用于鉴定嗜群血蜱的靶序列、引物、鉴定方法及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及蜱虫检测与鉴定技术领域，具体地涉及用于鉴定嗜群血蜱 (Haemaphysalisconcinna)的革E1序列、特异性引物对、鉴定方法及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 嗜群血蜱（Haemaphysalisconcinna)属硬蜱科，血蜱属，广泛分布于我国北方草 原地区（包括黑龙江、吉林、辽宁、内蒙、甘肃、宁夏和新疆等）。另外，嗜群血蜱还分布于国 外蒙古国、日本、朝鲜、伊朗、土耳其以及捷克、罗马尼亚、德国等广大地区。其成蜱主要寄生 于大型哺乳类动物（包括有蹄类和食肉类），也侵袭人。幼蜱和若蜱寄生于小型哺乳类动物 及鸟类。嗜群血蜱作为媒介可传播森林脑炎、Q热、北亚蜱媒斑点热等疫病。
[0003] 目前，嗜群血蜱的物种鉴定主要依靠形态学特征，该鉴定方法对鉴定者的专业知 识和蜱虫样本完整性均要求较高，又由于蜱虫易与形态近似种混淆，造成嗜群血蜱的鉴定 结果费时、费力且准确度和重复性都不高。近年来，分子生物学技术已经被广泛应用于物 种鉴定，目前在嗜群血蜱的鉴定方面报道较少，Genbank数据库中有嗜群血蜱的C0I序列， 但是其与Genbank数据库中的已认证的另外一个参考序列（NCBIreferencesequence) Haemaphysalisparva(NC020335. 1) 一 致，而该序列明确说明是属于Haemaphysalis parva，因此申请人认为目前Genbank数据库中公开的C0I序列并非是嗜群血蜱 (Haemaphysalisconcinna)的。
【发明内容】
[0004] 本发明的第一个目的在于克服现有检测技术的不足，提供一种用于鉴定嗜群血蜱 的特异性靶序列。
[0005] 本发明的第二个目的在于提供用于扩增特异性靶序列的引物对。
[0006] 本发明的第三个目的在于提供鉴定嗜群血蜱的方法及试剂盒。
[0007] 为实现上述目的，本发明首先利用发明人设计的蜱虫C0I全长序列扩增引物对嗜 群血蜱的C0I序列进行扩增。
[0008] C0I-CF:5'-ATTTTACCGCGATGAATATTYTC-3'（SEQIDN0. 4)
[0009] C0I-CR:5'-TTATTTTAAAATAATRTT-3'（SEQIDNO. 5)。
[0010] 上述序列中，Y和R分别为兼并引物，Y=C/T，R=A/G。
[0011] C0I-CF与C0I-CR扩增出嗜群血蜱的C0I全长序列，长1539bp，其电泳图如图1所 不。
[0012] 本发明根据扩增引物C0I-CF和C0I-CR扩增的嗜群血蜱的C0I全长序列，通过 MEGA软件中CLUSTALW程序，将该序列与Genbank数据库以及发明人扩增的同属其他血蜱 C0I序列进行比对分析，筛选出嗜群血蜱特异性序列并设计扩增引物，共设计正向引物2 条，反向引物2条。它们分别为：
[0013] 正向引物HC-F:5'CTCTTCTTTAGTAGAAAGTGGTGT3'（如SEQIDN0. 2 所示）
[0014] 反向引物HC-R:5'GGTCAAAAAATGAAGTATTGAAG3'（如SEQIDNO. 3 所示）。
[0015]正向引物HC-F1 :5' -ATATCCGCCCCTTTCT-3'（如SEQIDNO. 6 所示）
[0016] 反向引物HC-R1 :5' -ATTCGTTCTAAGGTCATG-3'（如SEQIDNO. 7 所示）
[0017] 使用HC-F1以及HC-R1引物进行扩增时，除了嗜群血蜱，部分长角血蜱也能扩增出 相应大小条带。相比HC-F和HC-R其扩增特异性较差，因此选用HC-F和HC-R引物对。
[0018] 经实际PCR扩增验证，确定正向引物HC-F以及反向引物HC-R扩增效果良好，特异 性强。弓丨物设计BLAST比对结果如图2,图3所示。
[0019] 设计嗜群血蜱特异性引物并进行PCR扩增。嗜群血蜱获得323bp的DNA特异性条 带，对其进行测序、BLAST比对，确定该特异性DNA序列可作为鉴定嗜群血蜱的特异性DNA序 列，用于鉴定嗜群血蜱（Haemaphysalisconcinna)。
[0020] 本发明首先提供一种用于鉴定嗜群血蜱（Haemaphysalisconcinna)的革El序列，其 具有SEQIDNo. 1所示的核苷酸序列。
[0021 ] 本发明提供了上述靶序列在鉴定嗜群血蜱中的应用。
[0022] 用于上述靶序列的特异性引物对属于本发明的保护范围。
[0023] 本发明提供了特异性扩增上述靶序列的特异性引物对，其核苷酸序列如SEQID Ν0· 2、3 所示。
[0024] 本发明提供了上述特异性引物对在制备鉴定嗜群血蜱（Haemaphysalis concinna)试剂盒中的应用。
[0025] 进一步，本发明提供鉴定嗜群血蜱（Haemaphysalisconcinna)的方法，以待测昆 虫样品总DNA为模板，以SEQIDNo. 1所示的核苷酸序列为靶序列，利用本发明提供的特异 性引物对进行PCR，根据扩增条带的大小判定结果。
