一种以酿酒酵母孢子为载体的新型固定化酶的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种以酿酒酵母孢子为载体的新型固定化酶的制备方法及固定化酶，其通过使用一种酿酒酵母缺陷型菌株△dit1，此菌株产生的孢子壁不含最外的二酪氨酸层，暴露在最外面的一层是壳聚糖，将酶直接固定在此缺陷型的孢子上，得到固定化酶。本发明直接通过培养酿酒酵母△dit1菌株获得大量的酿酒酵母的子囊孢子，再加以破壁纯化得到目的产品，就可以做相应的应用，而无需获得像一般固定化酶所需的载体，方法简便，易于操作，节省费用。
【专利说明】一种以酿酒酵母孢子为载体的新型固定化酶的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物【技术领域】和固定化酶技术，具体地说，本发明涉及一种以酿酒酵母孢子为载体的新型固定化酶的制备方法。
【背景技术】
[0002]酵母菌泛指能发酵糖类的一大类单细胞真菌，最典型的酵母菌是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。酿酒酵母在良好的营养和生长条件下,生长迅速，以出芽繁殖的方式进行生殖。但以醋酸盐为唯一或主要碳源，并辅以缺乏氮源等特定条件下(如只有乙酸钾存在)，酿酒酵母就会以孢子生殖的方式进行繁殖，在胞内形成孢子。此时的细胞即称为子囊，子囊经自然或人为破壁后，可释放出其中的子囊孢子。
[0003]壳聚糖是由几丁质经过脱乙酰反应得到的，其化学名称为聚葡萄糖胺(1-4)-2-氨基-β-D-葡萄糖。曾有文献报道过壳聚糖可以被用来固定化酶，这是由于壳聚糖的氨基可以被戊二醛容易激活，从而与酶结合。而酿酒酵母在以醋酸盐为唯一或主要碳源的状态下在可以产生子囊孢子·，其孢子壁由四层组成，从内到外依次为:甘露糖，葡聚糖，壳聚糖，二酪氨酸。在本发明中，我们使用一种酿酒酵母缺陷型菌株Λ ditl，此菌株产生的孢子壁不含最外的二酪氨酸层，暴露在最外面的一层是壳聚糖，我们因此可以将酶直接固定在此缺陷型的孢子上，得到孢子固定化酶。
【发明内容】
[0004]本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
[0005]鉴于上述和/或现有以酿酒酵母孢子为载体的新型固定化酶的制备方法及应用中存在的问题，提出了本发明。
[0006]因此，本发明的目的是提供一种以酿酒酵母孢子为载体的新型固定化酶的制备方法，以达到制备特定用途的固化酶的目的。
[0007]为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案:一种以酿酒酵母孢子为载体的新型固定化酶的制备方法，包括，酿酒酵母单菌落的培养，采用基因同源重组的方法敲除负责编码酿酒酵母SKl孢子壁最外层二酪氨酸层DITl基因，将得到的酿酒酵母缺陷菌株在YPAD固体培养基平板上划线，28°C?32°C培养至长出单菌落；孢子的制备，挑取单菌落到YPAD液体培养基中，摇床培养后，将菌液转接到YPAce培养基中，培养后收集细胞，转到1%?3%的醋酸钾溶液中培养，使得醋酸钾溶液中细胞的浓度为2X IOVml?4X IO7/ml，而后离心，将离心后的酿酒酵母菌体用PBS缓冲液洗涤，在36°C?38°C下用一定量的Iyticase处理0.5h?1.5h后,进行超声波破碎,得到游离状态的酿酒酵母孢子并对孢子进行纯化和冷冻干燥；酶的固定化，将半乳糖苷酶固定到酿酒酵母DITl基因缺陷型的孢子上。将经纯化的酿酒酵母Λ ditl孢子，用2%?3%的戊二醛溶液进行处理，然后洗涤酿酒酵母孢子，向酿酒酵母孢子中加入配制好的β -半乳糖苷酶溶液，在:TC?5°C下进行固定，离心，洗涤，得到固定化的β_半乳糖苷酶。
[0008]作为本发明所述以酿酒酵母孢子为载体的新型固定化酶的制备方法的一种优选方案，其中:所述酿酒酵母单菌落的培养，包括，
[0009]引物设计:依据酿酒酵母DITl基因序列设计引物如下:
[0010]上游引物Pl
[0011 ] AATTTGTTAATATCCTAATTCGGTAAAGCTTTGTCGAGACATTAACAAAACGGATCCCCGGGTTAATTAA
[0012]下游引物Ρ2
