一种检测Dubin-Johnson综合症的ABCC2基因的试剂盒及其检测方法
【技术领域】
[0001 ]本发明属于试剂盒领域，特别涉及一种检测Dubin-Johnson综合症的ABCC2基因的 试剂盒及其检测方法。
【背景技术】
[0002] Dubin-Johnson综合征(DJS)是一种少见的以慢性持续性或间歇性黄疸为临床特 点的常染色体隐性遗传病，以结合胆红素增高为主的先天性非溶血性黄疸。由Dubin和 Johnson于1954年首先报道，常见于青少年和幼年。复合耐药相关蛋白2MRP2(编码基因 ABCC2)，是ATP依赖的有机阴离子的重要转运体，如二葡萄糖苷酸胆红素、硫酸盐、还原型谷 胱甘肽等的转运，是非胆汁酸盐依赖性胆汁流形成的重要因素。由于毛细胆管上位于10q24 的多特异性有机阴离子转运蛋白（cMOAT)的基因（ABCC2/MRP2超家族)缺陷，导致毛细胆管 对有机阴离子尤其是两性化合物如二葡萄糖苷酸胆红素转运异常，肝细胞先天性胆红素排 泌障碍，对非水溶性有机阴离子的排泄也有缺陷，但对胆盐的排泌正常，导致DJS。
[0003] 本病较罕见，以多见于男性。Dubin-Johnson4000例肝脏活体组织检查中有12例 (0.3%)，美国肝病登记8000例有23例(0.29%)，国内也有本病的报导，发病率亦不高。本综 合征的临床表现大致有三种类型：第一种是临床无任何自觉症状，常因其它疾病就诊而被 发现，此类少见。第二种是长期黄疸反复发作，食欲不振、疲乏无力，肝区不适，恶心甚至呕 吐，尿色加深，酷似病毒性肝炎。此类最常见。第三种是持续黄疸不退，尿色深黄，但胃肠症 状不明显，可应付日常工作。DJS常见于青少年，因为该疾病症状轻微，医生或患者对该疾病 认识不足不予重视，导致患者长期误诊。
[0004] ABCC2基因位于染色体10q24,为45kb，包括32个外显子，不同的种族存在不同的 MRP2/ABCC2基因突变类型。ABCC2基因在1066密码子突变，使4个跨膜区和整个第2个三磷酸 腺苷结合位点缺失，从而丧失转运非胆汁酸有机阴离子的功能。最新报道表明ABCC2基因第 17号外显子错义突变和第28外显子无义突变共同引起杂合性突变，也可导致MRP2蛋白功能 丧失，使二葡萄糖苷酸胆红素转运异常，从而引起DJS。
[0005] 明确诊断可以避免反复就诊和不必要的治疗，以及避免其加重损害的因素。通过 对ABCC2基因的检测，尤其是编码MRP2段基因的检测有助于诊断DJS，减少误诊的发生。 Sanger测序法是目前公认的，是大多数临床分子诊断项目的金标准，特异性甚至能达到 100%，是分子诊断方面的经典技术平台。因此采用Sanger测序法对编码MRP2的基因ABCC2 的序列进行突变检测，具有稳定性高，特异性好的优点，能够有效避免假阳性的产生。
[0006] 为了给Sanger测序提供可靠的模板，首先必须针对该项目的特点，建立一个稳定 可靠的PCR体系。该项目PCR部分在技术环节存在以下两个难点：1.该项目需要提取血液全 基因组DNA，由于临床标本物流运输中存在众多不可控因素，因此临床检验中往往得不到质 量优良的全血标本，因此获得的DNA质量也会存在较大的样本间差异。2.由于需检测的外显 子数目较多，即PCR目的片段过多，导致PCR条件不统一。
[0007] 溶解温度(Tm)是PCR中一个很重要的参数，是50%的引物和互补序列表现为双链 DNA分子时的温度，对于设定PCR退火温度是必须的，合适的退火温度能够有效的减少非特 异性结合，还能保证目的序列有效退火。所以在保证特异性的情况下，设计引物的Tm值尽量 接近，使PCR的退火温度可以保持一致，从而达到PCR条件的统一。
【发明内容】
[0008] 本发明所要解决的技术问题是提供一种检测Dubin-Johnson综合症的ABCC2基因 的试剂盒及其检测方法，该试剂盒可用于检测ABCC2基因的突变位点，特异性好，灵敏度高。 [0009]本发明的一种检测Dubin-Johnson综合症的ABCC2基因的试剂盒，所述试剂盒包括 PCR扩增反应试剂以及用于样本DNA中ABCC2基因扩增的PCR引物;其中，PCR引物如下：
[0038]所述PCR扩增反应试剂包括GoTaq?DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2和反应缓冲液。
