用于检测2型糖尿病视网膜病变的miR-3197分子标记物及其扩增引物和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种miRNA分子标记物，尤其是涉及一种用于检测2型糖尿病视网膜病 变的miR-3197分子标记物及其扩增引物和应用。
【背景技术】
[0002] 2型糖尿病(Type 2 diabetes mellituS，T2DM)又名非胰岛素依赖性糖尿病，是糖 尿病最主要的类型，约占90%(23499527)。是一组以慢性高血糖为特征的多因素代谢异常综 合征，它是全球性主要致死、致残及耗费巨大的疾病之一。糖尿病性视网膜病变(Diabetic retinopathy, DR)作为糖尿病最严重的微血管并发症之一，已成为糖尿病患者致盲的首位 原因，目前全球DR患者约9300万（22301125)。我国糖尿病患者9240万，居全球第一 位，其中DR患病率为37%(20335585)。且随着糖尿病发病率的增加和人均寿命的延长， DR的患病率正不断增加，提示未来DR将是视力丧失和视功能损害的主要原因。糖尿病视网 膜病变诊断的金标准是眼底荧光血管造影，但其是侵入性检测，具有创伤性，并且价格昂 贵，费时。因此，寻找一些生物标记物预测或警示DR的发生，对降低其致盲率有着重要的意 义。
[0003] 目前，已有研究表明循环miRNAs是一类具有潜在临床诊断价值的新型生物标志 物。但目前，国内外还没有公开任何关于利用miRNA分子作为检测2型糖尿病视网膜病变预 测或诊断的分子标记物来检测2型糖尿病视网膜病变的相关研究报道。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是提供一种用于检测2型糖尿病视网膜病变的miR-3197 分子标记物及其扩增引物和应用 ，其中循环 miR-3197 表达水平与 2 型糖尿病性视网膜 病变患病率呈正相关，检测效率高，针对性强。
[0005] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为:一种用于检测2型糖尿病视网膜 病变的miR-3197分子标记物，所述的miRNA分子标记物为miR-3197分子标志物，分子标记物 miR-3197基因片段的核苷酸序列为5'GGAGGCGCAGGCUCGGAAAGGCG-3'。
[0006] 上述miR-3197分子标志物的正向扩增引物的核苷酸序列为5'-GGA GGC GCA GGC TCG GAA -3'，其反向扩增引物为通用引物。
[0007] -种用于检测2型糖尿病视网膜病变的试剂盒，该试剂盒包括扩增上述miR-3197 基因片段的正向扩增引物:5'-GGA GGC GCA GGC TCG GAA -3'以及cel-miR-39内参基因的 正向扩增引物的核苷酸序列为:5 ' -CGTGAGTCGATCCATATTGTA-3 '。
[0008] -种利用上述miR-3197分子标记物检测2型糖尿病视网膜病变的检测方法，步骤 如下： a、 总RNA的提取； b、 采用miScript? II RT Kit试剂盒对miRNA进行反转录； c、 PCR扩增:利用7500real_time PCR system仪器进行，加入cel-miR-39作为内参基 因，25ul扩增体系：12 · 5ulSYBR Green混合液，2 · 5ul通用引物，2 · 5ul特异性引物，2ulcDNA 溶液和5.5ul无 RNA酶水;扩增反应条件:初始激活在95°C，15分钟；94 °C 15 s，55 °C 30 s，70 °C 30 s，共40次循环;反应完成后进行熔解曲线分析;其中引物溶液包括扩增miR-3197基因片段的正向扩增引物:5'-GGA GGC GCA GGC TCG GAA -3'以及cel-miR-39内参基 因的正向扩增引物，其核苷酸序列为:5 ' -CGTGAGTCGATCCATATTGTA-3 '，反向引物为通用引 物;各引物浓度均为l〇pmol/ul; d、 鉴定:扩增完成后，利用方法分析基因表达量，若miR-3197基因片段高水平表 达，且表达倍数高于1.7则认为处于糖尿病视网膜病变发病早期。
[0009] 与现有技术相比，本发明的优点在于:本发明首次公开了用于检测2型糖尿病视网 膜病变的miR-3197分子标记物及其扩增引物和应用，其中分子标记物为miR-3197分子标志 物、内参基因为cel-miR-39以及扩増miR-3197、cel-miR-39的正向引物;检测方法为总RNA 的提取、cDNA合成、PCR扩增和鉴定，鉴定快速、简便、特异和有效。循环miR-3197表达水平增 加会导致糖尿病视网膜病变发生，与糖尿病视网膜病变发病率呈正相关。该标记物的发掘 和应用可以方便快捷地在分子水平上实现对2型糖尿病视网膜病变的检测，检测效率高，针 对性强，同时，以循环miR-3197表达水平为靶点的药物有望成为2型糖尿病视网膜病变辅助 诊断、检测和筛选的一种新手段。
【附图说明】
[0010] 图1为循环miR-3197在DR与T2DM的表达水平差异性图； 图2是PCR扩增获得的miR-3197基因片段的R0C曲线图。
【具体实施方式】
[0011] 以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。 具体实施例
[0012] 1、研究对象的收集 本研究所有样本都是在单位医学研究伦理道德委员会批准和患者知情同意情况下收 集，其中健康组血清样本144例、糖尿病前期组血清样本70例、T2DM血清样本117例及DR血清 样本75例。收集要求:①诊断均经眼底荧光血管造影检查证实，DR经证实有微血管瘤，出血， 硬性渗出，棉絮状软性渗出等症状;健康组、糖尿病前期组、T2DM组经证实双眼散瞳检查眼 底正常。均排除①急、慢性感染性疾病;②严重心、脑、肝功能损害及影响糖代谢的其它内分 泌疾病;③单眼或双眼屈光介质明显浑浊，影响眼底观察者。
[0013] 2、运用基因芯片在5例糖尿病前期、5例健康人、5例T2DM及5例DR(根据年龄、性别、 BMI及病史(>10年)严格配对)血清样本中筛选出有差异明显、可能与DR发展密切相关的循 环miRNAs〇
[0014] 根据芯片检测技术，结果显示循环111丨1?-3197、111丨1?-2116-5?、111丨1?-3939及111丨1?-1910-3p在DR与T2DM组中表达差异显著。各分子标记物基因片段的核苷酸序列如下：分子标记物 miR-3197的核苷酸序列为5 ' -GGAGGCGCAGGCUCGGAAAGGCG-3 ' ； miR-2116-5P的核苷酸序列为:5 ' -GGUUCUUAGCAUAGGAG⑶CU-3 ' ； miR-3939的核苷酸序列为：5 ' -UACGCGCAGACCACAGGAUGUC-3 ' ； miR-1910-3p的核苷酸序列为:5 ' -GAGGCAGAAGCAGGAUGACA-3 ' ； 3、通过根据年龄、性别、BMI及病史（>10年）进行匹配，最后配对出45例DR血清和45例 T2DM血清样本，并进一步扩大样本验证。
[0015] 4、应用miRNeasy Serum/Plasma Kit(Qiagen)试剂盒提取样本的血清miRNA，再通 过分光光度测定仪检测所得miRNA的浓度，以供循环miR-3197、miR-2116-5P、miR-3939及 miR-1910-3p荧光定量PCR检测。
[0016] 5、RT_PCR 检测