专利名称：一种用于检测单核细胞增生李斯特氏菌核苷酸片段的引物和探针序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于检测单核细胞增生李斯特氏菌核苷酸片段的引物和探针序列。
背景技术：
单核细胞增生李斯特氏菌(以下简称单增李斯特菌)是进出口食品中常见的致病菌，也是导致食物中毒和食源性疾病的主要病原菌，可引起人和动物患脑膜炎、脑炎、败血症、心内膜炎、流产、脓肿和局部的脓性损害，并可造成孕妇流产、死胎等疾病。发病者死亡率可达30～70％。世界卫生组织(WTO)关于单增李斯特菌引起的食品中毒报告中指出4～8％的水产品，5～10％的奶及奶制品，30％以上的肉制品，15％以上的禽肉制品均被该菌污染。由于该菌在4℃冰箱保存的食物中也可生长繁殖，故将促使其危害性更进一步增大。国家质量监督检验检疫总局的2002年第25和26号令中明确规定单增李斯特菌为必检项目。目前对该菌的检测，国标和行标多采用传统的平板培养或酶联反应(ELISA)的方法，这些方法步骤烦琐，费时费力，一般至少要耗时4-6天，且由于多种干扰因素的影响，检测结果的准确性容易降低，给食品的进出口带来了非常不利的影响。因此，建立一种更加快速、准确、操作简便的致病菌检测方法势在必行。
目前国内外应用于食源性病原菌检测的分子生物学技术，主要分为三类普通PCR技术、荧光PCR技术和基因芯片技术。基因芯片方法检测效率高，但技术还不成熟，假阳性率和假阴性率都很难控制，而且成本较高，目前还处于研究阶段。普通PCR方法技术成熟，也最早用于食源性病原菌的检测，但需要对PCR产物进行后处理，极易导致PCR产物污染，而且也有一定的非特异性扩增。荧光PCR是在普通PCR的基础上，在扩增反应体系中加入一对特异性引物的同时再加入一个特异性的荧光探针，使用实时监测的荧光PCR检测仪来检测靶核苷酸序列的技术。除了具有普通PCR的优点外，它还具有以下优点(1)特异性更强，灵敏度更高。由于多使用了一条可与模板互补配对的荧光探针，提高了特异性，并且由自动化仪器收集荧光信号，避免了人工判断的主观性，又可进一步提高灵敏度。(2)全封闭反应，在线式实时监测荧光，无须PCR产物的后处理，避免污染，保证了结果的可靠性。(3)数据分析选在核酸扩增的对数期，摈弃普通PCR方法的受多因素干扰的终点分析法，使得定量更准确可靠。(4)可实现单管双检或多检，还可设计针对性内标，监控抽提效率及排除抑制剂干扰。(5)不接触有毒试剂，操作安全。(6)有利于规模化、自动化及联网管理。(7)适用范围更广，理论上可检测任何细菌的核酸。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测单增李斯特菌核苷酸片段的引物和探针序列。
基于上述目的，本发明采用以下技术方案用于检测单增李斯特菌核苷酸片段的引物和探针序列包括1.由上游引物LMF1420序列为CTGAATCTCAAGCAAAACCTGGT和下游引物LMR1593序列为CGCGACCGAAGCCAACTA组成的引物对，以及该引物对的上游引物LMF1420位置向5’端方向延伸10个碱基，向3’端方向延伸10个碱基，下游引物LMR1593位置向3’端方向延伸9个碱基，向5’端方向延伸5个碱基区域范围内得到的引物序列。探针序列包括由探针LM-p1序列为ATACGATAACATCCACGGCTCTGGCTGG向3’端方向延伸9个碱基和向5’端方向延伸10个碱基区域范围内得到的探针序列。
2.由上游引物LMUF序列为TCTGTTAGCGCAACTTGGTTAAAC和下游引物LMRR序列为TCCGCCTTTGATTGACGTAAT组成的引物对，以及该引物对的上游引物LMUF位置向5’端方向延伸10个碱基，向3’端方向延伸10个碱基，下游引物LMRR位置向5’端方向延伸10个碱基区域范围内得到的引物序列。探针序列包括由探针LM-p2序列为CTGGTGTTGATAACAGTAT向5’端方向延伸10个碱基区域范围内得到的探针序列。
