专利名称：Dna分子、扩增该dna分子的引物组、包含该引物组的试剂盒及其使用方法
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，尤其涉及DNA分子、扩增该DNA分子的引物组、包含该引物组的试剂盒及其使用方法。
背景技术：
宫颈癌是全球妇女中仅次于乳腺癌和结直肠癌的第3个常见的恶性肿瘤，在发展中国家是仅次于乳腺癌居第2位常见的恶性肿瘤，是最常见的女性生殖道恶性肿瘤。2008年全球新发宫颈癌病例52.98万，死亡病例25.51万人，其中85%新发病例在发展中国家。
宫颈癌的临床症状的轻重与病情早晚有关，宫颈上皮内瘤变及镜下早期浸润癌一般无症状，多在普查中发现。Ib期和以后各期最早出现的症状主要有阴道出血和阴道排液。若癌瘤侵犯盆腔结缔组织，压迫膀胱、直肠和坐骨神经以及影响淋巴和静脉回流时，可出现尿频、尿急、肛门坠胀、便秘、下腹痛、坐骨神经痛、下肢肿痛等。癌瘤压迫或侵犯输尿管，可出现肾盂积水、尿毒症。终末期因长期消耗常出现恶液质。
宫颈癌提早发现和治疗就会有好的效果。一期的宫颈癌五年的生存率可以达到93%，二期大约为80%，但如果到了三期和四期，特别是四期就只有20%左右了。一期或者二期的患者可以做手术，可到了三期后只能采用放疗或放化疗，一期做手术患者可以有90%的治愈率，有些甚至达到98%。可见，宫颈癌的早期治疗有赖于早期诊断。但是，早期子宫颈癌往往无症状，体征也不明显，确诊需进行三阶梯诊断。第一步，宫颈细胞学检查，即阴道脱落细胞涂片检查，这是目前筛选和早期发现宫颈癌的主要方法。第二步进行阴道镜检查，对宫颈刮片细胞学可疑或阳性而肉眼未见明显癌灶者，阴道镜可将病变放大6 40倍，在强光源下直接观察宫颈上皮及血管的细微形态变化。第三步是宫颈和颈管活组织检查，这是确诊宫颈癌前病变和宫颈癌的最可靠和不可缺少的方法，当宫颈刮片细胞学检查可疑或阳性而活检为阴性时，应搔刮宫颈管送检，如宫颈刮片发现腺癌细胞，应行分段诊刮术，以明确腺癌是来自子宫内膜还是宫颈管。可见，现有的临床诊断依赖传统的病理切片上形态学的改变。宫颈癌在出现典型症状和体征后，一般已为浸润癌。而早期宫颈癌往往与正常组织难以区分，体征也不明显，给临床诊断造成很大困难。因此，急需研究应用于宫颈癌早期的新诊断方法。 发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种DNA分子、扩增该DNA分子的引物组、包含该引物组的试剂盒及其使用方法，本发明提供的DNA分子为人类DDXll的突变基因。本发明提供的引物组，可用于扩增包括突变点的片段，根据对扩增产物的测序结果可判断待测样品是否携带突变，从而预测患者是否有患宫颈癌的风险，实现宫颈癌的早期诊断。
本发明提供的DNA分子为在Genbank登录号为NM_004399的核苷酸序列的第1102位核苷酸和第2183位核苷酸发生突变，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1、SEQ ID N0:2或SEQID NO:3 所示。Genbank登录号为NM_004399的核苷酸序列，为正常人类DDXlI的基因序列。DDXll是人体内的一种解旋酶，英文名称为:Homo sapiens DEAD/H(Asp-Glu-Ala-Asp/His)boxhelicasell，简称DDX11。本发明通过对宫颈癌标本进行全基因组外显子测序，并利用癌旁组织作为对照，发现宫颈癌标本中DDXll基因发生突变。宫颈癌标本中的DDXll基因发生突变的位点有两个，第1102位核苷酸由G突变为A，第2183位核苷酸由G突变为A。核苷酸的突变会使密码子发生变化，但是由于密码子存在简并性，并非所有核苷酸的突变都是非同义突变，而本发明提供的DNA分子核苷酸序列中的两个位点的突变皆为非同义突变，导致了氨基酸序列的变化。其中第1102位核苷酸的突变，使氨基酸序列中相应氨基酸由脯氨酸突变为丝氨酸；第2183位核苷酸的突变，使氨基酸序列中相应氨基酸由精氨酸突变为组氨酸。本发明提供的DNA分子中，如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的DNA分子为Genbank登录号为NM_004399的核苷酸序列中第1102位核苷酸由G突变为A得到的序列JnSEQ IDNO:2所示核苷酸序列的DNA分子为Genbank登录号为NM_004399的核苷酸序列中第2183位核苷酸由G突变为A得到的序列JnSEQ ID NO: 2所示核苷酸序列的DNA分子为Genbank登录号为NM_004399的核苷酸序列中第1102位核苷酸由G突变为A且第2183位核苷酸由G突变为A得到的序列。这两个位点中任一位点发生突变，都有可能增加患宫颈癌的风险。因此，本发明提供了本发明提供的DNA分子在宫颈癌诊断中的应用。本发明提供了扩增本发明提供的DNA分子的引物组，由具有SEQ ID NO:4所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO:5所示核苷酸序列的下游引物组成。本发明还提供了具有SEQ ID NO:4所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO:5所示核苷酸序列的下游 引物的引物组在检测Genbank登录号为NM_004399的核苷酸序列的第1102位核苷酸突变中的应用。本发明提供了扩增本发明提供的DNA分子的引物组，由具有SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO:7所示核苷酸序列的下游引物组成。