一种用于鱼类线粒体全基因组扩增的引物、试剂盒及扩增方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一组可用于鱼类线粒体全基因组序列 研究的引物，用于序列扩增试剂盒、测序、检测DNA单个碱基突变的方法。
【背景技术】
[0002] 线粒体是细胞内的能量转换器，拥有独立于核基因组序列的线粒体基因组。不同 于核基因组，线粒体基因组具有多个特征：
[0003] (1)分子较小，且存在长度多态性，不同于基因组序列，线粒体基因组的序列由于 串联重复序列的存在而大小不。
[0004] (2)编码效率高，由于没内含子的存在，线粒体基因组序列短，但包含大量基因。
[0005] (3)拷贝数多，每个细胞中含有不少于1000个线粒体基因组。
[0006] (4)遗传和复制相对独立性，几乎不受细胞核的控制。
[0007] (5)高突变率，由于线粒体数量的大量变化，线粒体DNA几乎在整个细胞的生存过 程中都在复制，这导致了线粒体DNA上出现了大量的变异碱基，且这些突变不会危及到细胞 的生存，突变碱基会保留下来。
[0008] (6)同质性与异质性，每个个体细胞中的线粒体基因组DNA序列存在原始序列和突 变序列，并且存在一定分配比例。
[0009] (7)母系遗传，有性繁殖的个体中仅卵细胞存在大量线粒体，精子几乎不含有线粒 体，因此一个个体的线粒体基因全部来自母本。这些特征为科技工作者研究生物的生存、进 化、物种迀徙等提供了有利条件。
[0010] 鱼类线粒体基因组为环状双链DNA，在细胞中存在成千上万的拷贝，尤其在生长状 态较好的细胞中大量存在，线粒体DNA的数量在一定程度上反映了细胞的生活状态。研究表 明鱼类线粒体的DNA非常保守，物种间的差异较小。鱼类线粒体基因组非常小，约为15-20Kb 之间，仅占整个个体全部基因信息（核基因组和线粒体基因组）的1%。鱼类线粒体基因组主 要包括37个编码基因（13个蛋白基因，2个核糖体RNA(rRNA)基因，22个转运RNA(tRNA)编码 基因，2个转录和复制起始区域。基因编码的蛋白包括了与线粒体内膜相结合的酶复合体的 亚单位:细胞色素、ATP合成酶的亚基、细胞色素氧化酶的亚基以及氢化辅酶I脱氢酶的亚 基。
[0011]由于线粒体DNA缺少蛋白保护，加上高复制效率，缺乏校对机制等，导致线粒体DNA的序列变异效率高，而个体的异质性（突变DNA和原始DNA的比例）和线粒体序列的多态性 (长度多态性，单个碱基位点多态性)可作为一个物种的分子标记，借此进行类群识别、物种 起源进化、鱼种迀徙等研究。目前为止，进行线粒体基因组多态性研究的方法包括：
[0012] (1)直接测序；
[0013] (2)内切酶图谱；
[0014] (3)扩增长度多态性；
[0015] (4)探针杂交法等。
[0016] 随着测序技术的发展及测序费用的降低，直接测序方法已经越来越方便快捷，目 前，鱼类线粒体基因组主要通过设计通用引物，进而获得鱼类线粒体DNA的全序列。因此引 物设计的好坏直接决定了实验的成败，因此开发一个简便、通用的鱼类线粒体基因组测序 的方法具有重要的实用价值。
【发明内容】
[0017] 本发明提供一组通用的鱼类线粒体基因组扩增、测序的引物，同时提供进行鱼类 线粒体DNA进行扩增的方法。
[0018] 本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
[0019]进行鱼类线粒体DNA序列比对时发现，部分序列存在极大的保守性，在几乎所有已 知物种的线粒体DNA序列中，这些序列均存在，而鱼类的线粒体DNA是环状的，可以通过使用 2-3对引物即可以完成线粒体序列的克隆，因此在进行了大量线粒体DNA序列分析后，根据 最保守的12个区域设计了 6对引物，这六对引物可以完成一个物种的全部线粒体序列的扩 增和测序工作。具体如下：
[0020] -种用于鱼类线粒体全基因组扩增的引物，所述引物为以下1~6对引物中的一对 或多对：
[0021 ] 用于鱼类线粒体全基因组扩增的第1对正向引物为5'-TTANACATGCAAGTNTCCGC- 3 '，反向引物为5 '-ACTGACCTGGATTNCTCCGG-3 '；
[0022] 用于鱼类线粒体全基因组扩增的第2对正向引物为5'-GACGAGAAGACCCTTTGGAG-3 '，反向引物为5 '-GAGGGTGCCAATGTCTTTATG-3 '；
[0023] 用于鱼类线粒体全基因组扩增的第3对正向引物为δ'-ΑΟΟ?Χ?π^ΑΤ?ΧΤΑεΑΑΑα^-β'，反向 引物为 5 '-ATGGGCTTGGGTCAACTATG-3 '；
[0024] 用于鱼类线粒体全基因组扩增的第4对正向引物为5 ' -GGAATACGAAATCAACCAACAA-3 '，反向引物为5 '-TTTGGGTCGGAGTGTATGTATC-3 '；
[0025] 用于鱼类线粒体全基因组扩增的第5对正向引物为5'-(：1'(：11^6了60六六阶〇^六6-3'， 反向引物为5 ' -GCGGANCTTGCATGTNTAA-3 ' ；
[0026]用于鱼类线粒体全基因组扩增的第6对正向引物为5 ' -GTGAACTATTACTGGCATCTGGT-3 '，反向引物为5 '-TTACGGCTAAGCATAGTGGG-3 '。
[0027] -种用于鱼类线粒体全基因组扩增的试剂盒，所述试剂盒含有上述的1对或多对 引物。
[0028] -种鱼类线粒体全基因组扩增方法，采用权利要求1所述的引物，以鱼类线粒体 DNA为模板，进行PCR扩增。
[0029] 进一步，所述PCR扩增时，各引物对的退火温度为52~56°C。
[0030] 本发明优势在于：
[0031] 可以进行任何鱼类物种的线粒体DNA的测序，而且对模板的要求不是特别严格，效 率高、准确率高。本发明的目的是提高扩增准确性和效率，减少鱼类线粒体DNA序列测序时 大量消耗的引物设计和优化时间，提高引物通用性，提高扩增产物的准确性，提供一种可用 于全部鱼类线粒体全基因组序列扩增和测序的引物对。
【附图说明】
[0032]图1是采用本发明6对引物扩增日本縫躕线粒体基因组得到的电泳图，1-6分别为 1-6号引物扩增结果，Μ为DNA标准marker;
[0033]图2是采用本发明6对引物扩增、测序拼接得到的日本縫躕全线粒体基因组基因图 谱。
【具体实施方式】
[0034]下面结合附图及实施例对本发明作进一步详细的说明。
[0035]鱼类线粒体DNA基因组的高复制率和高突变性，其可作为一个研究物种差异和资 源分布和调查的分子标记。线粒体DNA全基因组的扩增很大程度上依赖引物设计的优良与 否。本发明开发出一种用6对引物多重PCR扩增出鱼类线粒体DNA全基因组序列的测序系统， 以解决上述问题。本发明合成了能够扩增出鱼类线粒体全基因组碱基的6对高特异性PCR引 物。本发明涉及的这6对PCR引物，