引物组及其应用、利用该引物组进行棉花种质资源遗传多样性分析的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子标记技术领域，特别涉及引物组及其应用、利用该引物组进行棉 花种质资源遗传多样性分析的方法。
【背景技术】
[0002] 分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平 遗传多态性的直接的反映，能稳定遗传，可反映生物的个体和群体特征。与其它几种遗传标 记一一形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比，DNA分子标记具有的优点是:大多数分 子标记为共显性，对隐性性状的选择十分便利;基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎 是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析;分子标记揭示来自 DNA的变异;表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁;检测手段简单、迅速。 分子标记是检测种质资源遗传多样性的有效工具，分子标记技术不仅能够检测物种内的遗 传多样性，而且可以对物种间的遗传多样性进行比较。因此利用分子标记进行检测，选育出 具有外源目标性状基因、尽可能不带或少带不利基因、且遗传达到平衡的新种质，对现代作 物改良将是十分重要的。
[0003] SSR(Simple sequence repeat，简称SSR)也叫微卫星DNA，是建立在PCR基础上的 第二代分子标记。SSR标记的多态性主要依赖于基本单元重复次数的变异，而这种变异在生 物群体中是大量存在的。与其它标记相比，SSR标记数量丰富，覆盖整个基因组，揭示的多态 性高;具有复等位基因的特性，提供的信息量大，操作简便，重复性好，因此已广泛应用于、 基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。SSR在棉花基因 组中的分布是十分广泛的。SSR分子标记技术在棉花种质资源的鉴定上具有非常广阔的应 用前景。
[0004] 种质资源（germplasm)，亦称遗传资源（genetic resources)或基因资源（gene resources)，它是指一切具有一定种质或基因的生物类型的总称，棉花种质资源所有的遗 传物质均存在于各个品种之中，所以我国习惯称棉花种质资源。我国国家棉花中期库目前 已搜集整理棉花种质资源8000多份，其中陆地棉有7000多份，这些宝贵的资源材料都保存 在本所的国家中期库里。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，本发明提供一种引物组及其应用、利用该引物组进行棉花种质资源遗 传多样性分析的方法。本发明利用419份有代表性的陆地棉种质资源材料，获得了 186对条 带清晰，多态性高，扩增效果好的SSR引物，旨在为棉花种质资源鉴定，遗传多样性分析，品 种指纹图谱的构建等提供核心引物。
[0006] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0007] 本发明提供了用于陆地棉种质资源鉴定的引物组；
[0008] 所述引物组由上游引物和下游引物组成，如表1所示。
[0009] 本发明还提供了所述引物组在棉花种质资源鉴定中的应用。
[0010] 本发明还提供了所述引物组在棉花种质资源遗传多样性分析中的应用。
[0011] 本发明还提供了一种棉花种质资源遗传多样性分析的方法，包括如下步骤：
[0012]步骤1:提取获得样品的总DNA;
[0013] 步骤2:以步骤1获得的总DNA为模板，以如权利要求1所述的引物组进行扩增，电泳 检测，显色，进行多态性统计分析。
[0014] 在本发明的一些具体实施方案中，棉花种质资源遗传多样性分析的方法中所述多 态性统计分析为按〇，1进行统计，用Jaccard系数计算成对品种间遗传相似性，在遗传相似 系数基础上利用非加权平均UPGMA法对所有供试材料建立树状图，相似系数和聚类分析用 NTSYS 2.1软件完成。
