一种卵囊藻的常温保存方法
【专利摘要】本发明涉及一种卵囊藻的常温保存方法，属于海洋微藻养殖技术领域；本方法是在培育过程中使用卵囊藻抗逆性营养盐配方，增加卵囊藻胶被多糖含量，提高卵囊藻在逆境中的生存能力；在藻细胞处于低溶氧条件下加入卵囊藻保护剂进行常温保存。本发明的方法能提高卵囊藻的机械防御、抗菌力、抗病毒、抗氧化等生存能力，使卵囊藻持续释放抗菌代谢产物抑制细菌生长，降低硫化物和光照对藻细胞的损伤，从而达到常温状况下长期保存的目的，有利于卵囊藻在市场流通，实现对虾养殖的直接投放使用。
【专利说明】
一种卵囊藻的常温保存方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种卵囊藻的保存方法，具体涉及一种卵囊藻的常温保存方法，属于海洋微藻养殖技术领域。
【背景技术】
[0002]目前，在对虾养殖过程中，虾池中的有益藻在调水控水方面主要有以下作用:1.能够增加溶氧，加速水体中还原性有害物质的氧化;2.吸收细菌分解有机物时产生的有害中间产物;3.通过吸收CO2调节酸碱度;4.吸收氨氮、亚硝氮等有害物质；5.有益藻成为优势藻种能抑制有害藻、菌的生长。但多数虾农不具备培藻技能，且养殖环境多数不具备培藻的条件。在培藻技术日益完善的今天市场仍未出现有效的微藻生态制剂产品，其中主要原因在于藻类的运输保存，而在藻类运输保存中冷藏保存的低温保存与超低温保存两种保存效果最好，但成本较高，因此微藻的常温保存技术成为微藻市场流通的关键因素。
[0003]波吉卵囊藻(Oocystisborgei)隶属于绿藻门，绿藻纲，绿球藻目，卵囊藻科，卵囊藻属，由2、4或8个椭圆形或卵形的细胞组成以群体形式生活，是湛江地区对虾高位池养殖中后期虾池中常见的优势种，其分离于对虾高位池，群体式生活，群体外有一层胶质包被，在对虾高位池中种群稳定、分布广、适应能力强，具有改善养殖水质，增强对虾抗病能力等功能的优良藻种，是实现对虾养殖生态调控防病的首选。采用卵囊藻进行生态调控可减少病害的发生、药物的使用以及药品残留所带来的二次污染。
[0004]温度过高会间接导致植物饥饿死亡，朱明等研究显示，卵囊藻随保存温度的升高成活率逐渐下降，是由于在10°C以上卵囊藻的呼吸作用大于光合作用，自身营养被消耗所致，随着保存温度的升高，卵囊藻成活率与叶绿素质量浓度降低，藻体在一定时间内不能适应较高的温度，保存过程中呼吸作用大于光合作用，导致光合作用或呼吸作用受阻，卵囊藻的成活率相对偏低。
[0005]波吉卵囊藻(Oocystisborgei)是亚热带对4下高位池养殖水体常见的优势种，对于稳定池塘生态结构，保持良好水体环境具有重要的意义。为推动卵囊藻在水产养殖业的应用，减少养殖水环境的恶化，研究常温下卵囊藻的保存效果有利于波卵囊藻的简易保存和虾类养殖的直接投人使用，以便推动水产养殖行业的微藻生态调控。
[0006]目前微藻保存的方法还没有统一的定论，且低温与超低温保存法对设备与技术的要求较高，这些问题影响了微藻产品的开发和利用。在常温下保存微藻的研究甚少，目前未曾有关于卵囊藻常温保存的研究，还未见到关于常温下保存卵囊藻的报道。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供一种卵囊藻的常温保存方法，有利于卵囊藻的市场流通，实现对虾养殖的直接投放使用。
[0008]为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为:
一种卵囊藻的常温保存方法:卵囊藻在培育过程中使用卵囊藻抗逆性营养盐配方，增厚卵囊藻胶质包被，卵囊藻胶质包被为胶化膨大的母细胞壁，为藻细胞提供机械支持，具有抗氧化、抗菌、抗病毒等功能，增强卵囊藻在逆境的生存能力，在藻细胞处于低溶氧条件下加入保护剂常温保存。
