基因分析介导的芳香环聚酮化合物的寻找和鉴定方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物分子生物学与天然产物化学领域，是一种基因分析介导的芳香 环聚酮化合物的寻找和鉴定方法，具体涉及一种基因分析介导的快速寻找和鉴定放线菌源 芳香环聚酮化合物的方法。
【背景技术】
[0002] 目前市场上的抗生素中，聚酮类化合物居六大类天然产物之首。放线菌可以通过 Π型聚酮途径合成芳香环聚酮。芳香环聚酮类化合物具有广泛的生物活性，如抗细菌、抗真 菌、抗病毒、抗肿瘤、抗结核、免疫抑制等活性，这些化合物或其半合成衍生物有不少已应用 于临床治疗，如四环素类的四环素和土霉素，蒽环类的多柔比星和柔红霉素。芳香环聚酮主 要来源于陆地放线菌，尤其是链霉菌。经过六十多年的开发，从陆地放线菌中发现芳香环聚 酮新化合物的机率急剧下降。近年来，海洋和极端环境中的放线菌吸引了更多关注。然而， 已知芳香环聚酮的重复分离导致了该类化合物的发现效率低下。因此，迫切需要方法学创 新以提高新颖化合物的发现效率。据我们所知，目前尚未有基因分析指导化合物定向发现 的专利。基于此目的，我们开发了一种基因分析介导的放线菌源芳香环聚酮化合物的发现 方法，能够在小量发酵的基础上快速寻找和鉴定目标化合物。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是针对现有技术缺陷，提供一种基因分析介导的芳香环聚酮化合物 的寻找和鉴定方法，特别是一种快速寻找和鉴定放线菌源芳香环聚酮化合物的方法，避免 已知芳香环聚酮的重复分离。
[0004]本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
[0005]本发明提供一种基因分析介导的芳香环聚酮化合物的寻找和鉴定方法，包括通过 对待测菌株Π型聚酮酮合酶基因的扩增筛选具有芳香环聚酮合成潜力的菌株的步骤；
[0006]通过对所述扩增产物读码的氨基酸序列进行比对、系统进化分析预测产物化学型 的步骤；
[0007]发酵所述菌株并于发酵液中寻找、鉴定所述化学型产物的步骤。
[0008]优选地，通过对Π型聚酮酮合酶基因的扩增筛选具有芳香环聚酮合成潜力的菌株 的步骤中，所述扩增具体对待测菌株基因组DNA的扩增。
[0009] 优选地，所述待测菌株基因组DNA的提取方法具体为：
[0010]收集菌株菌体，加入450μ1TE缓冲液，悬涡混匀;加入50μ1 1%溶菌酶，混匀，37°C水浴30min;加入50μ1 0.5MEDTA，50yl10%SDS，10yl0.1%蛋白酶K，55°C水浴60min;加 入1/2体积7.5M乙酸铵，混匀；12000rpm离心20min，上清转移至新管；加入等体积异丙醇，-20°C沉淀30min，12000rpm离心lOmin收集沉淀；加入70 %乙醇洗涤沉淀2次；吹干，溶于50μ1 ΤΕ缓冲液。
[0011] 优选地，所述扩增的引物对如SEQIDNo. 1和SEQIDNo.2所示：
[0012] 上游引物IIPF6(SEQIDNo.l):TSGCSTGCTTCGAYGCSATC，
[0013] 下游引物IIPR6(SEQIDNo.2):TGGAANCCGCCGAABCCGCT;
[0014]优选地，通过对所述扩增产物读码的氨基酸序列进行比对、系统进化分析预测产 物化学型的步骤中，所述扩增产物为613bp的片段。
[0015]优选地，通过对所述扩增产物读码的氨基酸序列进行比对、系统分析预测产物化 学型的步骤中，所述比对、系统进化分析具体是将所述扩增产物与七类共43个已知芳香环 聚酮化合物产生菌株的Π型聚酮酮合酶基因序列进行分析;其中，所述化学型如四环素、蒽 环、角蒽环、金霉酸、苯并异色满醌、特曲霉素、五角多酚等;扩增产物经读码为氨基酸序列 后长度为203aa，与七类共43个已知芳香环聚酮化合物产生菌株的Π型聚酮酮合酶基因读 码的氨基酸序列（actI0RFl:Q02059，gra-〇rfl:P16540，frnL:068918，0RFl:Q54217，tcmK: P16538,ffhiEORFIII：P23155,schl：Q05356,curA：Q02578,oxyA：Q3S8R4,dpsA：Q54814, snoal:Q54495，mtmP:Q53671，UrdA:Q54173，jadA:Q56163，cmmP:Q70J88，hedC:Q67G30， gi1A:Q7X2H5，med-ORF1:Q7WT10，chaA:Q4R0M2，remA:Q70DX2，grhA:Q8KSW4，fdmF:Q2MGD1， zhuB:Q9F6E0，ovmP:Q6ZZW2，aknB:Q9L551，lanA:Q9ZGD7，benA:B1GSN1，aurID:Q56HA2， alpA:Q6VMI7，alpR:Q6VMH7，pgaA:Q93LY4，schP8:Q2HR20，pdmA:032451，ncnA:Q9X461， stfP:Q2PA07，simAl:Q9AMJ3，1lpF:A7DWI9，elmK:A8KQX2，dauA-OrfC:Q55223，orfl: P41175，orf4:Q54281，ardIorfl:Q48375，encA:Q9KHK6)进行比对，比对通过美国国家生物 技术信息中心(NCBI)的BLAST(http://blast.ncbi·nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行。待检序 列与比对分值高的序列一起进行系统进化树构建和进化树可靠性检验，使用的建树软件为 MEGA〇
