专利名称：一种具有转化黄曲霉毒素活性的解毒酶及编码该酶的基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种具有转化黄曲霉毒素活性的解毒酶及编码该酶的基因。
背景技术：
黄曲霉毒素(Aflatoxin，AFT)是一类毒性很强的真菌毒素，包括致毒基团相同、结构类似的黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1，AFB1)、黄曲霉毒素M1(Aflatoxin M1，AFM1)黄曲霉毒素G1(Aflatoxin G1，AFG1)等，它可以由有毒菌株黄曲霉和寄生曲霉，以及其他一些霉菌(如温特曲霉)等所产生。黄曲霉毒素广泛存在于谷物、饲料、食品中，对人类的主要危害是(1)污染了AFT的食品在食用前如果未能去除AFT，将使进食者直接受害，或者，AFT通过污染的饲料经食物链使进食禽畜肉、奶制品等的人间接受害，直接或间接地引起急性中毒或诱发人类的癌症；(2)禽畜摄入污染的饲料，轻则中毒，直接的后果是引起动物体重下降或引发其他疾病，间接的后果是通过食物链引起人类的慢性中毒，诱发癌症，严重的引起死亡；(3)污染AFT的粮食谷物不能食用或者饲用，因而报废。
由于黄曲霉毒素的危害性，AFT的解毒技术长期以来受到人们的重视，人们已经知道了一些转化AFT的方法，如(1)氨化法。该法用于含水饲料，因处理后食品中含大量的氨，美国FDA规定此法不能用于食品加工，也因饲料中含有大量的氨而影响了使用。(2)NaOH法(用于植物油粗炼去AFT)。因设备投资大、油耗大、成本高，现已逐渐被淘汰。(3)白土吸附法。因操作劳动强度大及白土尘埃和油耗以及对环境污染等问题，现已基本被淘汰。(4)混合溶剂萃取法，该方法用于如花生粉，棉籽等固态食品的AFT去除，但在萃取、溶剂回收和处理时花费昂贵，无推广应用价值。(5)高温法。该法是通过对被处理的样品加热到268℃以上来破坏AFT，因该法通常的加热法较难达到此温度，而过高温度会破坏食品中的其他营养成分，故实际应用很少。(6)生物学法。利用活菌或固定化菌分解AFT，因活菌会分解原料的营养而且对分解后的新产物不清楚，对新产物的毒性情况不了解，此方法只用于极少数的饲料和花生油的解毒。如1996年广东微生物所报道用Aspergillusniger菌固态发酵后制备BDA生物制剂用于解毒。(7)紫外线照射法。利用紫外线的强氧化作用来破坏AFT，效果不稳定，且能耗大。(8)超滤-渗滤法，这种方法只能用于非均相，对于均相、酸化牛奶无效，更因工艺要求苛刻，设备十分昂贵，至今无实际应用价值。(9)生物酶法，有学者报道(Brown DW，etc.Proc.Natl.Acad.Sc.USA.1996)在大肠杆菌中克隆表达肝细胞色素氧化酶P450，以期通过增强黄曲霉毒素代谢的氧化酶用于对进入体内的被活化的AFT的转化解毒，来达到降低进入体内的AFB1的目的。
上述处理方法中，由于使用物理化学的手段转化AFT的方法通常比较强烈，经处理后的谷物、饲料、食品等其利用价值大大降低，而且效率也相对较低，从成本方面考虑并不是工业应用的理想方法，另外，体内提高P450氧化酶的方法虽然能增强AFB1的代谢，但也增强了AFB1的对人的危险性。而生物酶催化方法，由于其具有专一性更强、转化效率高的特点，人们正在进行研究开发可以直接转化AFT的生物酶。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有转化黄曲霉毒素活性的解毒酶及编码该酶的基因。
为了得到这种酶，发明人从筛选得到的一株产酶菌中纯化出能转化AFB1的生物酶，并在一种转化体中借助重组DNA技术生产了具有转化AFB1活性的蛋白。由此，发明人首先分离并纯化出了具有该活性的新型蛋白，命名为黄曲霉毒素解毒酶(Aflatoxin-detofizyme，ADTZ)。
本发明通过纯化和测序获得黄曲霉毒素解毒酶(aflatoxin-detoxifizyme，ADTZ)的基因特异性引物，从假蜜环菌(Armillariella tabescens)的总RNA出发，克隆得到编码ADTZ的基因，该基因是从未报道过的新基因；并利用基因工程的方法，在毕赤酵母表达系统中表达并纯化出重组ADTZ蛋白。所选择的真菌是Armillariella tabescens，采自中国普通微生物菌种保蒇管理中心。