[0026] 更进一步地，若扩增条带大小为323bp，则待测昆虫样本为嗜群血蜱。
[0027] 本发明的鉴定嗜群血蜱（Haemaphysalisconcinna)的方法中，50μ1PCR反应 体系为：l〇XPCRbuffer5yl、10mM上、下游引物各 2yl、10mMdNTPs2yl、50U的Taq酶 1μ1，10~20ngDNA模板2μ1，加灭菌双蒸水至50μ1;
[0028]PCR反应程序：预热 94°C，5min;94°C30s，48°C30s，72°C30s，共 36 个循环；延伸 72°C，7min，4°C保存。
[0029] 本发明还提供一种用于鉴定嗜群血蜱（Haemaphysalisconcinna)的试剂盒，含有 核苷酸序列如SEQIDN0. 2、3所示的引物对。
[0030] 本发明提供了该试剂盒在鉴定嗜群血蜱（Haemaphysalisconcinna)中的用途。
[0031] 本发明提供了用于鉴定嗜群血蜱的靶序列。本发明还克服了传统嗜群血蜱鉴定对 标本完整性要求高、需要专业分类专家、鉴定成本高等问题，提供的鉴定嗜群血蜱的PCR引 物及鉴定方法弥补现有检测技术的不足，操作简便快捷，灵敏度高、特异性强、简单快速、成 本低，提高了嗜群血蜱鉴定的效率和准确性，能够满足嗜群血蜱快速、准确的物种分子鉴定 需求。适用于嗜群血蜱分布调查，种群分析及相关蜱传疫病的控制等研究分析工作，具有重 要的理论意义和应用价值。
【附图说明】
[0032] 图1发明人设计蜱虫C0I全长序列扩增引物对C0I-CF/C0I-CR，并用引物对扩增 嗜群血蜱的COI全长序列。PCR扩增产物1%琼脂糖凝胶电泳图；其中M:DL2000Mariier;1 : 1# 嗜群血蜱（Haemaphysalisconcinna)
[0033] 图2为本发明设计的嗜群血蜱正向扩增引物HC-F序列与Genbank数据库以及发 明人扩增的同属其他血蜱C0I序列进行BLAST比对分析的结果；其中1 :HC-F引物序列； 2 :发明人扩增的1#嗜群血蜱（Haemaphysalisconcinna)C0I序列；3 :发明人扩增的1#草 原血蜱（Haemaphysalisverticalis)COI序列；4 :发明人扩增的1#日本血蜱（japonica longicornis)C0I序列；5 :发明人扩增的 1# 长角血蜱（HaemaphysalisHaemaphysalis) C0I序列；6:Genbank数据库中的褐黄血婢（Haemaphysalisflava)C0I序列；7:Genbank 数据库中的硕鼠血蜱（Haemaphysalishumerosa)C0I序列；8 :Genbank数据库中的狐猴血 蜱（Haemaphysalislemuris)C0I序列；9:Genbank数据库中的长棘血蜱（Haemaphysalis punctata)C0I序列；
[0034] 图3为本发明设计的嗜群血蜱反向扩增引物HC-R序列与Genbank数据库以及发 明人扩增的同属其他血蜱C0I序列进行BLAST比对分析的结果；其中1 :HC-R引物序列； 2 :发明人扩增的1#嗜群血蜱（Haemaphysalisconcinna)C0I序列；3 :发明人扩增的1#草 原血蜱（Haemaphysalisverticalis)COI序列；4 :发明人扩增的1#日本血蜱（japonica longicornis)C0I序列；5 :发明人扩增的 1# 长角血蜱（HaemaphysalisHaemaphysalis) C0I序列；6:Genbank数据库中的褐黄血婢（Haemaphysalisflava)C0I序列；7:Genbank 数据库中的硕鼠血蜱（Haemaphysalishumerosa)C0I序列；8 :Genbank数据库中的狐猴血 蜱（Haemaphysalislemuris)C0I序列；9:Genbank数据库中的长棘血蜱（Haemaphysalis punctata)C0I序列；
[0035] 图4为用本发明设计的特异性引物对蜱虫DNA样本进行PCR检测的1 %琼脂糖 凝胶电泳图；其中M:DL2000Marker;1 :1# 草原革蜱（Dermacentornuttalli) ;2:2# 草 原革蜱（Dermacentornuttalli) ;3:全沟硬蜱（Ixodespersuleatus) ;4:1# 日本血蜱 (Haemaphysalisjaponica) ;5:2# 日本血蜱（Haemaphysalisjaponica) ;6:1# 长角血蜱 (Haemaphysalislongicornis) ;7:2# 长角血蜱（Haemaphysalislongicornis) ;8 : 1# 亚 洲璃眼蜱（Hyalommaasiaticum) ;9:2# 亚洲璃眼蜱（Hyalommaasiaticum) ;10 :草原血蜱 (Haemaphysalisverticalis) ;11:1#嗜群血蜱（Haemaphysalisconcinna) ;12:2#嗜群血 婢（Haemaphysalisconcinna)〇
【具体实施方式】
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