一种基于单引物扩增反应的dna分子标记方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种基于单引物扩增反应的DNA分子标记方法。
【背景技术】
[0002] DNA分子标记是以个体间核苷酸序列变异为基础的遗传标记，直接在DNA水平上 检测生物个体之间的差异，能够从DNA水平直接反映生物的遗传本质，是生物个体DNA水平 上遗传变异的直接反映。它具有数量丰富、信息量大、多态性高、检测不受季节、环境和个体 发育阶段的影响、检测手段简单迅速等优点，已被广泛应用于遗传多样性分析、亲缘关系评 价、指纹图谱构建、遗传连锁图谱构建、QTL或基因定位与克隆和分子标记辅助选择育种等 领域。
[0003] 自1980年首次提出分子标记的概念以来，DNA分子标记的研宄不断有文献报道， 特别是上世纪90年代以来，发展十分迅速。目前被广泛应用的DNA分子标记技术主要 有：DNA 限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP)、 随机扩增多态性DNA(Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD)、简单序列重复间多态 性（Inter-Simple Sequence Repeats, ISSR)、扩增片段长度多态性（Amplified Fragment Length Polymorphism, AFLP)、简单重复序列（Simple Sequence Repeat, SSR)、特殊序 列扩增区（Sequence Characterized Amplified Regions, SCAR)、相关序列扩增多态 性（Sequence-Related Amplified Polymorphism, SRAP)、革El位区域扩增多态性（Target Region Amplified Polymorphism, TRAP)、目标起始密码子多态性（Start Codon Targeted Polymorphism，SCoT)和单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphisms, SNP)等 (Bostein et al.,1980 ；ffilliams et al.,1990 ；Zietkiewicz et al.,1994 ；Vos et al. , 1995 ；Tautz and Renz 1984 ；Paran and Miehelmore 1993 ；Li and Quiros 2001 ；Hu and Vick 2003 ;Collard and Mackill 2009)。按照分类的不同，上述DNA分子标记技术既 可以被分为基于分子杂交（如RFLP)和基于PCR技术这两大类分子标记技术，而基于PCR技 术上的DNA分子标记技术按照所用引物性质的不同可以分为基于随机引物扩增（如RAPD) 的分子标记技术和基于特异引物扩增（如SSR)的分子标记技术，按照所用引物数量的不 同可分为基于单引物扩增的分子标记技术和基于双引物扩增的分子标记技术（熊发前等， 2010a);也可以被分为随机DNA分子标记、目的基因分子标记和功能性分子标记（Andersen and Lilbberstedt 2003) 〇
[0004] 常规的DNA分子标记技术是使用一对引物进行PCR扩增的，而有一大类DNA分子 标记技术只使用一条单引物进行PCR扩增，也被称为基于单引物扩增反应的DNA分子标记 技术。单引物扩增反应是指在一个PCR反应中只使用一条单引物，这一条单引物同时充当 上游引物和下游引物的作用，当这一条单引物在基因组DNA上的两结合位点之间的距离不 是很远的时候，两结合位点之间的序列便可得到有效扩增。自上世纪90年代以来，越来越 多的基于单引物扩增反应的DNA分子标记技术被开发出来并得到越来越多地关注和应用， 比如RAPD(Williams J G K，Kubelik A R，LivakK J，et al. DNA Polymorphisms Amplified by Arbitrary Primers Are Usefulas Genetic Markers[J]. Nucl Acid Res. 1990， 18 :6531-6535), ISSR(Zietkiewicz et al. , 1994), ISTR(Rohde 1996), IRAP(Kalendar et al·，1999)、MP(Chang et al. ,2001)、SCoT(Collard and Mackill 2009a;熊发前 等，2009)、CDDP(Collard and Mackill 2009b;熊发前等，2010b)、iPBS(Kalendar et al·，2010)、HF〇-TAG(Levi and Wechter 2010)和 CBDP(Singh et al·，2013)。这些基于单 引物扩增反应的DNA分子标记技术的技术核心是单引物的设计。其中，RAH)技术中所使用 的单引物是完全随机设计的；ISSR技术中所使用的单引物是根据简单重复序列（SSR)来设 计的；ISTR技术和IRAP技术中所使用的单引物是根据LTR反转录转座子中的LTR序列来设 计的；IMP技术中所使用的单引物是根据MITE转座子中的TIR序列来设计的；SCoT技术中 所使用的单引物是根据植物基因中的ATG翻译起始位点侧翼序列的保守性序列来设计的； CDDP技术中所使用的单引物是根据不同物种中同时存在的保守DNA序列或蛋白质序列（如 转录因子WRKY、MYB、ERF、KNOX和开花控制MADS-BOX及生长素结合蛋白ABPl)来设计的； iPBS技术中所使用的单引物是根据LTR反转录转座子中毗邻5' LTR序列的保守性的tRNA 结合位点（Primer Binding Site, PBS)序列来设计的；HFO-TAG技术中所使用的单引物是 根据存在于大量西瓜的unigenes中的长度为8-10bp的高频率短序列来设计的；CBDP技术 中所使用的单引物是根据植物启动子中存在保守一致序列"GGCCAATCT"来设计的。总之， 自上世纪九十年代以来，DNA分子标记技术的开发及应用进展十分迅速，新的DNA分子标记 技术不断出现，基于单引物扩增反应的DNA分子标记技术也在同步涌现。一般来说，后面出 现的DNA分子标记技术大都吸收了前面的优点且克服了它们的部分不足，使之不断优化， 但现有的DNA分子标记技术缺陷仍然十分明显，存在着引物退火温度低、引物设计复杂、弓丨 物数量少、操作重复性差和趋向于扩增非功能编码区域等缺点。
[0005] 因此，开发一种引物设计简便、引物合成费用低、利用率高、引物退火温度高，操作 简单、高效、重复性好、特异性高、多态性高的新型DNA分子标记技术十分必要。目前，还没 有一种针对基因外显子区域扩增的基于单引物扩增反应的DNA分子标记技术。
【发明内容】
[0006] 本发明的发明目的在于：针对上述存在的问题，提供一种针对基因外显子区域扩 增的基于单引物扩增反应的DNA分子标记技术，弥补现有分子标记技术的不足之处。本发 明所提供的DNA分子标记方法除具有操作简单、稳定性高、重复性好、数量丰富、特异性高、 多态性高、结果可靠等优点外，因提供的单引物设计是根据真核生物基因组中的基因外显 子区域富含GC的原理来设计的，引物可以在真核生物间通用，大大减少了引物的合成费 用，也大大提高了引物的使用利用率。
[0007] 本发明采用的技术方案如下：
[0008] 一种基于单引物扩增反应的DNA分子标记方法，包括以下步骤：根据真核生物基 因组中基因外显子区域富含GC设计并合成单引物，提取样品基因组DNA作为模板，利用设 计好的单引物和所提取的样品DNA模板在常规PCR反应体系和PCR反应程序下进行PCR扩 增，扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳分离，凝胶电泳分离后检测单引物在基因组基因外显子 区域中的两个结合位点间的多态性。
[0009] 所述的单引物是指一个PCR反应中只使用一条固定引物，这一条固定引物同时充 当正向引物和反向引物的角色，该固定引物是基于真核生物基因组中基因区富含GC来设 计的，引物序列长度17bp，5'端的6个碱基填充序列为富含AT碱基的限制性内切酶酶切位 点序列，中间核心区序列是由8个GC碱基随机排列组成，这14个碱基组成核心序列，最后 3'端是3个选择性随机碱基。
[0010] 进一步地，所述单引物的序列可以为下述Mmel~Mm