ADTZ的纯化首先通过菌体破碎，硫酸铵沉淀法进行蛋白质沉淀，沉淀样品通过快速蛋白质液相色谱层析得到目的峰。ADTZ短肽N末端氨基酸序列的获得将目的峰进行质谱分析获得短肽N末端氨基酸序列。
本发明对假蜜环菌的总RNA的进行提取。根据所获得的短肽N末端氨基酸序列设计引物进行RT-PCR和SMART RACE，得到ADTZ基因的序列长约2.3kb，经分析序列含有完整的开放阅读框，3’端和5’端的非翻译区。编码ADTZ成熟肽的全长cDNA 2088个核苷酸碱基，编码695个氨基酸，分子量约为73～77kDa(SDS-PAGE电泳)，等电点pI在5.3～6.8之间(等电聚焦电泳)。氨基酸及DNA序列如序列表所示。其修饰产物，例如部分氨基酸发生去除、取代、修饰或加成后所产生的产物，也包括在本发明所述的蛋白范围之内。
本发明的另一目的是提供包含所述基因的表达载体，以及用所述的表达载体转化宿主细胞所得的转化体。本发明进一步提供了一种制备黄曲霉毒素解毒酶的方法，包括以下步骤培养所述转化体，回收所表达的黄曲霉毒素解毒酶。
本发明通过设计一对引物，将编码ADTZ成熟肽的基因从假蜜环菌的cDNA中扩增出来，克隆到真核整合型分泌表达载体，如pHIL-S1上，构建成表达质粒pHIL-S1-ADTZ，并将重组表达载体转化毕赤酵母GS115。此表达载体以AOX为启动子。通过对培养时间和诱导时间的摸索，ADTZ的表达量占培养基总蛋白的25％以上，并且处于可溶状态。
本发明所用的真核表达载体还可选用胞内型载体PAO815、PPIC3K、PPICZ、PHWO10、PGAPZ，或者分泌型载体PPIC9K、PPICZα、PGAPZα，或者市面上销售的同类载体。所用的真核表达菌株也可以选用毕赤酵母菌KM71、MC100-3、SMD1168、SMD1165、SMD1163等作为宿主细胞。
本发明也可用原核表达体系来实现，选用表达载体pET、pUCH33等，或者市面上销售的同类载体；选用原核表达菌株大肠杆菌BL21、大肠杆菌JM109等作为宿主细胞。
表达载体的复制方法参照Sambrook等的方法(Sambrook，et al.2002，Molecularcloning.Cold Spring Harbor Laboratory Press.USA)，按CaCl2法制备并转化感受态细胞E.Coli.DH5α，用含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB培养基培养细菌，碱法提取质粒。
本发明还摸索了重组ADTZ的纯化条件，发酵液经硫酸氨沉淀后采用疏水色谱层析和金属亲和色谱层析两步纯化法得到重组ADTZ，重组蛋白纯度达95％以上。
本发明的另一目的是提供将所述的具有转化黄曲霉毒素活性的解毒酶在制备饲料或食品中黄曲霉毒素除毒产品的应用。结合目前的饲料和食品的加工工艺，可将本发明所述的具有转化黄曲霉毒素活性的解毒酶，作为脱毒剂添加到饲料中进行饲料脱毒，或者制成固定化酶用于如花生油的脱毒。
本发明的另一目的是提供将所述的具有转化黄曲霉毒素活性的解毒酶在制备预防和治疗由黄曲霉毒素诱发的肿瘤的药物的应用。结合目前的抗肿瘤药物的制备工艺，可添加本发明所述的具有转化黄曲霉毒素活性的解毒酶，得到用于预防和治疗由黄曲霉毒素诱发的肿瘤的药物。
发明人首次分离和离析出了编码该蛋白的基因。另外，发明人还将所述基因整合到一种表达载体中以产生一种转化体，并且借助于该转化体成功地实现了ADTZ蛋白的生产。通过活性鉴定实验，证明重组ADTZ具有与天然ADTZ相似的转化AFB1的生物活性。通过重组ADTZ对AFB1解毒生物学活性的鉴定实验，证明重组ADTZ能降低AFB1的致畸变作用，具有抗AFB1引起突变的生物活性作用。本发明为今后在饲料加工、食品加工以及抗肿瘤药物开发打下了良好的基础。
图1为纯化的ADTZ PAGE电泳结果。M是标准分子量蛋白；1、2是BSA(小牛血清白蛋白)；3是硫酸氨沉淀的粗酶组分；4是纯化的ADTZ。