[0013]TGTTTAAGTAAAAGAACAAAAAGGTAGACCAATGTAGCGCTCTTACTTTAGAATTCGAGCTCGTTTAAAC ；
[0014]PCR扩增，利用上游引物Pl和下游引物Ρ2对质粒pFA6a_His3MX6进行PCR扩增，获得含酿酒酵母DITl基因上下游序列的敲除片段；
[0015]DITl基因的敲除，通过醋酸锂/PEG的转化方法将PCR扩增得到的his片段分别导入到酿酒酵母SKl得单倍体细胞4B和16D中，并进行筛选；
[0016]缺陷性菌株的筛选，将DITl基因的敲除后得到的转化菌株涂布到SD-His缺陷性平板上，待长出菌落后，挑取一定数目的菌落提取基因组，并进行PCR验证，以与野生型菌株的基因组进行对比，若验证.成功，再将单倍体在SD-Leu-Arg平板上融合，得到缺陷性的二倍体菌株；
[0017]验证引物如下:
[0018]上游引物:CATAAATTGTGCTCCTCCGC
[0019]下游引物:CATTGCAGTGTCTCGAAACC。
[0020]作为本发明所述以酿酒酵母孢子为载体的新型固定化酶的制备方法的一种优选方案，其中:所述酿酒酵母单菌落的培养，YPAD固体培养基的配制为酵母提取物10g，蛋白胨20g，腺嘌呤30mg，琼脂20g，定容于900mL蒸馏水中，121 °C灭菌15min后，补加IOOmL单独灭菌的20%葡萄糖。
[0021]作为本发明所述以酿酒酵母孢子为载体的新型固定化酶的制备方法的一种优选方案，其中:所述酿酒酵母孢子的制备，YPAce培养基的配制为酵母提取物10g，蛋白胨20g，腺嘌呤30mg，定容于900mL蒸馏水中，121 °C灭菌15min后，补加IOOmL单独灭菌的20%醋酸钾。
[0022]作为本发明所述以酿酒酵母孢子为载体的新型固定化酶的制备方法的一种优选方案，其中:所述对酿酒酵母孢子进行纯化，包括，配制Percoll溶液，将处理过的细胞用
0.5%Triton X-100溶液洗涤，以除去其中的裂解酶等杂质，然后将细胞悬浮在0.5%TritonX-100溶液中，配制不同梯度50%?80%不同浓度梯度的Percoll溶液；酿酒酵母孢子的纯化，将所述Percoll溶液按照从高浓度到低浓度依次加入到离心管中，最后加酿酒酵母细胞悬浮液，离心，将上层液体除去，得到纯化的酿酒酵母孢子。
[0023]本发明的另一目的是提供一种以酿酒酵母孢子为载体的新型固定化酶，以酿酒酵母孢子为载体的新型固定化酶采用本发明中的制备方法制得。
[0024]为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案:一种以酿酒酵母孢子为载体的新型固定化酶，所述新型固定化酶是将β-半乳糖苷酶固定化到不含有二酪氨酸层的酿酒酵母缺陷型孢子上。
[0025]本发明的目的是提供一种缺陷型酿酒酵母的子囊孢子，可以用来固定化酶，并且表现出较强的固定化能力，有广泛的应用前景。本发明直接通过培养酿酒酵母Λ ditl菌株获得大量的的子囊孢子，再加以破壁纯化得到目的产品，就可以做相应的应用，且无需使用常规固定化酶所需的载体，方法简便，易于操作，节省费用。
【专利附图】
【附图说明】
[0026]图1是酿酒酵母孢子对β -半乳糖苷酶的固定量示意图；
[0027]图2是固定化酶的活力测定和比较示意图。
【具体实施方式】
[0028]为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的【具体实施方式】做详细的说明。
[0029]在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
[0030]其次，此处所称的“ 一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
[0031]下面结合实施例对本发明做进一步说明，木糖异构酶来源于嗜热栖热菌的基因，根据酵母的偏好性人工合成，但不仅限于此酶。
[0032]其中，该方法采用如下步骤:
[0033]a采用基因同源重组的方法敲除负责编码酿酒酵母SKl孢子壁最外层二酪氨酸层DITl基因，将得到的酿酒酵母缺陷菌株在YPAD固体培养基平板上划线，30°C培养至长出单菌落。IL YPAD培养基的配制为酵母提取物10g，蛋白胨20g，腺嘌呤30mg，定容于900mL蒸馏水中(固体培养基需加琼脂20g)，121°C灭菌15min后，补加IOOmL单独灭菌的20%葡萄糖。
