四对黄绿卷毛菌核基因引物的设计、扩增与测序方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及真菌系统发育、谱系地理学技术领域，尤其设及四对黄绿卷毛菌核基 因（EF1 - a、RPB1、RPB2、Mcm7 )引物的设计、扩增与测序方法。
【背景技术】
[0002] 黄绿卷毛菌（Floccularia Iuteo virens)隶属于伞菌目（Agaricales) 口磨科 (化icholomataceae)，是一种主要分布在青藏高原的产子实体的外生菌根真菌。由于其子 实体色泽嫩黄、口味鲜美、营养丰富，长久W来一直被作为青藏高原特色美食、有着较高的 经济价值。但是，近年来随着子实体贸易的不断升溫，黄绿蜜环菌资源正面临过度采伐的危 险，同时，其分类地位也一直存在着争议。因此很有必要利用分子标记研究该菌遗传多样性 及系统发育学问题。
[0003] RNA聚合酶(RNA polymerases)在基因表达的过程中扮演着很重要的角色。目前， 在真核生物中成功地分离出巧中RNA聚合酶。其中，RNA聚合酶II由12个亚基组成（RPB1-RPB12)dRNA聚合酶II大亚基(RPBl)是决定真核生物信使RNA(mRNA)转录起始和延伸的最主 要的功能亚基，存在多种翻译后修饰。负责转录生成hnRNA和mRNA的RPB2(The second largest RNA polymerase subunit) 基因负责编码 RNA 聚合酶 II 的第2 大亚基，具有单拷贝和进 化速率慢的特点。而EFl-a是真核生物细胞内第二大蛋白，在蛋白质合成延伸过程中起重要 作用，其具有高度的种间保守性，适合进行系统发育研究。Mcm7是微小染色体维持蛋白7的 缩写，它有着适宜的进化速率也是真菌系统发育学与谱系地理学研究的有效工具。目前，上 述基因由于通用引物具有良好的扩增性能，因而广泛应用于真菌系统发育与系统发育学W 及谱系地理学研究当中。
[0004] 然而，在研究黄绿卷毛菌遗传多样性与谱系地理学过程中，利用上述基因的通用 引物扩增该菌相应基因，却得不到扩增结果或者扩增出多条非特异性条带。因此，虽然上述 基因有诸多有优势，但其在黄绿卷毛菌的研究上却表现出了局限性，限制了利用上述基因 对于黄绿卷毛菌的相关研究。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种简便易行的四对黄绿卷毛菌核基因引物 的设计、扩增与测序方法。
[0006] 为解决上述问题，本发明所述的四对黄绿卷毛菌核基因引物的设计、扩增与测序 方法，包括W下步骤： (1)分别采用与6。1-〇、1?^1、1?^2、1畑17基因相匹配的通用引物对黄绿卷毛菌进行扩增， 分别得到EFl-a、RPBl、RPB2、Mcm7基因的扩增片段； 间分别对所述6。1-〇、3口81、1?口82、1(31117基因的扩增片段做胶检测，割取目的条带，经 SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒纯化回收后进行测序，分别得到521bp的EFl-a、751bp的 RPBl、782bp的RPB2、688 bp的Mcm7基因片段； 间除去所述步骤间所得的6。1-〇、3?81、1??82、1(31117基因片段两头各30 69序列，在线设 计引物选取得分最高的一对引物，其中： EF1 -a引物的上游引物EF-9F有18个碱基AGCACGCTCTCCTTGCTT，其下游引物EF-9R有21 个碱基 AGCACGCTCTCCTTGCTT; RPB1引物的上游引物RPB1-FF1有2 2个碱基AAACTCCCTTGGGGATCTAAT，其下游引物RPB1 -FRl 有 20 个碱基 TCAGGAAATCTTCGCCACG; RPB2引物的上游引物RPB2-61F1有22个碱基TGGAAGAATGGGGTTTGGAGT，其下游引物 RPB2-61R1 有 20 个碱基 TGGTCCGGGAAAGGTATAAT; Mcm7引物的上游引物MClF有21个碱基TGCAAACTCGTGCATGTAGGT，其下游引物MC3R有20 个碱基 TCCTCATGGCCATATATCTCA; (4)用不同地理分布来源的黄绿卷毛菌菌株扩增测序验证所述步骤间中引物的专一性 即可。
[0007] 所述步骤(1)与EFl-a基因相匹配的通用引物是指EF-983F与EF-1567R。
[000引所述步骤(1)与RPBl基因相匹配的通用引物是指RPBl-Ff与RPBl-G么。
[0009] 所述步骤(1)与RPB2基因相匹配的通用引物是指RPB2-6F与RPB2-7.1R。