图2为纯化的ADTZ转化AFB1作用的薄层色谱检测结果。1是AFB1标准品；2、3是PBS缓冲液对照组；4是灭活ADTZ处理AFB1对照组；5ADTZ处理AFB1组；6是AFB1标准品。
图3为假蜜环菌总RNA电泳结果。
图4为RT-PCR产物电泳。M为DNA Marker；E1为RT-PCR产物。
图5为重组载体pTE1的酶切鉴定。MDNA Marker；1为Pte1/HindIII+EcoRI2为pTE1/EcoRI；3为pTE1/HindIII。
图6为3’RACE产物的电泳检测。M为DNA Marker；E2为3’RANCE产物。
图7为重组载体pTE2的酶切鉴定。M为DNA Marker；1为pTE2/HindIII+EcoRI；2为pTE2/EcoRI；3为pTE2/HindIII。
图8为5’RACE产物的电泳检测。M为DNA Marker；E3为5’RACE产物。
图9为重组载体pTE3的酶切鉴定。M为DNA Marker；1为pTE3/HindIII+EcoRI；2为pTE3/EcoRI；3为pTE3/HindIII。
图10为End to end PCR产物电泳检测。M为DNA Marker；ADTZ’为PCR产物。
图11为重组载体pSA的酶切鉴定。M为DNA Marker；1为pSA/BamHI+EcoRI；2为pSA/HindIII；3为pSA/SacI。
图12为表达产物的SDS-PAGE分析结果。1为诱导96小时的阴性对照菌；2为标准分子量蛋白；3为BSA(小牛血清白蛋白)；4为诱导24小时的重组菌；5为诱导48小时的重组菌；6为诱导72小时的重组菌；7为诱导96小时的重组菌。
图13为重组ADTZ转化AFB1活性TLC检测。1为AFB1标准品对照；2为重组ADTZ处理AFB1组样品；3为灭活的重组ADTZ处理AFB1组照样品。4缓冲液对照。
图14为ADTZ重组子的构建及其与毕赤酵母菌同源重组的流程图。
具体实施例方式
实施例一、ADTZ的获得与纯化一、菌体的发酵培养1、菌种Armillariella tabescens。
2、将上述菌种于液体培养基(马铃薯提取液1升、葡萄糖20.0克、KH2PO43.0克、MgSO4·7H2O 1.5克、维生素微量，pH6.6)中培养共25天，一级至三级分别培养6天、4天、4天，四级培养11天，培养温度为24-28℃，收集菌体。
二、黄曲霉毒素解毒酶(ADTZ)的提取新鲜菌体液氮冰冻后敲成小块，1∶1(W/V)加入磷酸盐缓冲液，冰浴中匀浆，超声破碎细胞，11000-12000g离心去沉淀物，以20-80％饱和的硫酸铵分级沉淀，取沉淀。以pH6.0，0.02mol/L磷酸缓冲液溶解悬浮，定蛋白(Bradford法)，用AFB1ELISA试剂盒检测蛋白组分的酶活力，得含黄曲霉毒素解毒酶(ADTZ)酶液。
三、ADTZ的纯化(一)酶样品的准备粗酶液用40倍体积的磷酸缓冲液(pH6.0，0.02mol/L)透析脱盐，聚乙二醇-20000透析浓缩，0.45μm微膜过滤，定蛋白(Bradford法)。
(二)快速蛋白质液相色谱(FPLC)纯化酶根据文献(Ion Exchange Chromatography principles and methods.Pharmacia Co.Edited，Pharmacia Co.，1984，pp.29～31；和Chromatofocusing with PolybufferTMand PBETM，6.Experimental.Pharmacia Co.Edited，Pharmacia Co.，1984，pp.11～24)报道方法选择离子交换色谱和等电聚焦色谱柱填料及缓冲液，按操作要求离子交换色谱以及聚焦色谱均在FPLCSystem(Pharmacia Biotech Co.美国)上进行。具体做法如下1.阴离子交换色谱(1)试剂pH6.0，0.2mol/L磷酸盐储存缓冲液。
A液pH6.0，0.02mol/L的磷酸缓冲液。
B液pH6.0，0.02mol/L+1N NaCl的磷酸缓冲液。
(2)柱子的准备DEAE-Sephadex 50ml，以2倍体积磷酸盐缓冲液充分搅拌洗涤后，静置20分钟，以微型真空泵抽去上清，同样操作，反复洗涤，再以同样条件反复洗涤5次，以0.6ml/min的流速装柱。柱规格20×30cm.