本发明的具体原理是利用一对靶核苷酸序列的特异性引物和一个特异性荧光探针，采用耐热DNA聚合酶(Taq酶)、四种核苷酸单体(dNTP)等成分，并应用PCR技术实现靶核苷酸序列的核酸片段扩增。所使用的探针为两端分别标记荧光报告基团(R)和荧光淬灭基团(Q)的寡核苷酸。在探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团所吸收，而在PCR扩增过程中，Taq酶的5’端外切酶活性将特异结合在靶核苷酸片段上的荧光探针酶切降解，使荧光报告基团游离于反应体系中，脱离了荧光淬灭基团的屏蔽作用，荧光报告基团的荧光信号就可以由仪器检测到，荧光信号量的变化与扩增产物量成正比，从而判定待测样本中靶核苷酸序列的存在。
图1利用引物对LMF1420/LMR1593和探针LM-p1检测单增李斯特菌阳性样品的荧光PCR扩增图。
具体实施例方式
1.引物和探针设计通过分别对所有已知的单增李斯特菌基因组序列进行比较分析，选择无二级结构且高度保守的区段(单增李斯特菌iap基因，其全序列见附录)，设计多对引物和探针，引物长度一般为20个碱基左右，引物间和引物内无互补序列。最优引物、探针序列组合如下(1)上游引物LMF1420CTGAATCTCAAGCAAAACCTGGT下游引物LMR1593CGCGACCGAAGCCAACTA探针LM-p1ATACGATAACATCCACGGCTCTGGCTGG(2)上游引物LMUFTCTGTTAGCGCAACTTGGTTAAAC下游引物LMRRTCCGCCTTTGATTGACGTAAT探针LM-p2CTGGTGTTGATAACAGTAT2.反应体系的建立和优化反应体系的建立和优化中所采用的靶区域模板以如下方法获得取单增李斯特菌标准菌株复苏后培养48小时，取培养液1ml进行10倍梯度稀释，选取10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6共6个稀释度作为系列阳性模板，分别提取基因组核酸，再分别用上述检测序列区域中的最长的扩增片段的引物和探针进行PCR扩增，并取其中Ct值24-27之间者作为以后反应体系优化时的模板。
2.1引物浓度的优化在反应体系中，将单增李斯特菌的引物浓度分别从0.1μmol/L至0.8μmol/L作倍比连续稀释后进行检测，通过试验结果的分析比较，确定最佳引物终浓度为0.2μmol/L。
2.2镁离子浓度的优化在反应体系中其它条件不变的前提下，将MgCl2的浓度从1mmol/L至2.5mmol/L以0.5mmol/L递增，经过多次重复实验选定2.5mmol/L为试剂盒反应体系中的镁离子浓度。
2.3Taq DNA聚合酶(Taq酶)用量的优化通过比较Taq酶用量(以单位Unit计)的优化实验结果，选定2U作为试剂盒反应体系中Taq酶的用量。
2.4dNTPs浓度的优化通过使用不同浓度的dNTPs进行检测，综合评估后选0.2mmol/L作为试剂盒反应体系中dNTPs的使用量。
2.5探针浓度的优化在反应体系中，将单增李斯特菌的探针浓度分别从0.05μmol/L至0.2μmol/L作倍比连续稀释后进行检测，通过试验结果的分析比较，确定最佳探针终浓度为0.1μmol/L。
利用上述引物和探针进行反应体系的建立，最后确定采用的荧光PCR反应体系为40μl体系，所需各组分及相应浓度见表1。
表1 优化后的PCR反应体系
注a.在荧光PCR反应体积不同时，各试剂应按比例调整。
b.使用的仪器不同，应将反应参数作适当调整。
3.仪器检测通道的选择在进行荧光PCR反应时，应对所用仪器中反应管荧光信号的收集进行设置，选择的荧光检测通道与探针所标记的荧光报告基团一致。具体设置方法因仪器而异，应参照仪器使用说明书。
4.PCR条件选择如下95℃2min，1个循环；95℃5sec，60℃40sec，40个循环。
5.检测步骤(1)选取引物和探针；(2)制备待测模板，可采用酚-氯仿法提取各种来源样品中单增李斯特菌的基因组DNA；(3)反应体系的建立a、确定最佳引物浓度；b、确定镁离子浓度；c、确定Taq DNA聚合酶(Taq酶)用量；d、确定dNTPs浓度；e、确定探针浓度；(4)选择仪器的检测通道；(5)上机检测。
6.实施例选取引物对LMF1420/LMR1593和探针LM-p1，将待检的单增李斯特菌培养液用酚-氯仿法抽提基因组DNA。具体步骤如下(1)将待检的单增李斯特菌增菌液(约1ml)加入1.5ml的离心管中，12000rpm离心5分钟，去上清。
(2)加入DNA裂解液700ul，充分混匀重悬，水浴煮沸5分钟。