[0009]本发明所选用卵囊藻来源于广东海洋大学海洋生物研究所藻类研究室，分离自恒星863对虾高位池，经实验室驯化培养备用，通过外观和显微镜观察选取卵囊藻藻种。
[0010]所述营养盐配方为:NaNO360?100mg、k2HP04 6?10mg、FeC6H507( 1%溶液)0.18?0.22mL、NaHC03 0.3?0.8g、维生素Bi 180?220ug、维生素Bi2 0.5?1.5ug、MgS〇4.7H20 7?8mg、CaCb.2H2O 3.5?3.8mg、Citric acid 0.5?0.8mg、Ferric ammonium citrate 0.5?0.8mg、EDTANa2 0.1mg、H3B03 2.86mg、MnCl2.4H2O 1.86mg、ZnS04.7H2O 0.22mg、Na2Mo04.2H2O
0.021mg、CuS〇4.5H20 0.08mg、Co(N03)2.6H2O 0.05mg、葡萄糖6?10mg、鱼肉组织浸出液
0.02mL、消毒海水100mL，增加培养液C/N比，刺激卵囊藻胞外多糖的分泌，增厚胶质胞被，提高卵囊藻的抗逆生存能力。
[0011]所述保护剂配方为:NaNO3 30?50mg/L、k2HP04 3?5mg/L、FeC6H507(质量浓度为1%的溶液)0.ImUNaHCO3 0.20-0.30g/L、维生素Βι80?120ug/L、维生素Bi2 0.20-0.30ug/L，在低溶氧的环境下，S042—被细菌还原为H2S,其对藻细胞有强烈的毒性，FeC6H5O7生成FeS黑色沉淀，减少低氧环境下H2S的含量，并形成保护色，降低硫化物和光照对藻细胞的损伤。
[0012]所述卵囊藻低溶氧为藻液溶解氧低于lmg/L，光强300?6001ux，所述常温为30°C以下。
[0013]所述鱼肉组织浸出液的制备方法为:取新鲜小黄鱼2.5kg，洗净，用剪刀将鱼剪成三段，放入1L玻璃瓶中，加入2L蒸馏水，避光密封保存30?32天，取浸出液，用400目筛絹过滤，去除组织碎片，经100°C蒸汽灭菌30?35分钟，冷却至常温，放入磨口塞试剂瓶，密封，至于4°C冰箱保存。
[0014]本发明的有益效果是:本发明通过使用卵囊藻抗逆性营养盐配方，增厚卵囊藻群体外的胶质包被，提高卵囊藻的机械防御、抗菌、抗病毒、抗氧化等逆境的生存能力;通过添加卵囊藻保护剂，降低硫化物和光照对藻细胞的损伤，从而达到卵囊藻在常温状况下的长期保存，有利于卵囊藻的市场流通，实现对虾养殖的直接投放使用。
【具体实施方式】
[0015]下面通过实例对本发明做进一步详细说明，这些实例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。
[0016]本发明所选用卵囊藻来源于广东海洋大学海洋生物研究所藻类研究室，分离自恒星863对虾高位池，经实验室驯化培养备用，通过外观和显微镜观察选取优质卵囊藻藻种。
[0017]实施例1
一种卵囊藻的常温保存方法，卵囊藻在培育过程中通过使用卵囊藻抗逆性藻营养盐配方，增厚卵囊藻胶质包被，增强卵囊藻在逆境的生存能力，在卵囊藻处于溶解氧为lmg/L条件下，加入卵囊藻保护剂30°C以下常温保存。
[0018]制备鱼肉组织浸出液:取新鲜小黄鱼2.5kg，洗净，用剪刀将鱼剪成三段，放入1L玻璃瓶中，加入2L蒸馏水，避光密封保存30天，取浸出液，用400目筛絹过滤，去除组织碎片，经100°C蒸汽灭菌30分钟，冷却至常温，放入磨口塞试剂瓶，密封，置于4°C冰箱保存备用。