[0015] 在本发明的一些具体实施方案中，棉花种质资源遗传多样性分析的方法中步骤2 中所述扩增的 10yL反应体系包括 10 X PCR(含20mM Mg2+) lyL，dNTP( 10mM)0.2yL，Taq酶 (2.5U/yL)0.2yL，去离子无菌水6. lyL，上游引物(5μΜ)0.75yL，下游引物(5μΜ)0.75yL，模板 DNA(50ngAiL)lyL。
[0016] 在本发明的一些具体实施方案中，棉花种质资源遗传多样性分析的方法中步骤2 中所述扩增的反应程序为95°C变性2min;94°C变性40s，57°C退火45s，72°C延伸60s，共30个 循环;72°C延伸7min。
[0017] 在本发明的一些具体实施方案中，棉花种质资源遗传多样性分析的方法中步骤1 中所述提取为:取棉花叶片针叶一片，放入2mL离心管中，同时装入一粒钢珠，放在液氮里冷 冻0.5h;取出离心管放入研磨仪中研磨2次，每次30S;研磨后取出钢珠，加700ul60 °C水浴预 热的提取液;60 °C水浴40-60min，每lOmin摇动离心管;取出离心管，加入等体积的氯仿-异 戊醇混合物，氯仿与异戊醇的体积比为24:1，混合；12，000g，离心10min;取上清，置于2ml离 心管，加等体积的氯仿-异戊醇混合物，氯仿与异戊醇的体积比为24:1;混合;12，000g，离心 lOmin;取上清，置于2ml离心管，加0.6倍体积的异丙醇;缓慢颠倒离心管，直至有絮状沉淀， 静置lOmin;倒去上清或钩出DNA到1.5ml的离心管中，用70%乙醇洗2~3次，无水乙醇洗一 次，真空干燥;加500uL TE溶解DNA，保存于-20°C冰箱备用。
[0018] 在本发明的一些具体实施方案中，棉花种质资源遗传多样性分析的方法中步骤2 中电泳检测为:8%的聚丙烯酰胺凝胶。具体顺序为:配制凝胶，丙烯酰胺：甲叉双丙烯酰胺 (Acr:Bis30)6.7ml，5XTBE 5ml，去离子水（(1!120)13.251111，10%厶？（10%过硫酸铵35(^1，四 甲基乙二胺(TEMED)llyl。安装好电泳槽玻璃，灌胶，待胶凝固后，拔下梳子，灌胶，电泳1个 小时。
[0019] 在本发明的一些具体实施方案中，棉花种质资源遗传多样性分析的方法中步骤2 的染色为放在乙酸和无水乙醇及纯水配制的固定液里固定7~8min，然后用硝酸银渗透液 渗透lOmin;纯水水洗两次后放在含有氢氧化钠、甲醛的显色液里显色，直到胶出现棕色带 为止，最后放在含有无水碳酸钠溶液中终止。把染好的胶放在观片灯上照相，按有带记为1， 无带记为0进行统计。
[0020] 本发明公开了186对棉花核心SSR引物，平均分配在24条染色体上，这些引物多态 性好，条带清晰，可以直接用于棉花品种资源的鉴定，遗传多样性分析，杂交品种的纯度鉴 定，遗传图谱的构建等。省去了通常的实验过程中SSR引物的筛选过程，提高了实验效率。
[0021] 本发明利用186对SSR核心引物鉴定陆地棉种质资源的方法，实验操作简单，结果 好，能有效地区别不同来源背景的种质资源材料，是一种值得推崇的种质资源鉴定的方法。
【附图说明】
[0022] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0023] 图1示24个代表材料对引物NAU3899(靠近M)和NAU4064(远离M)的筛选结果;其中， 泳道Μ示Marker，泳道1~24分别是材料:冀棉8号，宝山大桃，中棉所12号，无极一枝花，南丹 巴地大花，中棉所16号，秦荔514,苏远04-3,军棉1号，鲁原343,中棉所17号，宿棉9108,乍得 3号，非洲棉E-40,澳SiV2,稀絮H10,中棉所81，辽阳多毛棉，岱字棉15号，Ari3697，TM-l，渝 棉1 号，J02-247,中078;
[0024] 图2示引物NAU1042对419个材料中的1~96号（材料名称见表3)的扩增图；从左至 右依次为泳道M、泳道1~96;其中，泳道Μ示Marker，大小依次为:50bp，100bp，150bp，200bp， 250bp，300bp，350bp400bp，500bp;泳道 1 ~96 分别示 1 ~96 号材料；
[0025] 图3示引物NAU1042对419个材料中的97~192号（材料名称见表3)的扩增图；从左 至右依次