以A液平衡该柱至基线稳定在零附近。酶样品20ml(含蛋白2mg/ml)，上预柱，过DEAE-Sephadex离子交换柱。氯化钠梯度洗脱以A液洗脱2小时，A液及0-80％的B液洗脱5小时，100％B液洗脱2小时。流速0.6ml/min。以分部收集器收集。紫外O.D.280nm监测。聚乙二醇-20000透析浓缩，脱盐后，定蛋白(Bradford法)，分别测定各蛋白组分转化AFB1活性，收取活性组分。重复以上操作，收集活性组分。
2.聚焦层析(1)试剂洗脱液PolybufferTM74(Pharmacia Co.产品)，250ml装。取100ml加纯水稀释至1000ml，4℃保存备用。
起始缓冲液pH7.4，0.025mol/L咪唑-HCl缓冲液。
(2)柱子Mono-pTMPBE 94，5×20cm预装柱(Pharmacia Co.产品)。
经上述离子交换色谱纯化后的酶液6mL(含蛋白3mg/mL)，以Polybuffer 74平衡该酶液(平衡后为6.5ml)。以起始缓冲液平衡Mono-p柱2小时，以Polybuffer 74洗脱液过柱，上2ml酶液样品，以Polybuffer 74洗脱液洗脱10小时。流速0.2ml/min。紫外O.D.280nm监测并记录色谱图，以分部收集器接收，设定2ml/管，即10分钟/管。定蛋白(Bradford法)，分别测定各蛋白组分转化AFB1活性。收集活性组分。
以0.1mol/L盐酸洗柱子至AU值回零，再以1mol/L NaCl洗柱子至AU值回零，以起始缓冲液平衡柱子过夜。同上条件重复聚焦色谱操作，收集活性组分。
3、用ELISA法检测活性组分将收集到的各组分分别处理AFB1，用ELISA检测处理后样品中AFB1的量，用100℃煮沸10分钟的相同组分作对照，能使AFB1减少的组分为活性的组分。具体做法如下(1)样品的制备灭活酶液组AFB1200ul(浓度2.5ng/ml甲醇)+灭活酶液200ul(1.2mg/ml)活性酶液组AFB1200ul(浓度2.5ng/ml甲醇)+活性酶液200ul(1.2mg/ml)质控组AFB1200ul(浓度2.5ng/ml甲醇)+缓冲液200ul(1.2mg/ml)灭活酶液的制备组分在100℃煮沸10分钟。
混匀，30℃反应30min，100℃煮沸15min，3000g离心5min去沉淀，制备好样品后按ELISA试剂盒(AgraQuantTM Total Aflatoxin Assay 4/40，ROMER公司产品，美国)操作说明书操作，由标准曲线计算处理后产物中含有的AFB1。检测收集的各组分，能使样品中AFB1减少的组分为有活性的组分。检测结果有活性组分的活性酶液处理的样品中AFB1为1.230±0.508ng/ml，有活性组分的灭活性酶液处理的样品中AFB1为2.436±0.326ng/ml，质控组为2.508±0.203ng/ml。
活性峰在非还原性条件下进行电泳(PAGE)表明它为单一谱带。结果如图1。
所得蛋白经SDS-PAGE电泳分析分子量约为73～76kDa；等电聚焦电泳分析等电点pl约为5.3～6.8。
实施例二纯化的ADTZ活性鉴定一、ADTZ转化AFB1活性的鉴定依据中国预防医学科学院标准处(食品卫生国家标准汇编 中国预防医学科学院标准处编，北京，中国标准出版社，1998年版，pp410～415)和翟永信(薄层色谱在食品分析中的应用，翟永信、陆冰真编，北京大学出版社，1991年版，pp118～123)报道的方法，用薄层色谱法对由ADTZ处理的AFB1进行检测，鉴定纯化到的ADTZ活性。具体做法如下1、实验组取1支1.5ml的离心管，加入1μL AFB1溶液(AFB1甲醇溶液0.5μg/μL，黄曲霉毒素B1，Alexis Biochemicals Inc.，Switzerland)，氮气挥干。分别加入ADTZ酶液(蛋白含量0.1mg/mL)300μL、MgSO40.5μL、PEG200 10μL，充分混匀。30℃水浴，反应1小时，以后每小时向各加入0.5μL AFB1溶液，直至管内AFB1总量为2μg。加毕后，再继续反应2小时。
