鸡mtDNA D-loop区全序列扩增及测序方法和专用引物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种鸡mtDNA D-loop全序列扩增及其 测序方法。
【背景技术】
[0002] 动物遗传资源多样性能够为品种改良提供素材，并且能够很好适应环境的变化。 我国有丰富家禽地方品种资源，研究和评估我国家禽地方品种的遗传多样性，制定合理的 利用和保护措施对我国畜牧业的可持续发展具有重要意义。研究动物遗传多样性的方法主 要有微卫星和线粒体DNA等，两种方法各有优缺点，线粒体DNA更容易操作。畜（禽）品种 大都受到外来公畜（禽）杂交改良的影响，群体数量减少甚至消失，给研究品种起源和多样 性带来很大困难。线粒体DNA在遗传过程中，遗传物质通过卵细胞质传递，较少发生DNA重 组，其野生祖先的线粒体DNA类型一般能得以保持。这种遗传方式，一个个体就能代表一个 母性集团，因此只需少量个体样本便能反映一个群体的遗传结构。研究者可以从复杂的遗 传背景中分辨不连续的母系血统，即使经过几千年的杂交繁育，系统关系依然明晰。
[0003] 鸡线粒体基因组一般在16785bp左右，为闭合环状双链结构，能够自主复制和转 录。包括37个基因的编码编码区（13个蛋白质编码基因、2个核糖体RNA基因、22个转运 RNA基因）和1个控制区（D-loop)。D-loop区为mtDNA上最重要的非编码区，进化速率较 编码区更快，是适合亲缘关系较近的群体进行遗传分化研究的理想分子标记。D-l 〇〇p区部 分或者全部序列已经广泛地应用于动物类群的遗传多样和系统进化研究中。国内外虽然已 经有人用D-loop区高变区进行鸡遗传多样性和亲缘进化的研究，但是全序列包含的遗传 信息更为丰富，目前还没有运用D-loop区全序列对我国家禽地方品种进行系统的研究，因 此建立mtDNA D-loop区全序列扩增和测序方法是十分必要的。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提出一种鸡mtDNA D-loop区全序列的扩增及测序方法和专用 引物，本发明速度快、成本低、易于掌握，能够有效检测出鸡的mtDNA D-loop区全序列。
[0005] 本发明提供了一种鸡mtDNA D-loop区全序列扩增及测序用引物，包括PCR引物 和测序引物，所述PCR引物的上游引物：5' -AAACACCCAAACTCACTAAC-3'，PCR引物的下游引 物：5'-CACTGGGATGCGGATACTTGC-3'；
[0006]所述测序引物：5' -GCAACCCCTGCCTGTAAT-3'。
[0007] 本发明还提供了一种鸡mtDNA D-loop区全序列扩增及测序方法，包括以下步骤：
[0008] (1)提取鸡羽毛中的DNA，并检测质量。
[0009] (2)根据红色原鸡mtDNA D-loop区在mtDNA全基因组序列上的相对位置，在mtDNA D-loop区上下游保守区域设计一对PCR引物，PCR引物引物序列为：
[0010] Forward prime(SEQ ID NO. 1):5'-AAACACCCAAACTCACTAAC-3,
[0011] Reverse primer(SEQ ID NO. 2):5'-CACTGGGATGCGGATACTTGC-3'
[0012] (3) PCR产物测序与序列拼接
[0013] 通过PCR反应，获得目的片段，纯化后送测序公司测序，由于mtDNA D-l〇〇p区下游 结构复杂，反向引物无法测出，根据正向引物已测出的mtDNA D-l〇〇p区序列设计一条测序 引物，进行引物步移（Primer walking)测序，然后将正向引物和步移引物测得两条序列进 行拼接，获得mtDNA D-loop区全序列。
[0014] 测序引物 Walking primer(SEQ ID N0. 3)为 5'-GCAACCCCTGCCTGTAAT-3'。
[0015] 步骤1中鸡羽毛中DNA的提取步骤为：羽毛样采集雏鸡或者成鸡换羽后刚长出的 羽毛，一般为2-3根，用剪刀剪掉羽根上部的绒羽，在干净的PE手套上剪碎后，放入2mL离 心管中，每个样品加入裂解液1000 y L及蛋白酶K 40 y L摇匀，放摇床内59°C水浴消化。消 化充分后，加700-800uL饱和酚，摇匀10min后以转速lOOOOrpm离心5min。吸取上清液放 入2mL离心管中，加1000uL饱和酸，摇勾5min后以转速lOOOOrpm离心5min。吸取上清液 放入2mL离心管中，加氯仿1000uL，摇勾5min后以转速lOOOOrpm离心5min。吸取上清液放 入2mL离心管中，加无水乙醇沉淀出DNA团块，留下DNA倒掉乙醇，再把DNA团块用70%的 酒精洗一遍，以转速l〇〇〇〇rpm离心10min。倒掉乙醇，留下DNA，凉干（lh)，加灭菌水100uL 溶解，放_2〇°C冰箱保存。
[0016] 步骤 3 中 PCR 反应体系为：PCR Mix 25 1^，1〇4111〇1/1引物各1.5 1^，模板2 1^， 灭菌水20 y L。
[0017] 步骤 3 中 PCR 反应程序为：95°C 5min，（95°C 30s，55°C 30s，72°C 60s)30 循环， 72°C 4min〇
