一种海洋来源小单孢菌scsio 01819、酶制剂溶液及其制备方法和应用
【技术领域】：
[0001] 本发明涉及一种利用海洋微生物生产脂肪酶制剂并利用其进行珍珠加工及制备 鱿鱼内脏水解蛋白的技术，具体涉及一种海洋来源小单孢菌SCSIO 01819、酶制剂溶液及其 制备方法和应用。
【背景技术】：
[0002] 近年来，由于养殖环境等条件的变化，我国海水珍珠只有极少数呈现银白色，品质 明显下降，养殖效益降低。漂白和染色是提升珍珠品质的有效加工手段，可创造良好经济效 益。日本于1922年首次报道了珍珠加工的技术，至今仍保持国际领先的地位（张傯，肖志 会et al. 2009)。我国于20世纪70年代就开始了珍珠加工的研宄工作，对漂白机理、漂白 剂、漂白工艺、染料等进行了深入研宄，并开发了一些珍珠加工的方法，但在实际应用中还 未达到理想效果。20世纪90年代，我国引进了日本的低温珍珠加工技术，应用后取得良好 效果。但是日本技术的前处理工艺、漂白剂、染色剂成分等内容仍然保密，我国珍珠产业未 掌握珍珠精深加工的核心技术，行业发展受到制约（沈海光，曾生1996;童银洪，邓陈茂et al. 2010)。中国科学院南海海洋研宄所经过十余年的研发工作，成功开发了海洋微生物酶 介导的珍珠漂白和染色技术，利用海洋微生物酶定向改造珍珠层内的杂蛋白，并介导活性 染料进入珍珠层深层，加工效果达到或超过了日本技术的平（张傯，龙丽娟et al. 2008)。
[0003] 珍珠层含有少量长链饱和脂肪酸、脂肪酸甘油酯、留醇等物质。这些脂溶性成分导 致了珍珠层的强疏水性，堵塞亚分子通道，不利于漂白和染色剂到达有效作用部位。传统的 前处理方法中，通过用有机溶剂、碱液浸泡和皂煮等方法进行脱脂（张小丽1997)。因珍珠 层由六边形霰石结晶与角蛋白堆积形成，结构致密，传统脱脂方法中碱性溶液和有机溶剂 不能充分和脂类接触，效果未能达到最佳。
[0004] 鱿鱼内脏的深入开发利用具有经济和环保意义。随着我国海洋捕捞业的迅速发 展，鱿鱼已成为我国重要的水产加工原料之一。鱿鱼加工处理过程中，一般有15%左右的内 脏废弃物产生。这些废弃物含有丰富的蛋白质，但极易腐烂变质，难以储存。常见的处理方 式为提取鱿鱼油后掩埋，近期也有对鱿鱼内脏进行初级加工制成鱿鱼溶浆直接用作鱼类饲 料的报道，但是未经精深加工，这种饲料生物利用率不高，还会导致水体环境的富营养化， 增加养殖动物病害爆发的机会，同时也难以长期保存。因而传统处理方式不仅经济效益低， 造成资源浪费，还会引起环境污染。因此，研宄开发鱿鱼内脏的精深加工技术，对于发掘鱿 鱼废弃物的经济价值，降低环境污染，有重要意义（王龙，2006)。
[0005] 将大分子粗蛋白酶解成小肽后用作海水养殖饲料的功能蛋白源，是鱿鱼内脏深度 开发利用的有效方式。蛋白质是动物最重要的营养物质之一。对于海水养殖动物而言，饲 料中的蛋白质不仅用于组织合成，还是重要的供能物质，蛋白的需求量远高于陆生动物。提 高水生动物对蛋白质的利用率，是促进动物营养吸收的有力措施。在饲料中使用酶解蛋白 替代粗蛋白，不仅可以降低饲料系数，还具有促进矿物质吸收、提高免疫力和降低幼苗畸形 率等功效。因此，使用生物酶技术将鱿鱼粗蛋白水解转化为水产动物更易吸收、同时具备一 定生理功能的蛋白源是一种有效的高值化利用方式。
[0006] 鱿鱼内脏的酶解方法研宄已经引起广泛重视。薛长湖、刘春娥等研宄了酶的种类、 用量、反应温度、反应时间等因素对鱿鱼内脏粗蛋白转化率的影响（刘春娥，2004);酶解鱿 鱼内脏还可生产海味素（苏鹤声，1996)。已报道的鱿鱼内脏酶解方法中，采用的酶的种类 有胰蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶以及这些酶的 混合物。张傯等发明了这一种海洋微生物酶酶解制备鱿鱼小肽的方法，在酶解过程中利用 海洋微生物生产的酶制剂，破坏对肽链水解位点有保护作用的鱿鱼蛋白的糖基侧链，可以 使鱿鱼内脏蛋白在更温和条件下水解成肽类，减少过度水解，具有很高的功能肽得率（张 傯，2011)。
