针对食品中的三类致病菌的多重pcr检测用引物组、试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于食品微生物安全检测领域，涉及利用多重PCR技术对食品中的致病菌 进行快速检测鉴定的引物组、试剂盒及方法。具体而言，本发明涉及针对食品中的金黄色 葡萄球菌（Staphylococcusaureus)、沙门氏菌（Salmonellasp.)和志贺氏菌（Shigella sp.)的多重PCR检测用引物组、试剂盒及检测方法。
【背景技术】
[0002] 近几年，食品安全事件频频出现，食品安全问题也越来越被社会公众所关注和重 视。许多食源性致病菌通过水和食物传播而引发食源性疾病，其发病率和死亡率都呈现逐 渐增加的趋势。在世界范围内，每年有超过30 %的人口感染食源性疾病，造成数十亿美元的 花销。预防和控制食源性疾病的发生和传播，已成为解决社会食品安全问题的重要举措之 一。能否及时有效地控制与预防食源性疾病的发生和传播，关键在于能否快速准确地检测 与鉴定食源性致病菌。
[0003] 金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌是引起食源性疾病的主要的三类致病菌， 国内外由这三类致病菌引发的食物中毒事件频频发生。这三类致病菌在食品中分布比较普 遍，其污染食品后，不仅致使食品腐败变质，还产生多种毒素，导致严重的疾病。例如，金黄 色葡萄球菌会引起局部化脓感染、肺炎、伪膜性肠炎、心包炎、败血症、脓毒症等；沙门氏菌 会引起胃肠炎、菌血症、肠热症等；志贺氏菌能分泌强烈的内毒素，引起发热、神志不清、甚 至中毒性休克，破坏肠粘膜，引起炎症、溃疡，导致肠功能紊乱。
[0004] 目前世界各国都把金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌列为食品卫生的法定检 测项目。在检测手段上，目前国内外检测机构仍主要采用FDA、A0AC、ISO和GB等标准对金 黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌进行检测，整个过程一般需要3-5天，上述检测手段操 作复杂，检测通量不高，很难满足对食源性致病菌进行快速准确检测的现实需求。因此，建 立新的对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌进行快速检测的方法就显得尤为迫切。
[0005] 近年来，借助于免疫学和分子生物学等方法，对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺 氏菌的快速检测有了很大发展，目前国内外针对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌进 行快速检测的方法很多，如：PCR-凝胶电泳法、实时荧光PCR法、基因芯片测试法、全自动细 菌生化检定仪、酶联免疫吸附法、荧光免疫检测法（VIDAS)、胶体金免疫测试条等。但是，免 疫学方法如酶联免疫吸附法、免疫荧光法和乳胶凝集试验等在操作程序、检测时间和特异 性等方面尚不理想，并且检测成本极高；而在分子生物学方法方面，如PCR技术则以灵敏、 特异、简便、快速、成本低等优点被越来越多地应用。
[0006] 以单目标基因为检测对象的常规单重PCR技术通量低，无法实现对多种目的菌中 的多个目标基因的同时检测。相比之下，多重PCR技术采用将多个目标基因联用的方式，在 同一PCR反应体系内实现对来自不同细菌的多个目标基因的同步扩增，从而能够快速、灵 敏、特异地检测多种食源性致病菌。然而，由于多种因素，例如所选取的引物和模板的种类 和浓度、Mg2+和dNTP的浓度等均可能对多重PCR的结果产生影响，因此，同时检测的目标微 生物种类越多，建立PCR体系的难度越大，检测的特异性及灵敏度越难得到保证。
[0007] 在影响针对多菌种的多重PCR检测的诸多因素中，目标基因的数目和种类的选取 至关重要。若目标基因的数目过多，PCR体系中加入的引物对数量过多，产生非预期反应的 概率增大，导致电泳鉴定图中出现杂带或造成拖尾等，从而影响检测效率；而若将引物加入 不同的PCR体系分别进行反应，势必又会降低通量。另外，目标基因种类的选取对于是否能 够有效进行多重PCR检测而言也是关键因素之一：如果目标基因特异性过高（即种属分布 过窄），例如像大多数现有方法中所侧重的主要用于医学检测目的的耐药性相关基因和毒 素基因等，会造成检测覆盖种类不足，从而造成漏检等问题；反之，则可能会引起假阳性率 高等弊端。因此，目前对目标基因数目和种类的选择仍亟待优化。具体而言，如何选择对于 金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌的全部菌株而言均具有高覆盖度和高特异性的目 标基因，仍是多重PCR检测中的难题。
[0008] 进而，在目标基因选定后，针对多个目标基因进行的引物设计同样可能从根本上 影响多重PCR检测的结果：由于需要在同一PCR体系中针对不同目标基因进行同步扩增，适 宜各引物对的反应条件需能够彼此配合、且各引物对之间不会相互干扰，从而确保针对各 目标基因的PCR反应均能够顺利、准确地进行。
[0009] 此外，考虑到食品中仅含有少量金黄色葡萄球菌、沙门氏菌或志贺氏菌即会引发 食源性疾病，对检测方法的灵敏度也存在较高要求。现有的PCR技术以金黄色葡萄球菌、沙 门氏菌或志贺氏菌的基因组DNA为模板时的检测灵敏度通常在10~100pg/μ L左右，且尚 未有关于同时以金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌中的至少两种的基因组DNA为模板 的多重PCR检测的灵敏度的报道。可见，现有技术并不能完全满足食品安全国家标准的需 求。因此，仍需开发灵敏度更高的PCR检测法。
【发明内容】