[0018] 步骤3中所述mtDNA D-loop区拼接方法为将测序得到的序列经DNAStar 5. 02软 件的SeqMan程序拼接。拼接序列与GenBank中红色原鸡参考序列NC_007235进行比对，剪 掉引物及多余的序列。
[0019] 上述的方法，所述PCR扩增特异性条带为1635bp，包含mtDNA D-loop区全序列及 上下游部分序列，其核苷酸序列为：（大写字母表示上游和下游序列，黑色下划线表示上下 游引物位置，阴影部分表示步移引物位置）：
[0020]
[0045] 。
[0046] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0047] 1、本发明的检测方法具有速度快、成本低、易掌握等优点，能够有效检测出鸡的 mtDNA D-l〇〇p区全序列，从而为鸡分子遗传学及分子系统进化学研究提供有效的研究平 台；
[0048] 2、提供了一种节约成本、简便易行的扩增鸡mtDNA D-loop区全序列的方法。本发 明提供的鸡mtDNA D-l〇〇p区全序列可应用于鸡遗传资源多样性评估、母系起源、系统进化 分析和种质资源鉴定与保护等多个领域；
[0049] 3、本发明采用羽毛采集，替代传统的血液采样，减小了对实验动物的伤害，并且能 获得高质量的DNA模板。
【具体实施方式】
[0050] -种鸡mtDNA D-l〇〇p区全序列扩增及测序用引物，包括PCR引物和测序引物。
[0051] PCR 引物的上游引物：5' -AAACACCCAAACTCACTAAC-3'，
[0052] PCR 引物的下游引物：5' -CACTGGGATGCGGATACTTGC-3'。
[0053]测序引物：5'-GCAACCCCTGCCTGTAAT-3'。
[0054] -种鸡mtDNA D-l〇〇p区全序列扩增及测序方法，包括以下步骤：
[0055] (1)提取鸡羽毛中的DNA，并检测质量；
[0056] (2)在鸡mtDNA D-loop区上下游保守区域设计一对PCR引物，通过PCR反应 扩增包含Cytb基因的片段，经琼脂糖电泳条带单一、亮度高；所述PCR引物的上游引物 为：5'-AAACACCCAAACTCACTAAC-3'，PCR 引物的下游引物：5'-CACTGGGATGCGGATACTTGC-3' ；
[0057] (3)设计测序引物对所述PCR产物进行测序，所述测序引物为： 5'-GCAACCCCTGCCTGTAAT-3'；
[0058] (4)对测序获得序列进行拼接，并剪掉上下游多余的序列，获得鸡mtDNA D-loop 区全序列，mtDNA D-loop区全序列全长为1231_1232bp。
[0059] 用于扩增鸡mtDNA D-loop区全序列的PCR反应体系为：PCR Mix 25 yL，10 y mol/ LPCR引物的上、下游引物各1. 5 y L，模板2 y L，灭菌水20 y L。
[0060] 用于扩增鸡mtDNA D-loop区全序列的PCR反应程序为：95°C 5min ;95°C 30s， 55°〇3〇8,721€6〇8,30个循环；721€4111111。
[0061] 羽毛样采集雏鸡或者成鸡换羽后刚长出的羽毛2-3根，剪掉羽根上部的绒羽，剪 碎后的羽毛放入2mL离心管中，每个羽毛样品加入裂解液1000 y L及蛋白酶K 40 y L摇匀， 放摇床内59 °C水浴消化；
[0062] 消化充分后，加700-800uL饱和酚，摇匀10min后以转速lOOOOrpm离心5min ;
[0063] 吸取上清液放入2mL离心管中，加1000uL饱和酸，摇勾5min后以转速lOOOOrpm 离心5min ;
[0064] 吸取上清液放入2mL离心管中，加氯仿1000uL，摇匀5min后以转速lOOOOrpm离心 5min ；
[0065] 吸取上清液放入2mL离心管中，加无水乙醇沉淀出DNA团块，留下DNA倒掉乙醇， 再把DNA团块用70%的酒精洗一遍，以转速lOOOOrpm离心10min ;倒掉乙醇，留下DNA，凉 干lh，加灭菌水100uL溶解，于-20°C保存。
[0066] mtDNA D-loop拼接方法为：将测序得到的序列用DNAStar 5. 02软件的SeqMan程 序拼接，拼接序列与GenBank中红色原鸡参考序列NC_007235进行比对，剪掉引物及多余的 序列。
[0067] 实施例1藏鸡系统进化及遗传多样性的研究
[0068] 1.1DNA样本制备
[0069] 采集30只藏鸡颈部换羽后刚长出的羽毛，公母各半，随机取样。用剪刀剪掉羽根 上部的绒羽，在干净的PE手套上剪碎后，放入2mL离心管中，每个样品加入裂解液1000 y L 及蛋白酶K 40 y L摇匀，放摇床内59°C水浴消化。消化充分后，加700-800uL饱和酚，摇匀 10min后以转速lOOOOrpm离心5min。吸取上清液放入2mL离心管中，加1000uL饱和酚，摇 勾5min后以转速lOOOOrpm离心5min。吸取上清液放入2mL离心管中，加氯仿1000uL，摇勾 5min后以转速lOOOOrpm离心5min。吸取上清液放入2mL离心管中，加无水乙醇沉淀出DNA 团块，留下DNA倒掉乙醇，再把DNA团块用70 %的酒精洗一遍，以转速lOOOOrpm离10min。 倒掉乙醇，留下DNA，凉干（lh)，加灭菌水100uL溶解，放-20°C冰箱保存。
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