[0016] 优选地，发酵所述菌株并于发酵液中寻找、鉴定所述所述化学型产物的步骤中，所 述寻找具体为从发酵液提取物中寻找与所述预测产物化学型的紫外-可见光吸收特征相符 的信号。
[0017] 优选地，发酵所述菌株并于发酵液提取物中寻找、鉴定所述化学型产物的步骤中， 所述提取物的获得方法具体为:抽滤所述发酵液得滤液，向所述滤液中加入等体积乙酸乙 酯萃取，然后旋蒸蒸发去除乙酸乙酯，即得;加入甲醇溶解后得备用提取物溶液。
[0018] 优选地，发酵所述菌株并于发酵液中寻找、鉴定所述所述化学型产物的步骤中，所 述鉴定具体为通过液相色谱联合高分辨率质谱推测寻找所得目标产物分子式，通过比对数 据库，判断其是否为已知化合物。
[0019] 在该步骤中，放线菌菌株小量摇瓶发酵液提取成分通过HPLC-DAD分析进行200-600nm波长范围内的紫外-可见吸收检测，根据吸收曲线判断化合物信号是否为芳香环聚 酮。使用仪器为分析型高效液相色谱仪。芳香环聚酮类化合物一般在200-400nm紫外区有强 吸收和中等强度吸收，在400_600nm可见光区有弱吸收。符合紫外-可见吸收特征的化合物 信号通过LC/MS获得其高分辨率质谱，推测分子式。使用仪器为UPLC-QT0F-MS(超高效液相 色谱-四极杆飞行时间高分辨质谱仪）。
[0020] 优选地，所述数据库为5(^卩；[11(161'(111^卩8://8(^；1^11(161'.0&8.0坪/8(^；1^11(161·)。
[0021] 与现有技术相比，本发明具有的有益效果为：
[0022] 本发明从基因水平筛选菌株，在基因分析的指导下，在小量发酵的基础上，从放线 菌菌株的复杂代谢产物中寻找芳香环聚酮信号，鉴定已知化合物，预测新化合物，能够提高 芳香环聚酮类化合物的发现效率。
【附图说明】
[0023]通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、 目的和优点将会变得更明显：
[0024]图1为本发明的技术路线图；
[0025]图2为引物对IIPF6和IIPR6扩增酮合酶KSa基因的片段；
[0026]图3为8株海绵来源放线菌菌株KSa基因PCR扩增产物的电泳图；
[0027]图4为基于17株放线菌的18个KSa基因氨基酸序列与标记序列构建的系统进化树； [0028]图5为角蒽环类化合物landomycinE的紫外-可见吸收曲线；
[0029]图6为StreptomycesanulatusS71的发酵液提取物中出现的一个化合物的紫外-可见吸收曲线；
[0030]图7为StreptomycesanulatusS71的发酵液提取物中特征化合物的高分离率质 谱；
[0031] 图8为已报道的角蒽环类化合物amycomycin B。
【具体实施方式】
[0032]下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术 人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术 人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明 的保护范围。
[0033]下述实施例的设计路线见图1，在实施例中，最终筛选得到的菌株海绵共附生链霉 菌为环圈链霉菌（Streptomycesanulatus)S71CCTCCAA2014035;该菌株分离于中国南 海蜂海绵Haliclonasp.，其保藏信息为:该菌株已于2014年12月1日递交CCTCC中国典型培 养物保藏中心(武汉），保藏编号为CCTCCAA2014035。
[0034] 实施例1、通过对待测菌株Π型聚酮酮合酶基因的扩增筛选具有芳香环聚酮合成 潜力的菌株
[0035]本实施例提供了从海绵来源的放线菌菌株中筛选芳香环聚酮合成潜力菌株的具 体操作及筛选结果：
[0036] 1、所述待测菌株基因组DNA的提取
[0037]提取方法具体为：收集菌体，加入450μ1TE缓冲液，悬涡混匀；加入50μ1 1%溶菌 酶，混匀，37°C水浴30min;加入50μ1 0.5ΜEDTA，50yl10%SDS，10yl0.1%蛋白酶K，55°C 水浴60min;加入1/2体积7.5M乙酸铵，混勾；12000rpm离心20min，上清转移至新管；加入等 体积异丙醇，一20°C沉淀30min，12000rpm离心10min收集沉淀;加入70 %乙醇洗涤沉淀2次； 吹干，溶于50μ1TE缓冲液。
[0038] 2、Π型聚酮酮合酶基因的扩增、克隆、测序
[0039] 所述扩增的引物对如SEQ IDNo.1和SEQ IDNo.2所示：
[0040]上游引物IIPF6(SEQ ID No.