[0010] 所述步骤(1)与Mcm7基因相匹配的通用引物是指Mcm7-709fo;r与Mcm7-1447rev。
[0011] 本发明与现有技术相比具有W下优点： 1、本发明所得到的引物有着优异的扩增性能，50~6(TC溫度梯度试验均能扩增出明亮、 唯一的产物条带(参见图1)，有利于后续研究大规模应用该引物进行扩增。
[0012] 2、应用本发明所得到的引物扩增片段对50个不同地理分布的黄绿卷毛菌菌株进 行扩增，均能够得到特异性产物，说明该引物具有良好的个体间的通用性。
[0013] 3、应用本发明所得到的引物扩增片段对50个不同地理分布的黄绿卷毛菌菌株进 行测序均获得了理想的结果，说明该引物具有良好的测序性能。
[0014] 4、本发明简便易行。
【附图说明】
[0015] 下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详吸的说明。
[0016] 图1为本发明各片段50~60°C溫度梯度做胶检测结果。
【具体实施方式】
[0017] 四对黄绿卷毛菌核基因引物的设计、扩增与测序方法，包括W下步骤： (1)分别采用与6。1-〇、1?^1、1?^2、1畑17基因相匹配的通用引物对黄绿卷毛菌进行扩增， 分别得到6。1-〇、1?^1、1?^2、]^1117基因的扩增片段。
[001引 其中； ①采用通用引物983F与1567R对黄绿卷毛菌进行扩增，得到EFl-a基因的扩增片段。
[0019] 扩增 PCR 反应体系：25 化内含 dd 此 0 19.3 yL，10XBuffer(+Mg2+)2.5 yL，dNTP (lOmM)0.5 jiL，983F(10mM)0.5 jiL，1567R(10 mM)0.5 JiLJaq polymerase(抓/化）0.5 化， 0.2 化 DNA模板（15 ng)1.5 化。
[0020] 扩增条件:95°C预变性5 min,然后94°C变性30 S，53°C退火50 S，72°C延伸55 S， 共34个循环，最后72°C延伸10 min。
[0021] ②采用通用引物RPBl-Ff与RPB1-G2r对黄绿卷毛菌进行扩增，得到RPBl、基因的扩 增片段。
[0022] 扩增PCR反应体系：25 化内含dd此0 19.3 yL，10XBuffer(+Mg2+)2.5 yL，dNTP (10mM)0.5 yL，RPBl-Ff(10 mM)0.5 化，RPB1-G2r(10 mM)0.5 化，Taq polymerase(抓/化） 0.5 化，0.2 化 DNA模板（15 ng)1.5 化。
[0023] 扩增条件:95°C预变性5 min,然后94°C变性30 s，53°C退火45 s，72°C延伸50 S， 共34个循环，最后72°C延伸10 min。
[0024] ③采用通用引物RPB2-6F与RPB2-7.1R对黄绿卷毛菌进行扩增，得到RPB2基因的扩 增片段。
[0025] 扩增PCR反应体系：25化内含dd出0 19.化L，10XBuffer(+Mg2+)2.5化，dNTP(10 mM)0.5 jiL，RPB2-6F(10 mM)0.5 jiL，RPB2-7.1R(10 mM)0.5 JiLJaq polymerase(抓/化） 0.5 化，0.2 化 DNA模板（15 ng)1.5 化。
[0026] 扩增条件:95°C预变性5 min,然后94°C变性30 S，53°C退火50 S，72°C延伸55 S， 共34个循环，最后72°C延伸10 min。
[0027] ④采用通用引物Mcm7-709fo;r与Mcm7-1447rev对黄绿卷毛菌进行扩增，得到Mcm7 基因的扩增片段。
[002引扩增PCR反应体系：25 化内含dd此0 19.3 yL，10XBuffer(+Mg2+)2.5 yL，dNTP (10 mM)0.5 yL，Mcm7-709for(10 mM)0.5 yL，Mcm7-1447rev(10 mM)0.5 yL'Taq polymerase巧U/]iL)0.5 化，0.2 化 DNA模板（15 ng)1.5 化。
[0029] 扩增条件:95°C预变性5 min,然后94°C变性30 s，53°C退火50 s，72°C延伸55 s， 共34个循环，最后72°C延伸10 min。
[0030] 间分别对EFl-a、RPB1、RPB2、Mcm7基因的扩增片段做胶检测，割取目的条带，经 SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒纯化回收后进行测序，分别得到521bp的EFl-a、751bp的 RPBl、782bp的RPB2、688 bp的Mcm7基因片段。
