]草莓黄萎病是我国草莓种植区普遍发生的顽固性土传病害，一旦感病很难用药剂进行控制。通过连续鉴定结果表明:在我国著名的草莓之乡安徽长丰县以及江苏省重要的种植基地句容市，草莓黄萎病的病原菌主要为尖孢镰刀菌。目前，草莓品种的黄萎病的抗性鉴定一般主要采用病圃鉴定方法，但是由于病圃不同地块之间病菌浓度差异较大且经常受气候影响导致不同年份同一品种草莓黄萎病的抗性存在较大的差异，从而影响抗病性鉴定的准确性。
[0003]目前，人工接种鉴定草莓黄萎病抗病性一般主要采用固体PDA培养基培养该病原菌。待其自然产孢后，通过向长有孢子的I3DA培养基中注入3?5ml的无菌水;充分震荡后，吸取含有孢子和菌丝的悬浮液，通过滤纸过滤后得到孢子悬浮液。但是在实际的操作过程中，由于草莓黄萎病的病原一尖孢镰刀菌在固体PDA培养基上生长非常迅速且实际产孢量相对较少，且大部分为菌丝，从而导致需要制备大量固体PDA培养基以获取足够浓度的孢子悬浮液。此外，其它一些液体如查比克和YPA培养基等也普遍存在着产孢量较少，菌丝体生长过旺等特点。尤其是在需要接种数量较大的草莓群体时，需要消耗大量的人力和物力来制备固体平板培养基，另一方面也容易增加了固体培养基的污染概率。因此，如何更为有效的制备大量且具有较高浓度的草莓黄萎病菌孢子悬浮液是一个函待解决的技术问题。
【发明内容】
[0004]本发明为了克服上述现有技术所存在的不足，提供一种草莓黄萎病菌孢子悬浮液的制备方法。
[0005]本发明的目的可以通过以下技术方案实现:
[0006]—种草莓黄萎病菌孢子悬浮液的制备方法，所述方法包括以下步骤:
[0007](I)采集草莓黄萎病病株，其主要特征在于叶片存在大小叶以及叶片扭曲现象，在病样茎基部病健交界处切取1mm2的组织块，75%酒精消毒30s，无菌水漂洗3次，无菌吸水纸吸干，接种在PDA培养基上，25°C条件下培养3?4天后转接纯化，4°C甘油冷冻保存备用；
[0008](2)将分离的黄萎病病菌接种到PDA培养基平板上，黑暗条件下于24°C恒温培养6-7d;
[0009](3)将步骤(2)中活化的黄萎病菌，加入液体培养基+2.0 %的蔗糖中，于26 °C条件下恒温震荡(130rpm/min)培养6-7d，将培养液经过滤、抽真空过滤去除剩余的菌丝，滤液备用；
[0010](4)将步骤(3)滤液在10000rmp/min条件下离心30min，去上清液，用2ml无菌水重悬沉淀，即得到黄萎病菌孢子悬浮液。
[0011]所述步骤(2)PDA培养基的配方为:马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15-20g、纯水100ml，操作步骤:将马铃薯去皮，切小块，放入烧杯中，加水800ml，煮沸30min，过滤去除马铃薯残渣，向滤液中加入葡萄糖、琼脂，融化，定容至1000ml，最后溶液121°C高压蒸汽灭菌20min，冷却备用。
[0012]所述步骤(3)液体培养基的配方为:二水柠檬酸三钠2.6g、硝酸钾2.52g、磷酸二氢钱2.88g、磷酸二氢钾1.6g、七水硫酸镁0.2g、二水氯化妈溶液0.1g、微量元素溶液0.1ml、浓度为0.lmg/ml的生物素溶液0.05ml，最后加纯水定容至1000ml。
[0013]其中，微量元素溶液配方为:水95ml、一水柠檬酸5g、七水硫酸锌5g、六水水合硫酸铁钱lg、五水硫酸铜250mg、一水硫酸猛50mg、硼酸50mg、二水钼酸钠50mg。
[0014]所述步骤(3)过滤为三层脱脂纱布过滤。
[0015]本发明的有益效果:本发明采用液体培养基接种和培养方式，能够较快长满整个液体培养基，比常规中央平板接种方式产孢子量多，只需少量的液体培养基即可，节省了大量的用于培养病原菌的固体培养基，从而节省人力和物力的消耗。本发明接种量少，孢子产生的速度快、生长快，同一病菌同批次、不同批次间制备孢子量差异小，方法稳定性更好。
【具体实施方式】
[0016]实施例1
[0017]—种草莓黄萎病菌孢子悬浮液的制备方法，包括以下步骤:
[0018]1、？0六培养基的配制:
[0019]配方:去皮马铃薯:200g
[0020]葡萄糖:20g
[0021]琼脂:15_20g
[0022]纯水:1000ml
[0023]操作步骤:将马铃薯去皮，切小块，放入烧杯中，加水800ml，煮沸30min，过滤去除马铃薯残渣，向滤液中加入葡萄糖、琼脂，融化，定容至1000ml，最后溶液121°C高压蒸汽灭菌20min，冷却备用。