本发明还提供了具有SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO:7所示核苷酸序列的下游引物的引物组在检测Genbank登录号为NM_004399的核苷酸序列的第2183位核苷酸突变中的应用。采用本发明提供的引物组，通过PCR的方式，可扩增得到包括突变点的片段，根据对扩增产物的测序结果可判断待测样品是否携带突变，从而预测患者是否有患宫颈癌的风险，实现宫颈癌的早期诊断。由于组织细胞形态学的改变是由于基因突变所致，本发明提供的引物用于宫颈癌的早期诊断与传统技术相比，具有更高的灵敏度和更高的准确度。本发明提供了一种试剂盒，其中包括:第一引物组和第二引物组；其中，第一引物组中上游引物具有SEQ ID NO:2所示核苷酸序列，下游引物具有SEQ ID NO: 3所示核苷酸序列；第二引物组中上游引物具有SEQ ID NO:4所示核苷酸序列，下游引物具有SEQ IDNO: 5所示核苷酸序列。作为优选，本发明提供的试剂盒中还包括Taq酶。
本发明提供的试剂盒的使用方法包括如下步骤:
步骤1:提取宫颈组织全基因组DNA ；
步骤2:以宫颈组织全基因组DNA为模板，以第一引物组扩增获得第一扩增产物，以第二引物组为引物扩增获得第二扩增产物，第一、第二扩增产物为Genbank登录号为NM_004399的核苷酸序列中的片段；
步骤3:取第一、二扩增产物经测序分析，第一扩增产物中Genbank登录号为NM_004399的核苷酸序列第1102位核苷酸为A和/或第二扩增产物中Genbank登录号为NM_004399的核苷酸序列第2183位核苷酸为A，则携带突变；第一扩增产物中Genbank登录号为NM_004399的核苷酸序列第1102位核苷酸为G，且第二扩增产物中Genbank登录号为NM_004399的核苷酸序列第2183位核苷酸为G，则不携带突变。
由于Genbank登录号为NM_004399的核苷酸序列中第1102位和第2183位上的两个突变点中任一位点发生突变，都有可能增加患宫颈癌的风险。因此，本发明提供了本发明提供的DNA分子在宫颈癌诊断中的应用。
本发明提供的试剂盒的使用方法中，提取宫颈癌标本全基因组DNA、扩增、测序步骤皆可采用现有技术中的常规方法。
其中扩增的程序为:
权利要求
1.一种DNA分子，其特征在于，为在Genbank登录号为NM_004399的核苷酸序列的第1102位核苷酸和第2183位核苷酸发生突变，其核苷酸序列如SEQ ID NOiUSEQ ID N0:2或SEQ ID NO:3 所示。
2.如权利要求1所述的DNA分子在宫颈癌诊断中的应用。
3.—种扩增如权利要求1所述DNA分子的引物对，其特征在于，由具有SEQ ID N0:4所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO:5所示核苷酸序列的下游引物组成。
4.如权利要求3所述的引物对在检测Genbank登录号为NM_004399的核苷酸序列的第1102位核苷酸突变中的应用。
5.—种扩增如权利要求1所述DNA分子的引物对，其特征在于，由具有SEQ ID N0:6所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO:7所示核苷酸序列的下游引物组成。
6.如权利要求5所述的引物对在检测Genbank登录号为NM_004399的核苷酸序列的第2183位核苷酸突变中的应用。
7.一种试剂盒，其特征在于，包括:第一引物对和第二引物对； 其中，第一引物组中上游引物具有SEQ ID NO:4所示核苷酸序列，下游引物具有SEQ IDNO:5所示核苷酸序列； 第二引物组中上游引物具有SEQ ID NO:6所示核苷酸序列，下游引物具有SEQ ID NO:7所示核苷酸序列 。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，还包括Taq酶。
9.如权利要求7或8所述试剂盒的使用方法，其特征在于，包括如下步骤: 步骤1:提取宫颈组织全基因组DNA ； 步骤2:以宫颈组织全基因组DNA为模板，以所述第一引物组扩增获得第一扩增产物，以所述第二引物组为引物扩增获得第二扩增产物，所述第一、第二扩增产物为Genbank登录号为NM_004399的核苷酸序列中的片段； 步骤3:取第一、二扩增产物经测序分析，所述第一扩增产物中Genbank登录号为NM_004399的核苷酸序列第1102位核苷酸为A和/或所述第二扩增产物中Genbank登录号为NM_004399的核苷酸序列第2183位核苷酸为A，则携带突变；所述第一扩增产物中Genbank登录号为NM_004399的核苷酸序列第1102位核苷酸为G，且所述第二扩增产物中Genbank登录号为NM_004399的核苷酸序列第2183位核苷酸为G，则不携带突变。
全文摘要
本发明涉及医药技术领域，尤其涉及DNA分子、扩增该DNA分子的引物组、包含该引物组的试剂盒及其使用方法。本发明提供的DNA分子为人类DDX11的突变基因。采用本发明提供的引物组，通过PCR的方式，可扩增得到包括突变点的片段，根据对扩增产物的测序结果可判断待测样品是否携带突变，从而预测患者是否有患宫颈癌的风险，实现宫颈癌的早期诊断。本发明提供的试剂盒包含本发明提供的引物组，可用于检测样品是否携带人类DDX11上的突变位点。由于组织细胞形态学的改变是由于基因突变所致，本发明提供的引物用于宫颈癌的早期诊断与传统技术相比，具有更高的灵敏度和更高的准确度。
文档编号C12N15/55GK103243113SQ20131018592
公开日2013年8月14日 申请日期2013年5月20日 优先权日2013年5月20日
发明者宋耀华, 杨舒婷, 王家俊 申请人:苏州大学