[0034]其中，酿酒酵母Aditl突变株的构建采用如下的方法进行:
[0035]I)引物设计:依据酿酒酵母DITl基因序列(GenBank)设计引物如下:
[0036]上游引物Pl
[0037]AATTTGTTAATATCCTAATTCGGTAAAGCTTTGTCGAGACATTAACAAAACGGATCCCCGGGTTAATTAA
[0038]下游引物P2
[0039]TGTTTAAGTAAAAGAACAAAAAGGTAGACCAATGTAGCGCTCTTACTTTAGAATTCGAGCTCGTTTAAAC ；
[0040]PCR扩增，利用上游引物Pl和下游引物P2对质粒pFA6a_His3MX6进行PCR扩增，获得含酿酒酵母DITl基因上下游序列的敲除片段；
[0041]DITl基因的敲除，通过醋酸锂/PEG的转化方法将PCR扩增得到的his片段分别导入到酿酒酵母SKl得单倍体细胞4B和16D中，并进行筛选；
[0042]缺陷性菌株的筛选，将DITl基因的敲除后得到的转化菌株涂布到SD-His缺陷性平板上，待长出菌落后，挑取一定数目的菌落提取基因组，并进行PCR验证，以与野生型菌株的基因组进行对比，若验证成功，再将单倍体在SD-Leu-Arg平板上融合，得到缺陷性的二倍体菌株；
[0043]验证引物如下:
[0044]上游引物:CATAAATTGTGCTCCTCCGC
[0045]下游引物:CATTGCAGTGTCTCGAAACC。
[0046]b孢子的制备:挑取步骤a得到的单菌落到YPAD液体培养基中，30°C摇床中培养24h。将菌液转接到YPAce培养基中，过夜培养后收集细胞，转到2%的醋酸钾中培养，使醋酸钾中细胞的浓度为3 X 10Vml，培养20h后，5，OOOrpm离心IOmin后，菌体用PBS缓冲液洗涤，在37°C下用Iyticase处理0.5h，超声破碎得到游离状态的孢子并对孢子进行纯化和冷冻干燥。IL YPAce液体培养基的配制为酵母提取物IOg,蛋白胨20g,腺嘌呤30mg,定容于900mL蒸馏水中，121°C灭菌15min后，补加IOOmL单独灭菌的20%醋酸钾。其中，纯化是先将处理过的细胞用0.5%Triton X-100溶液洗涤三次，以除去其中的裂解酶等杂质，然后将细胞悬浮在lmL0.5%Triton X-100溶液中。
[0047]而后配制不同梯度50%_80%不同浓度梯度的Percoll溶液:
[0048](I) 8mL Percoll, ImL0.5%Triton-X, lmL2.5M 鹿糖;
[0049](2) 7mL Percoll, 2mL0.5%Triton-X, lmL2.5M 蔗糖；
[0050](3) 6mL percoll, 3mL0.5%Triton-X, lmL2.5M 鹿糖；
[0051](4) 5mL Percoll, 4mL0.5%Triton-X, lmL2.5M 鹿糖。
[0052]将上述Percoll溶液ImL按照从高浓度到低浓度依次加入到IOmL的离心管，最后加细胞悬浮液，15，OOOg, 4°C离心Ih后，梯度溶液将会分层，纯净的孢子将会位于离心管的底部，将上层液体除去，纯化后的孢子在冷冻干燥机中冷冻干燥。
[0053]c酶的固定化，将β_半乳糖苷酶(购买于sigma公司)固定到Λ ditl的孢子上。称取一定重量的b步骤得到的经纯化的孢子于离心管中，加入2%的戊二醛溶液，放在30°C摇床中lh，然后用双蒸水洗涤孢子三次，向孢子中加入配制好的半乳糖苷酶溶液，在4°C下摇4h后，离心，洗涤，得到固定化的β -半乳糖苷酶。
[0054]实施例1:酿酒酵母孢子对β -半乳糖苷酶的固定
`[0055]如图1所示，Λ ditl菌株产生孢子后，按照前述方法纯化并冷冻干燥后，称取I?IOmg的孢子粉末于离心管中，并加入2%的戊二醛溶液，于30°C下充分震荡Ih后，移去戊二醛溶液，并用双蒸水将孢子洗涤三次，然后再加上半乳糖苷酶溶液，4°C下振荡4h，15，OOOrpm离心IOmin,上清为残余的β -半乳糖苷酶溶液,沉淀则为固定化后的孢子，同样用双蒸水将孢子洗涤三次，以除去残余的半乳糖苷酶溶液。最后取上清溶液用试剂盒测定其中的酶的含量，从而计`算出被固定到孢子壁上的酶的含量，得到的数据如下表所示。