[0019]调配营养盐:NaNO360mg^k2HPO4 6mg，FeC6H5O7(1%溶液)0.18mL、NaHCO3 0.3g、维生素Bi 180ug、维生素Bi2 0.5ug、MgS04.7H2O 7mg、CaCl2.2H2O 3.5mg、Citric acid 0.5mg、Ferric ammonium citrate 0.5mg、EDTANa2 0.lmg、H3B03 2.86mg、MnCl2.4H2O 1.86mg、ZnSO4.7H20 0.22mg、Na2Mo04.2H20 0.021mg、CuS04.5H20 0.08mg、Co(N03)2.6H2O0.05mg、葡萄糖6mg、鱼肉组织浸出液0.02mL、消毒海水1000mL，增加培养液C/N比，刺激卵囊藻胞外多糖的分泌，增厚胶质包被，提高卵囊藻的抗逆生存能力。
[0020]调配保护剂:NaNO330mg/L^k2HPO4 3mg/L、FeC6H5O7(1%溶液)0.1mL^NaHCO3 0.20g/L、维生素mSOug/L、维生素B12 0.20ug/L。在低氧的环境下，S04—被细菌还原为H2S，其对藻类有强烈的毒性，FeC6H5O7生成FeS黑色沉淀，减少低氧环境下H2S的含量，并形成保护色，降低硫化物和光照对藻细胞的损伤。
[0021]实施例2
一种卵囊藻的常温保存方法，卵囊藻在培育过程中通过使用卵囊藻抗逆性藻营养盐配方，增厚卵囊藻胶质包被，增强卵囊藻在逆境的生存能力，在卵囊藻处于溶解氧为Img/L条件下，加入卵囊藻保护剂30°C以下常温保存。
[0022]制备鱼肉组织浸出液:取新鲜小黄鱼2.5kg，洗净，用剪刀将鱼剪成三段，放入10L玻璃瓶中，加入2L蒸馏水，避光密封保存32天，取浸出液，用400目筛絹过滤，去除组织碎片，经100°C蒸汽灭菌35分钟，冷却至常温，放入磨口塞试剂瓶，密封，置于4°C冰箱保存备用。
[0023]调配营养盐:NaNO310mg^k2HPO4 10mg、FeC6H507( 1%溶液)0.22mL、NaHC03 0.8g、维生素Bi 220ug、维生素B12 1.5ug、MgS04.7H20 8mg、CaCl2.2H20 3.8mg、Citric acid0.8mg、Ferric ammonium citrate 0.8mg、EDTANa2 0.1mg、H3B03 2.86mg、MnCl2.4H2OI.86mg、ZnS04.7H2O 0.22mg、Na2Mo04.2H2O 0.021mg、CuS04.5H2O 0.08mg、Co(N03)2.6H2O 0.05mg、葡萄糖1mg、鱼肉组织浸出液0.02mL、消毒海水100mL、增加培养液C/N比，刺激卵囊藻胞外多糖的分泌，增厚胶质包被，提高卵囊藻的抗逆生存能力。
[0024]调配保护剂:NaNO350mg/L^k2HPO4 5mg/L、FeC6H5O7(1%溶液)0.1mL^NaHCO3 0.30g/L、维生素Bd20ug/L、维生素B12 0.30ug/L，在低氧的环境下，S042—被细菌还原为H2S，其对藻类有强烈的毒性，FeC6H5O7生成FeS黑色沉淀，减少低氧环境下H2S的含量，并形成保护色，降低硫化物和光照对藻细胞的损伤。
[0025]实施例3
一种卵囊藻的常温保存方法，卵囊藻在培育过程中通过使用卵囊藻抗逆性藻营养盐配方，增厚卵囊藻胶质包被，增强卵囊藻在逆境的生存能力，在卵囊藻处于溶解氧为Img/L条件下，加入卵囊藻保护剂30°C以下常温保存。
[0026]制备鱼肉组织浸出液:取新鲜小黄鱼2.5kg，洗净，用剪刀将鱼剪成三段，放入10L玻璃瓶中，加入2L蒸馏水，避光密封保存30天，取浸出液，用400目筛絹过滤，去除组织碎片，经100°C蒸汽灭菌30分钟，冷却至常温，放入磨口塞试剂瓶，密封，置于4°C冰箱保存备用。