(3)加入等体积的酚-氯仿(V/V＝1∶1)溶液，充分混匀后离心，13000rpm离心5分钟。
(4)将上清液移入另一个1.5ml的离心管中，加入等体积的氯仿，混匀，13000rpm离心5分钟。
(5)将上清液移入另一个1.5ml的离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇，上下颠倒混匀，13000rpm离心5分钟。
(6)弃上清后用70％乙醇冲洗，13000rpm离心5分钟，小心吸弃上清，倒置晾干。
(7)在干燥后的离心管中加入50ul DNA溶解液充分混匀，作为DNA模板待用。
在40ul荧光PCR反应体系中，加入以上提取的单增李斯特菌基因组DNA 2ul，根据前述PCR反应条件进行荧光PCR检测。经检测，若待检培养液中含有单增李斯特菌则显示阳性扩增曲线，其检测灵敏度可达到1000个拷贝/ml；若待检培养液中不含有单增李斯特菌则无扩增信号，提示上述引物对和探针具有良好的灵敏度和特异性。
7.本发明的优点(1)本发明提供的引物和探针的检测灵敏度可达1000个拷贝/ml，说明其具有良好的灵敏度。
(2)本发明提供的引物和探针对于不含有单增李斯特菌的检测样本均无扩增信号，说明其具有良好的特异性。
(3)由于本发明采用单增李斯特菌的内源基因iap基因作为扩增的目的基因，避免了假阴性结果的产生。
(4)由于本发明采用荧光PCR技术作为检测方法，整个反应均在封闭的反应管内进行，避免了其他核酸检测方法如PCR-电泳等易于形成气溶胶污染而造成假阳性结果；由于对PCR产物进行实时监测，大大节省了监测时间，节约了人力物力。
附录单核细胞增生李斯特氏菌iap基因5’-ATGAATATGAAAAAAGCAACTATCGCGGCTACAGCTGGGATTGCGGTAACAGCATTTGCTGCTCCAACAATCGCATCCGCAAGCACTGTAGTAGTCGAAGCTGGTGATACTCTTTGGGGTATCGCACAAAGTAAAGGGACTACTGTTGACGCAATTAAAAAAGCAAACAATTTAACAACAGATAAAATCGTACCAGGTCAAAAATTACAAGTAAATGAGGTTGCTGCTGCTGAAAAAACAGAGAAATCTGTTAGCGCAACTTGGTTAAACGTTLMUFCGTAGTGGCGCTGGTGTTGATAACAGTATTATTACGTCAATCAAAGGCGGAACAAAAGTAACTGTTGAALM-p2 LMRRTCAACCGAATCTAATGGCTGGAACAAAATTACTTACAACGACGGGGAAACTGGTTTCGTTAACGGTAAATACTTAACTGACAAAGTAGCAAGCACTCCTGTTGCACCAACACAAGAAGTGAAAAAAGAAACTACTACTCAACAAGCTGCACCTGCTGCAGAAACAAAAACTGAAGTAAAACAAACTACACAAGCAACTACACCTGCACCTAAAGTAGCAGAAACGAAAGAAACTCCAGTGGTAGATCAAAATGCTACTACACACGTGTTAAAAGCGGTGACACTATTTGGGCTTTATCCGTAAAATACGGTGTTTCCGTTCAAGACATTATGTCATGGAATAATTTACCTTCTTCCTCTATTTATGTAGGTCAAAAACTTGCTATTAAACAAACAGCCAACACAGCTACTCCAAAAGCAGAAGTGAAAAAAGAAGCTCCAGCAGCTGAAAAACAAGCTGCACCAGTAGTTAAAGCAAATACTAACACTAACACAAATGCTACTACAGAGAAAAAAGAAACAACACAACAACAAACAGCACCTAAAGCACCAACAGAAGCTGCAAAACCACGTCCCGCATCATCTACAAACACAAATGCTAATAAAACGAATACGAATACAAACAATACTAATACAAGTACACCATCTAAAAATACCAATACTAATACAAACTCCAATACGAATACAAACTCAAATACGAATGCTAATCAAGGTTCTTCTAACAATAACAGCAATTCAAGTGCGAGTGCTATTATTGCTGAAGCTCAAAAACACCTTGGAAAAGCTTATTCATGGGGTGGTAACGGACCAACTACATTTGATTGCTCTGGTTACACTAAATATGTATTTGCTAAAGCGGGAATCTCCCTTCCACGTACTTCTGGCGCACAATACGCTAGCACTACAAGAATCTCTGAATCTCAAGCAAAACCTGGTGATTTAGTATTCTTTGACTATGGTAGCGGAATTTCTCACGTTGGTLMF1420ATCTACGTTGGTAATGGTCAAATGATTAACGCGCAAGACAATGGCGTTAAATACGATAACATCCACGGCLM-p1TCTGGCTGGGGTAAATATCTAGTTGGCTTCGGTCGC GTATAA-3’LMR159权利要求
1.一种用于检测单核细胞增生李斯特氏菌(以下简称单增李斯特菌)核苷酸片段的引物序列，其特征在于所述的引物序列包括由上游引物LMF1420序列为CTGAATCTCAAGCAAAACCTGGT和下游引物LMR1593序列为CGCGACCGAAGCCAACTA组成的引物对，以及该引物对的上游引物LMF1420位置向5’端方向延伸10个碱基，向3’端方向延伸10个碱基，下游引物LMR1593位置向3’端方向延伸9个碱基，向5’端方向延伸5个碱基区域范围内得到的引物序列。
2.根据权利要求1所述的用于检测单增李斯特菌核苷酸片段的引物序列，其特征在于所述的引物序列为上游引物LMF1420序列为CTGAATCTCAAGCAAAACCTGGT和下游引物LMR1593序列为CGCGACCGAAGCCAACTA。
3.一种用于检测单增李斯特菌核苷酸片段的探针序列，其特征在于所述的探针序列包括由探针LM-p1序列为ATACGATAACATCCACGGCTCTGGCTGG向3’端方向延伸9个碱基和向5’端方向延伸10个碱基区域范围内得到的探针序列。
4.根据权利要求3所述的用于检测单增李斯特菌核苷酸片段的探针序列，其特征在于所述的探针LM-p1序列为ATACGATAACATCCACGGCTCTGGCTGG。
5.一种用于检测单增李斯特菌核苷酸片段的引物序列，其特征在于所述的引物序列包括由上游引物LMUF序列为TCTGTTAGCGCAACTTGGTTAAAC和下游引物LMRR序列为TCCGCCTTTGATTGACGTAAT组成的引物对，以及该引物对的上游引物LMUF位置向5’端方向延伸10个碱基，向3’端方向延伸10个碱基，下游引物LMRR位置向5’端方向延伸10个碱基区域范围内得到的引物序列。
6.根据权利要求5所述的用于单增李斯特菌荧光PCR检测的引物序列，其特征在于所述的引物序列为上游引物LMUF序列为TCTGTTAGCGCAACTTGGTTAAAC和下游引物LMRR序列为TCCGCCTTTGATTGACGTAAT。
7.一种用于检测单增李斯特菌核苷酸片段的探针序列，其特征在于所述的探针序列包括由探针LM-p2序列为CTGGTGTTGATAACAGTAT向5’端方向延伸10个碱基区域范围内得到的探针序列。
8.根据权利要求7所述的用于检测单增李斯特菌核苷酸片段的探针序列，其特征在于所述的探针LM-p2序列为CTGGTGTTGATAACAGTAT。
全文摘要
一种用于单核细胞增生李斯特氏菌核苷酸片段的PCR扩增引物和探针序列。引物序列包括由上游引物LMF1420序列为CTGAATCTCAAGCAAAACCTGGT和下游引物LMR1593序列为CGCGACCGAAGCCAACTA组成的引物对，以及该引物对的上游引物LMF1420向5’端方向延伸10个碱基，向3’端方向延伸10个碱基，下游引物LMR1593向3’端方向延伸9个碱基，向5’端方向延伸5个碱基区域范围内得到的引物序列。探针序列包括由探针LM－p1序列为ATACGATAACATCCACGGCTCTGGCTGG向3’端方向延伸9个碱基和向5’端方向延伸10个碱基区域范围内得到的探针序列。
文档编号C12Q1/68GK1749413SQ200410051208
公开日2006年3月22日 申请日期2004年8月20日 优先权日2004年8月20日
发明者肖性龙, 林镜中 申请人:深圳太太基因工程有限公司