2、对照组取1支1.5ml的离心管，标记对照组1加入1μL AFB1溶液，氮气挥干，分别加入300μL酶液(预先以100℃水浴5分钟灭活)、MgSO40.5μL、PEG200 10μL，充分混匀。另取1支1.5ml的离心管，标记对照组2加入1μL AFB1溶液，氮气挥干，分别加入PBS缓冲液(0.1M pH6.6)300μL、MgSO40.5μL、PEG200 10μL，充分混匀。后续操作与实验组相同。
以上实验组和对照组用反应后，各加入2倍体积的氯仿进行萃取2次，于45℃，氮气下挥干萃取物，加入1ml的甲醇充分溶解萃取物，得实验组样品(活性酶组)、对照组1(灭活酶组)和对照组2(缓冲液对照组)。
3、薄层色谱(TLC)检测反应产物取新活化(100℃ 2小时)的预制硅胶薄层板(10×10cm，60，Whatman，USA)，在薄层板上点样点距边缘1cm，点间距1cm。从左到右第1点10μL 25μg/ml的AFB1氯仿溶液；第2、3点各为10μL对照组2；第4点10μL 2号对照组1；第5点10μL实验组；第6点10μL 25μg/ml的AFB1氯仿溶液。
展开在展开槽内加10ml无水乙醚展开，取出挥干。
观察在365nm波长紫外光下观察荧光，拍照，结果如图2所示。
结果显示AFB1标准品(1、6)以及酶的灭活对照(4)和PBS缓冲液对照(2、3)，乙醚展开时都只发生微小的迁移，而用ADTZ处理后的AFB1产物Rf值则接近1(＝0.95)，表明解毒处理后的AFB1其极性显著减小，与AFB1明显不同，说明纯化得到的ADTZ具有转化AFB1的活性。
二、ADTZ对AFB1解毒生物学活性的鉴定微生物回复突变实验(Ames实验)参照中华人民共和国卫生部药政局颁布的方法[中华人民共和国卫生部药政局编，新药(西药)临床研究指导汇编(药学、药理学、毒理学)，1993年7月]进行。具体做法如下1.测试菌株为组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌株TAg8(引自卫生部药品生物制品检定所)，-85℃(零下85℃)低温冰箱保存，测试前对采用的菌株进行基因型鉴定及自发回变数测定，生物学鉴定合格，符合实验要求。
2.肝S9的制备(1)SD大鼠诱导SD大鼠检疫一周确定无病，用多氯联苯混悬于玉米油，腹腔注射(500mg/kg体重)，5天后处死，处死前12小时禁食。
(2)S9组分的制备经上述诱导的SD大鼠断头放血，无菌下取肝，称重，肝脏用冷0.15mol/L(下同)KCl漂洗。以1g肝脏加3ml的比例在均浆器中均浆，每份组织的均浆时间保持一致。将均浆液在0℃，经9000g离心20分钟，取上清液，经证明无菌后，存-85℃冰箱备用。
3.S9混合液的制备将下列A、B、C液和S9组分混合，保存4℃下4小时内使用。
A液(0.2mol/L辅酶II，过滤灭菌)0.2ml。
B液(0.2mol/L 6-磷酸葡萄糖过滤灭菌)0.25ml。
C液8.55ml。
C液组成(0.4mol/L MgCl2，20ml 1.65mol/L KCl 20ml，0.2mol/L磷酸缓冲液(pH7.4)500ml，蒸馏水315ml，混和后过滤灭菌)。
S9组分1.00ml。
4.受试样品的制备在反应体系为30ml的系统中，ADTZ浓度为0.2mg/ml，AFB1的浓度为0.2μg/ml，pH值6.0，于28℃下反应120min，体系放大10倍。反应后，以等体积氯仿萃取黄曲霉毒素B1后产物及未反应的残留底物3次，合并有机相，40℃减压挥干氯仿，分别以3.75和3mlDMSO洗出提取物(活性酶处理反应组)；以预先用氯仿灭活的ADTZ代替活性ADTZ，在同条件下处理黄曲霉毒素B1(灭活酶处理对照组)；以缓冲液代替活性ADTZ酶液，在同条件下处理黄曲霉毒素B1(缓冲液处理对照组)。以上样品均在-15℃下保存备用。
5.回复突变实验将受试样品的DMSO溶液与培养过夜的菌液及S9一起加入上层软琼脂培养基中，混匀，在40℃下倒在底层Vogel选择培养基上，待凝固后于37℃温箱中培养72小时，计算每个培养皿出现的回复突变菌落数。