[0027]调配营养盐:NaNO380mg、k2HP04 8mg、FeC6H507( 1% 溶液)0.2mL、NaHC03 0.5g、维生素Bi 200ug、维生素Bi2 lug、MgS04.7H2O 7.5mg、CaCl2.2H2O 3.6mg、Citric acid 0.6mg、Ferric ammonium citrate 0.6mg、EDTANa2 0.1mg、H3B03 2.86mg、MnCl2.4H2O 1.86mg、ZnSO4.7H20 0.22mg,Na2MoO4.2H20 0.021mg,CuSO4.5H20 0.08mg,Co(NO3)2.6H2O0.05mg、葡萄糖8mg、鱼肉组织浸出液0.02mL、消毒海水1000mL，增加培养液C/N比，刺激卵囊藻胞外多糖的分泌，增厚胶质包被，提高卵囊藻的抗逆生存能力。
[0028]调配保护剂:NaNO340mg/L^k2HPO4 4mg/L、FeC6H5O7(1%溶液)0.1mL^NaHCO3 0.25g/L、维生素BdOOug/L、维生素B12 0.25ug/L，在低氧的环境下，S042—被细菌还原为H2S，其对藻类有强烈的毒性，FeC6H5O7生成FeS黑色沉淀，减少低氧环境下H2S的含量，并形成保护色，降低硫化物和光照对藻细胞的损伤。
[0029]实施例4
一种卵囊藻的常温保存方法，卵囊藻在培育过程中通过使用卵囊藻抗逆性藻营养盐配方，增厚卵囊藻胶质包被，增强卵囊藻在逆境的生存能力，在卵囊藻处于溶解氧为Img/L条件下，加入卵囊藻保护剂30°C以下常温保存。
[0030]制备鱼肉组织浸出液:取新鲜小黄鱼2.5kg，洗净，用剪刀将鱼剪成三段，放入1L玻璃瓶中，加入2L蒸馏水，避光密封保存31天，取浸出液，用400目筛絹过滤，去除组织碎片，经100°C蒸汽灭菌33分钟，冷却至常温，放入磨口塞试剂瓶，密封，置于4°C冰箱保存备用。
[0031]调配营养盐:NaNO370mg、k2HP04 7mg、FeC6H5O7(1%溶液)0.19mL、NaHCO3 0.4g、维生素 Bi 190ug、维生素 Bi2 0.8ug、MgS04.7H20 7.2mg、CaCl2.2H20 3.6mg、Citric acid0.7mg、Ferric ammonium citrate 0.8mg、EDTANa2 0.1mg、H3B03 2.86mg、MnCl2.4H2OI.86mg、ZnS04.7H2O 0.22mg、Na2Mo04.2H2O 0.021mg、CuS04.5H2O 0.08mg、Co(N03)2.6H2O 0.05mg、葡萄糖7mg、鱼肉组织浸出液0.02mL、消毒海水100mL，增加培养液C/N比，刺激卵囊藻胞外多糖的分泌，增厚胶质包被，提高卵囊藻的抗逆生存能力。
[0032]调配保护剂:NaNO335mg/L、k2HP04 3.5mg/L、FeC6H507( 1%溶液)0.ImUNaH⑶3
0.22g/L、维生素BdOug/L、维生素B12 0.22ug/L，在低氧的环境下，S042—被细菌还原为H2S，其对藻类有强烈的毒性，FeC6H5O7生成FeS黑色沉淀，减少低氧环境下H2S的含量，并形成保护色，降低硫化物和光照对藻细胞的损伤。
[0033]实施例5
一种卵囊藻的常温保存方法，卵囊藻在培育过程中通过使用卵囊藻抗逆性藻营养盐配方，增厚卵囊藻胶质包被，增强卵囊藻在逆境的生存能力，在卵囊藻处于溶解氧为Img/L条件下，加入卵囊藻保护剂30°C以下常温保存。
[0034]制备鱼肉组织浸出液:取新鲜小黄鱼2.5kg，洗净，用剪刀将鱼剪成三段，放入1L玻璃瓶中，加入2L蒸馏水，避光密封保存30天，取浸出液，用400目筛絹过滤，去除组织碎片，经100°C蒸汽灭菌31分钟，冷却至常温，放入磨口塞试剂瓶，密封，置于4°C冰箱保存备用。
[0035]调配营养盐:NaNO390mgΛ2ΗΡΟ4 Qmg^FeC6H5O7 (1%溶液)0.2ImUNaHCO3 0.7g、维生素Bi 210ug、维生素B12 1.2ug、MgS04.7H20 7.8mg、CaCl2.2H20 3.7mg、Citric acid