[0031 ] 具体步骤如下： i扩增获得片段通过琼脂糖凝胶电泳尽可能将目的DNA片段与其它片段分开，用干净的 手术刀片将含目的DNA片段的琼脂糖凝胶块切下，放入1.5 ml离屯、管中，称重。
[0032] ii根据胶块的重量和浓度，按每100 mg琼脂糖(如胶块不足100 mg则用水补充至 100 mg)加300~600 yL的比例加入Buffer B2。
[0033] 化将离屯、管置于50°C水浴5~10 min,间或混匀，直至胶块完全溶化。
[0034] iv加入所使用的Buffer B2体积1/3的异丙醇，混匀。
[0035] V将溶化好的溶液全部移入吸附柱，8000 X g离屯、30 S。倒掉收集管中的液体， 将吸附柱放入同一个收集管中。
[0036] Vi向吸附柱中加入500化Wash Solution，9000 X g离屯、30 S。倒掉收集管中的液 体，将吸附柱放入同一个收集管中。
[0037] 油重复步骤Vi-次。
[003引 Vi将空吸附柱和收集管放入离屯、机，9000 X g离屯、1 min。
[0039] k在吸附膜中央加入15~40化Elution Buffer,室溫静置1-2 min，9000 X g离 屯、I min。将所得到的DNA溶液置于-20°C保存。
[0040] 间除去步骤间所得的6。1-〇、3?81、1?^2、1(31117基因片段两头各30 69序列，在线设 计引物化ttp:// www.yeastgenome.org/cgi-bin/web-primer参数为默认参数）选取得分 最高的一对引物，其中： EF1 -a引物的上游引物EF-9F有18个碱基AGCACGCTCTCCTTGCTT，其下游引物EF-9R有21 个碱基 AGCACGCTCTCCTTGCTT。
[0041 ] RPBl引物的上游引物RPBl-FFl有22个碱基AAACTCCCTTGGGGATCTAAT，其下游引物 RPBl-FRl 有 20 个碱基 TCAGGAAATCTTCGCCACG。
[0042] RPB2引物的上游引物RPB2-61F1有22个碱基TGGAAGAATGGGGTTTGGAGT，其下游引物 RPB2-61R1 有 20 个碱基 TGGTCCGGGAAAGGTATAAT。
[0043] Mcm7引物的上游引物MC1F有21个碱基TGCAAACTCGTGCATGTAGGT，其下游引物MC3R 有 20 个碱基 TCCTCATGGCCATATATCTCA。
[0044] (4)用50个不同地理分布来源的黄绿卷毛菌菌株(运些菌株来自青藏高原西藏、青 海、四川涵盖了卷毛蜜环菌分布的大部分区域。）扩增测序验证步骤间中引物的专一性即可 (参见表1)。
[0045] 表1绿卷毛菌菌株地理分布
具体验证过程如下： iEFl-a 引物： 扩增 PCR反应体系为 25 化内含 dd也 0 19.3 化，10XBuffer(+Mg2+)2.化L，dNTP(10 mM)0.5]iL，EF-9F(10 mM)0.5]iL，EF-9R(10 mM)0.5]iL，Taq polymerase巧U/]iL)，0.扣L DNA 模板(15 ng)l.f5]iL。
[0046] 扩增条件:95°C预变性5 min,然后94°C变性30 s，5rC退火45 s，72°C延伸50 s， 共35个循环，最后72°C延伸10 min。
[0047] 测序共获得375~376 bp长度的序列。
[0048] ii RPBl 引物： 扩增PCR反应体系为25化内含dd也0 19.化L，10XBuffer(+Mg2+)2.扣L，dNTP(10mM) 0.f5]iL，RPBl-FFl(10 mM)0.5]iL，RPBl-FRl(10 mM)0.5]iL，Taq polymerase(抓/化），0.5化 DNA模板（15 ng)I.。
[0049] 扩增条件为:95°C预变性5min，然后94°C变性30s，5rC退火45s，72°C延伸45s，共 35个循环，最后72°C延伸10 min。
[00加]扩增获得427~427 bp的片段 iiiRPB2 引物： 扩增 PCR反应体系为 25 化内含 d 地 2〇 19.化L，10XBuffer(+Mg2+)2.5^，dNTP(10 mM)，0.扣L RPB2-61F(10 mM)0.5化，RPB2-61R(10mM)0.5化，Taq polymerase(抓/jiL)，0.5ii L DNA模板（15 ng)l.