[0010] 针对以上不足，本发明组合利用了金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌的种属 特异性鉴别基因及耐药性相关基因，采用多重PCR技术对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志 贺氏菌同时进行快速检测。在比对分析金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌的种属特异 性鉴别基因及耐药性相关基因的基础上，设计筛选出针对三种细菌的种属特异性引物对及 引物组，优化组合建立了多重PCR检测体系，并开发了金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏 菌多重PCR检测用试剂盒；同时，结合样品前增菌和前处理技术，建立了检测覆盖范围广、 特异性强且灵敏度高的检测方法，由此完成了本发明。
[0011] 在第一方面，本发明提供了一种用于快速检测食品中的金黄色葡萄球菌、沙门氏 菌和志贺氏菌的多重PCR检测用引物组，所述引物组包括如下引物对：
[0012] 金黄色葡萄球菌耐甲氧西林关键因子Α基因（femA基因）扩增用引物对：
[0013] femA-F：AAGCACACAACAAGCGAGATAAC(SEQIDNO. 1)；
[0014] femA-R：TTGATAAAGAAGAAACCAGCAGAG(SEQIDNO. 2),
[0015] 沙门氏菌侵袭基因正调节蛋白A基因（hilA基因）扩增用引物对：
[0016] hilA-F：TGAATTACGCTCACAACACCTG(SEQIDNO. 3)；
[0017] hilA-R：TGCTAAGCAACCAGATTACGATG(SEQIDNO. 4),
[0018] 以及
[0019] 志贺氏菌侵染性质粒抗原Η基因（ipaH基因）扩增用引物对：
[0020]ipaH-F：CTCACATGGAACAATCTCCG(SEQIDNO. 5)；
[0021] ipaH-R：TCATTCTCTTCACGGCTTCTG(SEQIDNO. 6)〇
[0022] 在第二方面，本发明提供了一种用于快速检测食品中的金黄色葡萄球菌、沙门氏 菌和志贺氏菌的多重PCR检测用试剂盒，所述试剂盒中包含本发明的多重PCR检测用引物 组，所述引物组包括如下引物对：
[0023] 金黄色葡萄球菌耐甲氧西林关键因子A基因（femA基因）扩增用引物对：
[0024] femA-F：AAGCACACAACAAGCGAGATAAC(SEQIDNO. 1)；
[0025] femA-R：TTGATAAAGAAGAAACCAGCAGAG(SEQIDNO. 2),
[0026] 沙门氏菌侵袭基因正调节蛋白A基因（hilA基因）扩增用引物对：
[0027]hilA-F：TGAATTACGCTCACAACACCTG(SEQIDNO. 3)；
[0028] hilA-R：TGCTAAGCAACCAGATTACGATG(SEQIDNO. 4),
[0029] 以及
[0030] 志贺氏菌侵染性质粒抗原H基因（ipaH基因）扩增用引物对：
[0031] ipaH-F：CTCACATGGAACAATCTCCG(SEQIDNO. 5)；
[0032] ipaH-R：TCATTCTCTTCACGGCTTCTG(SEQIDNO. 6)〇
[0033] 在第三方面，本发明还提供了一种使用本发明的多重PCR检测用引物组或试剂盒 对食品中的金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌进行快速检测的方法，所述方法包括以 下步骤：
[0034] a)从所述食品中获取模板DNA的前处理步骤；
[0035] b)使用本发明的多重PCR检测用引物组或试剂盒对所述模板DNA进行多重PCR扩 增的步骤；
[0036] c)对扩增产物进行检测的步骤，
[0037] 从而对所述食品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌的存在及含量进行分 析。
[0038] 本发明所建立的针对食品中的金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌的多重PCR 检测用引物组和试剂盒及检测方法通过组合使用金黄色葡萄球菌的耐药性相关基因femA、 沙门氏菌的种属特异性鉴别基因hilA以及志贺氏菌的种属特异性鉴别基因ipaH，具有检 测适用面广、对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌种属覆盖相对全面、特异性强、灵敏 度高等优势，从而提供了一种同时针对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌进行多重PCR 检测的方法。此外，本发明提供的针对食品中的金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌的多 重PCR检测方法还具备灵敏度高、特异性强、检测耗时短、操作较简单、设备要求低等特点， 可大大节省检测成本和时间，提高检测的通量及准确性，具有广泛的推广应用市场前景。
【具体实施方式】
[0039] 根据本发明的一些实施方式，除本发明的多重PCR检测用引物组外，本发明的多 重PCR检测用试剂盒中可进一步包含反应缓冲液、4种脱氧核苷三磷酸、DNA聚合酶等成分。
[0040] 根据本发明一些优选的实施方式，除本发明的多重PCR检测用引物组外，本发明 的多重PCR检测用试剂盒中可进一步包含具有如下成分的PCR反应基础溶液：Tris-HCl;KC1 ;MgCl2 ;dATP、dTTP、dGTP及dCTP;以及TaqDNA聚合酶。
[0041] 根据本发明一些更为优选的实施方式，在本发明的多重PCR检测用试剂盒中，各 成分以如下浓度包含于25 μ L的PCR最终反应溶液中：
[0044] 根据本发明一些优选的实施方式，本发明的多重PCR检测用试剂盒中还含有阴性 对照DNA和阳性对照DNA。
[0045] 根据本发明一些进一步优选的实施方式，本发明的多重P