0.7mg、Ferric ammonium citrate 0.6mg、EDTANa2 0.1mg,H3BO3 2.86mg、MnCl2.4H2OI.86mg、ZnS04.7H2O 0.22mg、Na2Mo04.2H2O 0.021mg、CuS04.5H2O 0.08mg、Co(N03)2.6H2O 0.05mg、葡萄糖9mg、鱼肉组织浸出液0.02mL、消毒海水100mL，增加培养液C/N比，刺激卵囊藻胞外多糖的分泌，增厚胶质包被，提高卵囊藻的抗逆生存能力。
[0036]调配保护剂:NaNO345mg/L、k2HP04 4.5mg/L、FeC6H507( 1%溶液)0.ImUNaH⑶3
0.28g/L、维生素B1110ug/L、维生素B12 0.27ug/L，在低氧的环境下，S042—被细菌还原为H2S，其对藻类有强烈的毒性，FeC6H5O7生成FeS黑色沉淀，减少低氧环境下H2S的含量，并形成保护色，降低硫化物和光照对藻细胞的损伤。以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
【主权项】
1.一种卵囊藻的常温保存方法，其特征在于:卵囊藻在培育过程中使用卵囊藻抗逆性营养盐配方，增厚卵囊藻胶质包被，增强卵囊藻在逆境的生存能力，在藻细胞处于低溶氧条件下加入保护剂常温保存。2.根据权利要求1所述一种卵囊藻的常温保存方法，其特征在于:所述营养盐配方为:NaNO3 60?100mg、k2HP04 6?1mgJeC6H5O7 0.18?0.22mL、NaHC03 0.3?0.8g、维生素Bi 180?220ug、维生素Bi2 0.5?1.5ug、MgS04.7H20 7?8mg、CaCl2.2H20 3.5?3.8mg、Citric acid0.5?0.8mg、Ferric ammonium citrate 0.5?0.8mg、EDTANa2 0.lmg、H3B〇3 2.86mg、MnCl2.4H2O I.86mg、ZnS04.7H2O 0.22mg、Na2Mo04.2H2O 0.021mg、CuS04.5H2O 0.08mg、Co(N〇3)2.6H2O 0.05mg、葡萄糖6?10mg、鱼肉组织浸出液0.01?0.02ml、消毒海水1000mL。3.根据权利要求1所述一种卵囊藻的常温保存方法，其特征在于:所述保护剂为:NaNO330?50mg/L、k2HP04 3?SmgA^FeC6H5O7 0.1-0.2mL、NaHC03 0.20?0.30g/L、维生素Bi 80?120ug/L、维生素Bi2 0.20-0.30ug/Lo4.根据权利要求1所述一种卵囊藻的常温保存方法，其特征在于:所述藻细胞处于低溶氧为藻液溶解氧低于lmg/L，光照为300-6001UX，所述常温为小于30°C。5.根据权利要求2或3所述一种卵囊藻的常温保存方法，其特征在于:所述FeC6H5O7为质量浓度I %的溶液。6.根据权利要求2所述一种卵囊藻的常温保存方法，其特征在于:所述鱼肉组织浸出液采用的制备方法为:取新鲜小黄鱼2.5kg，洗净，用剪刀将鱼剪成三段，放入1L玻璃瓶中，加入2L蒸馏水，避光密封保存30?32天，取浸出液，用400目筛絹过滤，去除组织碎片，经100°C蒸汽灭菌30~35分钟，冷却至常温，放入磨口塞试剂瓶，密封，置于4°C冰箱保存。
【文档编号】C12N1/04GK105925484SQ201610491432
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年6月29日
【发明人】韩谦, 黄翔鹄, 李长玲, 黄永胜, 丁丹勇
【申请人】广东海洋大学