[0051 ] 扩增条件为:95°C预变性5min，然后94°C变性30s，5rC退火50s，72°C延伸50s，共 35个循环，最后72°C延伸10 min。
[0化2] 测序共获得559~560 bp长度的序列。
[0化；3] ivMcm7 引物： 扩增PCR反应体系为25化内含d地20 19.化L，10XBuffer(+Mg2+)2.化L，dNTP(10 mM)0.5化，MClFdO mM)0.5化，MC3R(10 mM)0.5化，Taq polymerase(抓/化），0.5化 DNA模 板（15 ng)l.^iL。
[0054] 扩增条件为：95°C预变性5 min,然后94°C变性30 S，53°C退火45 S，72°C延伸50 S，共35个循环，最后72°C延伸10 min。
[0化日]测序共获得393~395 bp长度的序列。
【主权项】
1. 四对黄绿卷毛菌核基因引物的设计、扩增与测序方法，包括以下步骤： ⑴分别采用与EFl-α、RPBl、RPB2、MCm7基因相匹配的通用引物对黄绿卷毛菌进行扩增， 分别得到EFl-a、RPBl、RPB2、Mcm7基因的扩增片段； ⑵分别对所述EF1 - a、RPB1、RPB2、Mcm7基因的扩增片段做胶检测，割取目的条带，经 SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒纯化回收后进行测序，分别得到521bp的EFl-a、751bp的 RPBl、782bp的RPB2、688 bp的Mcm7基因片段； (3)除去所述步骤⑵所得的EFl-a、RPBl、RI?2、MCm7基因片段两头各30bp序列，在线设 计引物选取得分最高的一对引物，其中： EF 1 -a引物的上游引物EF-9F有18个碱基AGCACGCTCTCCTTGCTT，其下游引物EF-9R有21 个碱基 AGCACGCTCTCCTTGCTT; RPB 1引物的上游引物RPB 1-FF1有2 2个碱基AAACTCCCTTGGGGATCTAAT，其下游引物RPB 1 -FR1 有 20 个碱基 TCAGGAAATCTTCGCCACG; RPB2引物的上游引物RPB2-61F1有22个碱基TGGAAGAATGGGGTTTGGAGT，其下游引物 RPB2-61R1 有 20 个碱基 TGGTCCGGGAAAGGTATAAT; Mcm7引物的上游引物MC1F有21个碱基TGCAAACTCGTGCATGTAGGT，其下游引物MC3R有20 个碱基 TCCTCATGGCCATATATCTCA; ⑷用不同地理分布来源的黄绿卷毛菌菌株扩增测序验证所述步骤⑶中引物的专一性 即可。2. 如权利要求1所述的四对黄绿卷毛菌核基因引物的设计、扩增与测序方法，其特征在 于:所述步骤⑴与EF1-a基因相匹配的通用引物是指EF-983F与EF-1567R。3. 如权利要求1所述的四对黄绿卷毛菌核基因引物的设计、扩增与测序方法，其特征在 于:所述步骤⑴与RPB1基因相匹配的通用引物是指RPBl-Ff与RPB1-G2 r。4. 如权利要求1所述的四对黄绿卷毛菌核基因引物的设计、扩增与测序方法，其特征在 于:所述步骤⑴与RPB2基因相匹配的通用引物是指RPB2-6F与RPB2-7.1R。5. 如权利要求1所述的四对黄绿卷毛菌核基因引物的设计、扩增与测序方法，其特征在 于:所述步骤⑴与Mcm7基因相匹配的通用引物是指Mcm7_709f or与Mcm7_1447rev〇
【专利摘要】本发明涉及一种四对黄绿卷毛菌核基因引物的设计、扩增与测序方法，该方法包括以下步骤：⑴分别采用与<i>EF1</i><i>–</i>α、<i>RPB1</i>、<i>RPB2</i>、<i>Mcm7</i>基因相匹配的通用引物对黄绿卷毛菌进行扩增，分别得到<i>EF1</i><i>–</i>α、<i>RPB1</i>、<i>RPB2</i>、<i>Mcm7</i>基因的扩增片段；⑵分别对所述<i>EF1</i><i>–</i>α、<i>RPB1</i>、<i>RPB2</i>、<i>Mcm7</i>基因的扩增片段做胶检测，割取目的条带，经SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒纯化回收后进行测序，分别得到521bp的<i>EF1</i><i>–</i>α、751bp的<i>RPB1</i>、782bp的<i>RPB2</i>、688bp的<i>Mcm7</i>基因片段；⑶除去所述步骤⑵所得的<i>EF1</i><i>–</i>α、<i>RPB1</i>、<i>RPB2</i>、<i>Mcm7</i>基因片段两头各30bp序列，在线设计引物选取得分最高的一对引物；⑷用不同地理分布来源的黄绿卷毛菌菌株扩增测序验证所述步骤⑶中引物的专一性即可。本发明简便易行，所得引物有着优异的扩增性能。
【IPC分类】C12Q1/04, C12R1/645, C12Q1/68
【公开号】CN105713980
【申请号】CN201610226253
【发明人】邢睿, 高庆波, 张发起, 陈世龙
【申请人】中国科学院西北高原生物研究所