【发明内容】
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[0007] 本发明的第一个目的是提供一种海洋来源的小单胞菌（Micromonospora chalcea)SCSI001819,该菌于2014年9月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普 通微生物中心（CGMCC)，保藏编号为CGMCC No. M 9737。
[0008] 本发明所述的海洋来源的小单胞菌（Micromonospora chalcea) SCSIO 01819,是 从我国南海北部（E 116° 17. 75f，N 118° 53. 71V )水深30米的海底沉积物中分离获 得的。常规PCR扩增Micromonospora chalcea SCSIO 01819的16S rDNA并测序并提交到 GenBank中，得到序列号KR052241。对16S rDNA核苷酸序列进行BLAST分析，结果显示，该 菌株与M. chalcea的相似度为99. 4%，说明该菌株SCSIO 01819为小单孢菌属（如图1所 示）。邻接法表明该菌株与一组小单孢菌属物种的系统进化关系，证明该菌属于小单孢菌属 的一种。
[0009] 形态学特征和生理生化分析：
[0010] 该菌属于革兰氏阳性，好氧放线菌，孢子球状表面光滑。菌落圆形直径1.3-2. 0_， 突起成丘。无可溶性色素产生。生长初期红色至深红色，成熟及后期变棕色和黑褐色。能 水解淀粉、纤维素、吐温20,40,60,牛奶凝固和胴化，硝酸盐还原反应阳性；H 2S产生，吐温 80水解阴性。明胶液化、接触酶和氧化酶反应阳性，黑色素产生和脲酶反应阴性。可以利 用D-纤维二糖，D-半乳糖，D-葡萄糖，D-麦芽糖，D-甘露糖，D-棉子糖，L-鼠李糖，D-核 糖，D-蔗糖，D-乳糖，D-山梨糖和和果糖为唯一碳源和能源生长，而不能利用D-木糖，松 三糖、D-海藻糖。pH、盐浓度和温度的耐受范围分别为pH 6. 0-9.0,0-5%和10-45°C，最适 生长温度25-30度，？!17-8,3%盐浓度。细胞壁含有11168〇-〇4?。优势醌为疆-10〇1 2)。6+〇 摩尔含量为68. 0(±0. 5) %。根据以上形态学、生理学、化学等分析，其与已知最接近的菌株 Micromonospora chalcea DSM 43026τ较为相似，且 16S rRNA基因序列相似性达到 99. 4%; 因此，综合分析多项分类数据，鉴定此菌株为小单孢菌属Micromonospora chalcea的一个 菌株SCSIO 01819。该菌于2014年9月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心（CGMCC)，保藏编号为CGMCC No. M 9737,地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3 号。
[0011] 本发明的海洋来源的小单胞菌（Micromonospora chalcea) SCSIO 01819能够发 酵生产具有脂肪酶及蛋白酶活性的酶制剂溶液，该酶制剂溶液可用于珍珠加工和制备鱿鱼 内脏水解蛋白。因此，本发明的第二个目的是提供海洋来源的小单胞菌（Micromonospora chalCea)SCSI001819在制备具有脂肪酶及蛋白酶活性的酶制剂溶液中的应用。
