大蒜种质资源rapd遗传多样性分析方法
【专利摘要】本发明公开了一种大蒜种质资源RAPD遗传多样性分析方法，包括提取大蒜基因组DNA、检测DNA的浓度和纯度、RAPD随机引物的筛选、PCR扩增、PCR扩增产物的电泳检测以及条带信息分析等步骤；所述方法步骤简便、试剂相对便宜、扩提取效果优，重复性好。
【专利说明】大蒜种质资源RAPD遗传多样性分析方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种筛选大蒜种质的方法，特别涉及一种利用RAPD方法筛选大蒜种质的方法。【背景技术】
[0002]中亚地区是大蒜的原产地，该地区大蒜品种多样，是最重要的大蒜进化中心[17’2°’111]。新疆地处中亚，其地产大蒜与内地省市大蒜的蒜氨酸含量差异显著[112]，新疆境内不同品种大蒜的蒜氨酸含量也有差异[113]，但根据外观性状难以区别鉴定。近年来，新疆已有种植户从异地盲目引种，导致品种退化，蒜氨酸含量明显下降，但对这些品种也无法通过外观性状进行鉴定，对大蒜栽培和育种工作造成困难，也严重威胁新疆优质大蒜的品质。因此，对新疆地产大蒜进行分子鉴定，开展遗传多样性研究，了解大蒜间的亲缘关系，区别种质的优劣非常必要。
[0003]国外学者主要采用RAPD、AFLP及同工酶标记对西欧、美洲等地的大蒜进行种质资源遗传多样性分析[55’57’114]。国内学者则主要采用RAro和ISSR及同工酶标记对大洋洲、亚洲部分国家和我国部分内地省市的大蒜进行亲缘关系和遗传特性的分析和鉴定[6°-64]。针对新疆主要栽培区的大蒜种质资源尚未开展分子水平上的研究。
[0004]作为一种基于PCR的分子标记技术，RAPD是由美国科学家Williams于1990年研究提出的[115]，具有简便、快速、多态性好等特点[116]，是一种快速灵敏的分子标记，已广泛运用于多种植物的种内和种间遗传多样性研究和种性鉴定，并表现出了很强的多态性tm-m]，也已应用于葱属品种遗传关系的分析及大蒜品种遗传多样性分析[57’60’62_64’114]。RAPD技术对反应条件比较敏感，重复性较差，许多研究表明，采用优化的反应体系可获得稳定性高、重复性好的RAPD谱带[125_127]，因此，需要筛选和确定该标记技术对于供试材料的最佳PCR反应条件和反应程序，建立具有高度重复性和稳定性的反应体系。
[0005]本实验采集新疆主要栽培区不同居群及部分内地传统种植省区的大蒜样品，采用RAH)分子标记技术进行大蒜种质资源遗传多样性研究；包括提取大蒜基因组DNA，探讨RAPD分子标记技术对于大蒜的适用性，建立和优化RAPD反应体系，获取并科学分析多态性RAro谱带，构成遗传相似系数矩阵，进行遗传多样性的聚类分析；旨在阐明新疆大蒜与内地省区大蒜以及新疆主要栽培区不同品种大蒜之间的亲缘关系，为大蒜种质资源评价提供依据，为药用大蒜优质种质的筛选奠定基础。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于解决上述现有技术的不足，提供一种利用RAPD方法分析大蒜的遗传多样性进而筛选大蒜种质的方法，所述方法步骤简便、试剂相对便宜、扩提取效果优，重复性好。
[0007]为实现上述目的，本发明采用以下技术方案:
[0008]一种利用RAPD方法分析大蒜的遗传多样性进而筛选大蒜种质的方法，包括以下具体步骤:
[0009]1、大蒜基因组DNA的提取
[0010](I)用洁净剪刀剪取大蒜嫩苗(优选离尖端约2cm)，并用蒸馏水冲洗干净，用吸水纸吸去材料表面的水分。
[0011](2)称取幼嫩叶片约0.2g，置于经液氮冷冻的研钵中，小心加入液氮，充分研磨至粉末状。
[0012](3)用经灭菌的不锈钢勺将粉末装入离心管，加65°C预热的质量浓度为2% CTAB分离缓冲液2.0ml，65°C水浴中放置30min，期间混匀3次。
[0013](4)放冷后，加入等体积氯仿-异戊醇(氯仿:异戊醇的体积比为24:1)，小心颠倒离心管2~3次,混匀，1000Or / min离心IOmin0
[0014](5)转移上清到一个新管中，并加入氯仿600 μ 1，小心颠倒离心管2~3次，混匀，10000r/min 离心 lOmin。
[0015](6)转移上清到一个新管中，并加入2倍体积无水乙醇，置于_20°C冰浴20min，1000Or / min离心IOmin,弃去上清。
[0016](7)加入体积比为75%乙醇Iml清洗沉淀，10000r / min离心5min,离心,弃去上清，再次离心，吸除剩余乙醇，室温下将DNA自然干燥lOmin。
[0017](8)加入50 μ I TE缓冲液，涡旋促进DNA溶解。
[0018](9)置于 _20°C贮存。
[0019]2、DNA浓度和纯度的检测