[0024]2、液体VL培养基的配方为:
[0025]二水柠檬酸三钠2.6g
[0026]硝酸钾2.52g
[0027]磷酸二氢铵2.88g
[0028]磷酸二氢钾1.6g
[0029]七水硫酸镁0.2g
[0030]二水氯化钙溶液0.1g
[0031]微量元素溶液0.1ml
[0032]浓度为0.lmg/ml的生物素溶液0.05ml，最后加纯水定容至1000ml。
[0033]其中，微量元素溶液配方为:水95ml、一水柠檬酸5g、七水硫酸锌5g、六水水合硫酸铁钱lg、五水硫酸铜250mg、一水硫酸猛50mg、硼酸50mg、二水钼酸钠50mg。
[0034]3、采集草莓黄萎病病株，在病样茎基部病健交界处切取1mm2的组织块，75%酒精消毒30s，无菌水漂洗3次，无菌吸水纸吸干，接种在PDA培养基上，25°C条件下培养3?4天后转接纯化，4 °C甘油冷冻保存备用；
[0035]4、将分离的黄萎病病菌接种到PDA培养基平板上，黑暗条件下于24 °C恒温培养6-7d;
[0036]5、将上述活化的黄萎病菌，加入液体培养基+2.0%的蔗糖中，于26°C条件下恒温震荡培养6-7d，将培养液经三层脱脂纱布过滤、抽真空过滤去除剩余的菌丝，滤液备用；
[0037]6将上述滤液在10000rmp/min条件下离心30min，去上清液，用2ml无菌水重悬沉淀，即得到黄萎病菌孢子悬浮液。
[0038]以上内容仅仅是对本发明所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种草莓黄萎病菌孢子悬浮液的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤: (1)采集草莓黄萎病病株，在病样茎基部病健交界处切取1mm2的组织块，75%酒精消毒30s，无菌水漂洗3次，无菌吸水纸吸干，接种在TOA培养基上，25 °C条件下培养3?4天后转接和纯化，4 °C甘油冷冻保存备用； (2)将分离的黄萎病病菌接种到TOA培养基平板上进行活化，黑暗条件下于24°C恒温培养6-7d; (3)将步骤(2)中含有活化病菌的琼脂块置于液体VL培养基+2.0%的蔗糖中，于26 °C条件下恒温震荡培养6-7d，将培养液经纱布过滤、抽真空过滤去除剩余的菌丝，滤液备用； (4)将步骤(3)滤液在10000rmp/min条件下离心30min，去上清液，用2ml无菌水重悬沉淀，即得到黄萎病菌孢子悬浮液。2.根据权利要求1所述的草莓黄萎病菌孢子悬浮液的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)PDA培养基的配方为:马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15-20g、纯水1000ml，操作步骤为:将马铃薯去皮，切小块，放入烧杯中，加水800ml，煮沸30min，过滤去除马铃薯残渣，向滤液中加入葡萄糖、琼脂，融化，定容至100ml，最后溶液121°C高压蒸汽灭菌20min，冷却备用。3.根据权利要求1所述的草莓黄萎病菌孢子悬浮液的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)液体VL培养基的配方为:二水柠檬酸三钠2.6g、硝酸钾2.52g、磷酸二氢铵2.88g、磷酸二氢钾1.6g、七水硫酸镁0.2g、二水氯化妈溶液0.lg、微量元素溶液0.1ml、浓度为0.lmg/ml的生物素溶液0.05ml，最后加纯水定容至100ml; 其中，微量元素溶液配方为:水95ml、一水柠檬酸5g、七水硫酸锌5g、六水水合硫酸铁铵lg、五水硫酸铜250mg、一水硫酸猛50mg、硼酸50mg、二水钼酸钠50mg。4.根据权利要求1所述的草莓黄萎病菌孢子悬浮液的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)过滤为三层脱脂纱布过滤，然后采用抽真空滤纸过滤以除去培养基中的菌丝。
【文档编号】C12R1/77GK105925488SQ201610321648
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年5月16日
【发明人】宁志怨, 董玲, 廖华俊
【申请人】安徽省农业科学院园艺研究所