[0012] 本发明的第三个目的是提供所述的具有脂肪酶活性的酶制剂溶液，其特征在于， 是通过以下方法制备的：
[0013] 将海洋来源的小单胞菌（Micromonospora chalcea) SCSIO 01819菌种转接到菌种 活化培养基中，在28~37°C下培养12~48小时，将活化的菌液加入诱导产酶发酵培养基 的容器中，在pH = 7. 5~8. 0、温度28~37°C下培养12~96小时，当发酵液脂肪酶活力 达到1000~3000u/mL，蛋白酶活力达到1500~3000u/mL时，停止发酵，将菌液离心除去菌 体和残余培养基，上清液经超滤进一步除去残留菌体，即得到珍珠脱脂用SCSIO 01819酶 制剂溶液-1。
[0014] 所述的具有蛋白酶活性的酶制剂溶液，其特征在于，是通过以下方法制备的：
[0015] 将海洋来源的小单胞菌（Micromonospora chalcea) SCSIO 01819菌种转接到菌种 活化培养基中，在28~37°C下培养12~48小时；将活化的菌液加入诱导产酶发酵培养基 的容器中，在pH = 7. 5~8. 0、温度28~37°C下培养12~96小时，蛋白酶活力达到2500~ 3000u/mL时，停止发酵，将菌液离心除去菌体和残余培养基，上清液经超滤进一步除去残留 菌体，即得到鱿鱼内脏蛋白水解用SCSIO 01819酶制剂溶液-2。
[0016] 所述的活化培养基，优选，每IL培养基的配方为：酵母提取物4. 0g，麦芽提取物 10. 〇g，葡萄糖 4. 0g，50%陈海水 I. 0L。
[0017] 在脂肪酶活性的酶制剂溶液的制备方法中，所述的诱导产酶发酵培养基，优选，每 IL培养基的配方为：玉米粉2. 0~4. 0g，大豆粉0. 5~2. 0g，马氏珍珠贝软体部的石油醚 浸提物1. 〇~I. 5g，蔗糖0. 5~2. 0g，30~50 %陈海水1L，超滤膜的截流分子量为100~ 300KDa。所述的马氏珍珠贝软体部石油醚浸提物是干燥软体部经石油醚浸泡提取后，取提 取液减压蒸干所得的残留物。
[0018] 在具有蛋白酶活性的酶制剂溶液的制备方法中，所述的诱导产酶发酵培养基，优 选，每IL培养基的配方为：玉米粉2. 0~4. 0g，大豆粉0. 5~2. 0g，脱脂鱿鱼内脏浆2. 0~ 4.(^，蔗糖0.5~2.(^，30~50%陈海水1匕超滤膜的截流分子量为100-3001(0&。所述的 脱脂鱿鱼内脏浆是将鱿鱼内脏匀浆后，加入等体积水搅拌均匀，以石油醚或正己烷萃取三 次后，下层液体蒸发掉除去一半水分制得。
[0019] 所述的SCSIO 01819酶制剂溶液-1适宜作用pH范围在7. 5~13,最适pH为10， 适宜作用温度范围为28~37°C，最适作用温度为35°C。所述的SCSIO 01819酶制剂溶液-2 适宜作用pH范围在7. 5~13,最适pH为10,适宜作用温度范围为28~37°C，最适作用温 度为35°C。
[0020] 本发明的SCSIO 01819酶制剂溶液-1可用于珍珠加工，可以使珍珠层蛋白结构变 松散，促使酶制剂浸入珍珠层深层。气相色谱和质谱联用分析表明，珍珠层的脂类成分中 大部分为中性脂，主要以甘油三脂肪酸酯的形似存在。本发明中，珍珠层中性脂可在SCSIO 01819酶制剂溶液-1作用下水解为甘油和极性脂（游离脂肪酸），与原有极性脂一起被溶 解于碱性溶液，从而被洗脱，达到脱除珍珠层脂类的目的。与有机溶剂浸泡、皂煮精炼等传 统方法比较，本发明的方法可以更彻底地脱除中性脂，珍珠层总脂类的脱除