【权利要求】
1.一种以酿酒酵母孢子为载体的新型固定化酶的制备方法，其特征在于:包括， 酿酒酵母单菌落的培养，采用基因同源重组的方法敲除负责编码酿酒酵母SKl孢子壁最外层二酪氨酸层DITl基因，将得到的酿酒酵母缺陷菌株在YPAD固体培养基平板上划线，28°C?32 °C培养至长出单菌落； 孢子的制备，挑取单菌落到YPAD液体培养基中，摇床培养后，将菌液转接到YPAce培养基中，培养后收集细胞，转到1%?3%的醋酸钾溶液中培养，使得醋酸钾溶液中细胞的浓度为2X IOVml?4X 107/ml，而后离心，将离心后的酿酒酵母菌体用PBS缓冲液洗涤，在36°C?38°C下用一定量的Iyticase处理0.5h?1.5h后,进行超声波破碎,得到游离状态的酿酒酵母孢子并对酿酒酵母孢子进行纯化和冷冻干燥； 酶的固定化，将半乳糖苷酶固定到酿酒酵母DITl基因缺陷型的孢子上。将经纯化的酿酒酵母Λ ditl孢子，用2%?3%的戊二醛溶液进行处理，然后洗涤酿酒酵母孢子，向酿酒酵母孢子中加入配制好的半乳糖苷酶溶液，在:TC?5°C下进行固定，离心，洗涤，得到固定化的β_半乳糖苷酶。
2.根据权利要求1所述的以酿酒酵母孢子为载体的新型固定化酶的制备方法，其特征在于:所述酿酒酵母单菌落的培养，包括， 引物设计:依据酿酒酵母DITl基因序列设计引物如下: 上游引物Pl
AATTTGTTAATATCCTAATTCGGTAAAGCTTTGTCGAGACATTAACAAAACGGATCCCCGGGTTAATTAA
下游引物Ρ2
TGTTTAAGTAAAAGAACAAAAAGGTAGACCAATGTAGCGCTCTTACTTTAGAATTCGAGCTCGTTTAAAC ；PCR扩增，利用上游引物Pl和下游引物Ρ2对质粒pFA6a-His3MX6进行PCR扩增，获得含酿酒酵母DITl基因上下游序列的敲除片段； DITl基因的敲除，通过醋酸锂/PEG的转化方法将PCR扩增得到的his片段分别导入到酿酒酵母SKl得单倍体细胞4B和16D中，并进行筛选； 缺陷性菌株的筛选，使用SD-His缺陷性平板进行筛选，将得到的转化菌株涂布到SD-His缺陷性平板上，待长出菌落后，挑取一定数目的菌落提取基因组，并进行PCR验证，以与野生型菌株的基因组进行对比，若验证成功，再将单倍体在SD-Leu-Arg平板上融合，得到缺陷性的二倍体菌株； 验证引物如下: 上游引物:CATAAATTGTGCTCCTCCGC 下游引物:CATTGCAGTGTCTCGAAACC。
3.根据权利要求1所述的以酿酒酵母孢子为载体的新型固定化酶的制备方法，其特征在于:所述酿酒酵母单菌落的培养，YPAD固体培养基的配制为酵母提取物10g，蛋白胨20g，腺嘌呤30mg，琼脂20g，定容于900mL蒸馏水中，121°C灭菌15min后，补加IOOmL单独灭菌的20%葡萄糖。
4.根据权利要求1所述的以酿酒酵母孢子为载体的新型固定化酶的制备方法，其特征在于:所述酿酒酵母孢子的制备，YPAce培养基的配制为酵母提取物10g，蛋白胨20g，腺嘌呤30mg，定容于900mL蒸馏水中，121°C灭菌15min后，补加IOOmL单独灭菌的20%醋酸钾。
5.根据权利要求1所述的酿酒酵母孢子的制备方法，其特征在于:所述对酿酒酵母孢子进行纯化，包括， 配制Percoll溶液，将处理过的细胞用0.5%Triton X-100溶液洗涤，以除去其中的裂解酶等杂质，然后将细胞悬浮在0.5%Triton X-100溶液中，配制不同梯度50%?80%不同浓度梯度的Percoll溶液； 酿酒酵母孢子的纯化，将所述Percoll溶液按照从高浓度到低浓度依次加入到离心管中，最后加酿酒酵母细胞悬浮液，离心，将上层液体除去，得到纯化的酿酒酵母孢子。
6.一种采用如权利要求1?5任一方法制备的以酿酒酵母孢子为载体的新型固定化酶，其特征在于:所述新型固定化酶是将β_半乳糖苷酶固定化到不含有二酪氨酸层的酿酒酵母缺陷型 孢子上。
【文档编号】C12N15/09GK103436520SQ201310422568
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年9月16日 优先权日:2013年9月16日
【发明者】中西秀树, 高晓冬, 张海妮, 李子杰 申请人:江南大学