[0039]本发明的一种检测Dubin-Johnson综合症的ABCC2基因的试剂盒的检测方法，包括 如下步骤：
[0040] (1)采集待测血液样本，提取DNA;
[00411 (2)以该DNA为模板，采用用于样本DNA中ABCC2基因扩增的PCR引物进行PCR扩增， 得到PCR反应产物，进行测序分析，确定是否存在碱基突变。
[0042]所述步骤（2)中的PCR反应条件为：95°C5min;95°C30s、62°C30s、72°C40s，15个循 环；95°C30s，55°C30s，72°C40s，25个循环；最后72°C10min。
[0043]所述步骤(2)中的PCR反应体系为:PCR扩增反应试剂10yL，ddH20 6yL，上下游引物 各lyL，样品DNA2yL。
[0044]有益效果
[0045]本发明可用于检测ABCC2基因的突变位点，特异性好，灵敏度高；可用于临床作为 Dubin-Johnson综合症早期发现、早期明确诊断的辅助性指标，降低误诊率和避免延误治 疗;家系成员进行筛查可明确发病风险，产前筛查并进行干预，可降低后代Dubin-Johnson 综合症的发病率，使用方法简单，具有良好的应用前景。
【附图说明】
[0046] 图1是ABCC2基因Exon3(A)和Exon7(B)野生型的测序峰图。
【具体实施方式】
[0047]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。
[0048] 实施例1
[0049] 1.样本抽提
[0050] (1)抽取200yL的全血，加入20yL蛋白酶K溶液，混匀。
[00511 (2)加入200yL缓冲液GB，充分颠倒混匀，56°C放置10分钟，其间颠倒混匀数次，溶 液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
[0052] (3)加入200yL无水乙醇，充分颠倒混匀，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去 除管盖内壁的水珠。
[0053] (4)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管 中），12000rpm(13400Xg)离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放回收集管中。[0054] (5)向吸附柱CB3中加入500yL缓冲液⑶(使用前请先检查是否已加入无水乙醇）， 12000rpm(13400Xg)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
[0055] (6)向吸附柱CB3中加入600yL漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇）， 12000rpm(13400Xg)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
[0056] (7)向吸附柱CB3中加入600yL漂洗液PW，12000rpm(l3400Xg)离心30秒，倒掉废 液。
[0057] (8)将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm(13400Xg)离心2分钟，倒掉废液。将吸 附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
[0058] (9)将吸附柱CB3转入一个干净的1.5mL离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加 50yL洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12000rpm(13400Xg)离心2分钟，将溶液收集到离心 管中。
[0059] 2.实验过程
[0060] (1)按样品数n(样品数=待测样本数+阴性对照1个+阳性对照1个)取预混PCR反应 体系每管20yL分装于反应管中。
[0061] (2)将上述处理好的待测样本和阴性、阳性对照各取2yL分别加入反应管中，混匀， 低速离心数秒，进行PCR扩增，具体反应体系如下：
[0063]PCR反应条件，见下表：
[0065] 3