[0020](I)取I μ I纯化的DNA，加入ΤΕ99 μ 1，并用TE作空白对照，于核酸蛋白分析仪上测定260nm和280nm的OD值，计算0D260 / 0D280的比值。
[0021](2)称取琼脂糖2.4g加入三角瓶中，加入IXTAE电泳缓冲液160ml，放在微波炉中小心加热至全部熔化，制成1.5%琼脂糖凝胶(可以点48个样)。
[0022](3)将电泳槽放于水平支持物上，插上样品梳子，注意观察梳子齿下缘与胶槽底部保持0.5~LOcm左右。
[0023](4)等琼脂糖凝胶冷却至55°C左右，加入2~4 μ I EB0
[0024](5)将凝胶慢慢从中部倒入胶槽中，使胶液形成均匀的胶层，待胶完全凝固后，取出梳子。然后向胶槽中加入IXTAE电泳缓冲液600ml，使液面高于凝胶。
[0025](6)取DNA样品5 μ I与I μ I溴酚蓝指示剂混匀，用微量移液枪加入样品槽中。
[0026](7)加完样后，点样端接负极，电泳开始时，可用较高的电压，优选150伏特，这样可使样品很快进入胶内，而减少样品扩散，待样品进入胶内即可保持每5V / cm的电压，DNA在电泳中向正极移动,用时约40分钟(48个样)停止电泳。
[0027](8)电泳结束后，取出凝胶板，在波长为254nm的凝胶成像系统下，观察电泳图谱，凝胶照相。
[0028]3、RAPD随机弓丨物的筛选
[0029]委托英潍捷基公司合成47组10碱基随机引物，引物编号和序列列入表1。
[0030]表1引物序列信息
[0031]
【权利要求】
1.一种大蒜种质资源RAro遗传多样性分析方法，包括以下具体步骤：1)、提取大蒜基因组DNA；2)、检测DNA的浓度和纯度；3)、RAPD随机引物的筛选：以大蒜品种DNA为模板，对随机引物进行PCR扩增，凝胶成 像后，选择出有多态性条带的引物，然后以所有大蒜品种DNA为模板进行PCR扩增，凝胶成 像后，继续筛选条带清晰、不少于3条清晰条带、重复性好的引物；4)、PCR反应体系PCR 反应总体积 25 u 1，其中含模板 DNA20-80ng，引物 5_15pmol，dNTP5-15 u mol, Taq DNA聚合酶0. 2-2U，lOxPCR反应缓冲液1. 5-3. 5u 1,以重蒸馏水补充至25 u 1 ；5)、PCR扩增程序退火温度为31. 5-40. 5°C，循环次数为35-45次；6)、PCR扩增产物的电泳检测在25iU PCR反应终产物中，取5 yl样品，加溴酚蓝指示剂溶液liU混合，在1.5%琼 脂糖凝胶中电泳，电泳缓冲液为1XTAE，电泳电场强度为5V / cm，凝胶成像系统下观察拍昭.7)、条带信息分析以蒜氨酸含量高的为优质大蒜种质对照，或以蒜氨酸含量低的为非优质大蒜种质对 照，将需要筛选的大蒜种质经DNA提取、RAPD扩增获得的电泳谱图中条带与上述对照做聚 类比较，如能与优质大蒜种质聚为一类或距离较近，该种质可以判断为优质种质，随后可以 采用高效液相色谱法测定该种质蒜氨酸含量进行验证。
2.如权利要求1所述的方法，其中，3)中所述随机引物如下表所示：引物编号序列引物编号序列No. 5TG(nxaCJGAOPG19GTCAGGGCAAOPAOICAGGCCCTTCOPMI7TCACnCCGGGOPBW丁TTGCCCGGAOPOK)TCAGAGCGCCOPH17AGGGAACGAdTLF3GTTGCGATCC()PC05GAKiACCGCCTLF4AGdaCCGAicOPCG7GTCCCGACGATLF5GGCTCATGTG
3.如权利要求1所述的方法，其中，所述PCR反应体系是:PCR反应总体积25μ1，其中含模板 DNA50ng,引物 IOpmol，dNTPIO μ mol，MgCl250 μ mol，Taq DNA 聚合酶 1.5U, IOxPCR 反应缓冲液2.5 μ 1，以重蒸馏水补充至25 μ I。
4.如权利要求1所述的方法，其中，所述退火温度为31.5°C、32°C、33°C、34°C、35°C、36°C>37°C>38°C>38.9°C>39.5°C>39.7。。或 40.50C0
5.如权利要求1所述的方法，其中，所述循环次数为35个循环、40个循环或45个循环。
6.如权利要求1-5任一项所述的方法，其中，所述PCR扩增程序是:94°C预变性3min；94°C变性45s，36°C退火lmin，72°C延伸1.5min，共40个循环；72°C最终延伸7min。
【文档编号】C12Q1/68GK103484545SQ201310422230
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年9月16日 优先权日:2013年9月16日
【发明者】关明, 陈坚 申请人:新疆师范大学