每批测试时每组提取液及阴阳性对照均设3个平皿，并重复1次，各组提取液结果为2次6组平均值。实验结果以回复菌落数、突变率(MR＝样品回变菌落数/阴性对照回变菌落数)和抑制率(％)[＝{1-(被试物回变菌落数-阴性对照组回变菌落数)/(AFB1对照组回变菌落数-阴性对照组回变菌落数)}×100％]表示。
6.结果评价标准若溶剂对照组在正常范围内，受检物在3个浓度以上有阳性剂量反应，最大增加值为溶剂对照值的两倍(即MR≥2)，可考虑为致突变阳性。
7.结果活性ADTZ处理反应组的细菌回复突变菌落数与阴性对照组(DMSO对照组)相近(MR值均小于2)。缓冲液处理对照组和灭活ADTZ处理对照组的细菌回复突变菌落数明显高于阴性对照组(MR值均大于2)，与阳性对照(黄曲霉毒素B1对照)的细菌回复突变数无显著性差异。表明活性ADTZ处理反应组受试物无诱发基因突变作用。说明ADTZ具有抗AFB1引起突变的生物活性作用。结果如下表。
黄曲霉毒素B1经酶处理后的细菌突变回复试验
上表说明诱变实验以含有大鼠肝S-9混合物的Salmonella typhimuriurmn TA98为供试菌进行。用于诱变实验的AFB1对照组的浓度为0.8μg/50μl DMSO/平板。而AFB1酶处理后的样品每板也以相当于同样量的AFB1进行实验，并保持同样量的DMSO。平板培养28hr后，计数，结果以四个平板的平均值±SD表示。
实施例三 ADTZ短肽氨基酸序列的获得收集实施例一纯化所得的活性组分的峰尖，或将活性组分用PAGE电泳收集目的带，采用Q-TOF2(电喷雾—四极杆飞行时间—串联质谱)仪(英国Micromass公司，由军事医学科学院仪器测试分析中心提供)进行ADTZ短肽N末端的氨基酸序列检测。所测得的氨基酸序列如下M1EAWEGFTALVDK M2NKLLQDANGELENLYVR本发明的ADTZ短肽氨基酸序列不限于上述所列，它还包含其他短肽氨基酸顺序片段，只要该片段是用MALDI-MS-TOF或其他化学方法等检测ADTZ而获得。
实施例四产酶菌总RNA的提取将产酶菌菌体组织放入预冷过的研钵中，加入液氮研磨，至样品为粉末状，取100mg左右样品转至1.5ml离心管中，加入1ml的Trizol，振荡混匀，室温静置5分钟，加入200μl氯仿，振荡混匀2分钟，冰浴5分钟，2-8℃，12000×g，离心15min，转移上清至另一1.5ml离心管。加入500μl预冷的异丙醇，冰浴静置20min，2-8℃，12000×g，离心10min，弃上清，加入1ml预冷的75％乙醇，洗涤沉淀及离心管壁，2-8℃，7500×g，离心5min，弃上清，空气干燥5-10min，加入50μl DEPC无菌水，至完全溶解，进行紫外分析及电泳检测(1.1％Agarose/EB 100V 20min)，样品保存于-80℃。结果如图3所示，从电泳检测结果中可看到28s rRNA和18s sRNA两条特征谱带条带清晰，亮度比接近2∶1，说明总RNA没有降解。
实施例五、ADTZ基因特异性引物的获得从实施例三所得到的ADTZ短肽氨基酸序列设计2对引物(P1、P2和G1、G2)。参照QIAGEN OneStep RT-PCR Kit(QIAGEN Inc.美国)手册进行RT-PCR以获得ADTZ基因部分序列的产物。切胶回收RT-PCR产物，并按常规方法进行TA克隆，用HindIII和EcoRI酶切鉴定TA克隆的重组质粒，1.5％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。将重组质粒进行测序，得到ADTZ基因的cDNA片段E1。具体做法如下引物对1 引物对2P15’-TGGGARGGNTTYACNGC-3’G15’-CARGAYGCNAAYGGNGA-3’P25’-TCNCCRTTNGCRTCYTG-3’G25’-GCNGTRAANCCYTCCCA-3’本发明扩增ADTZ基因特异性引物的引物对不限于以上的P1与P2，G1与G2，它还包含其他的引物对，只要该引物对是由上方法获得的ADTZ短肽氨基酸序列所设计。
(一)RT-PCR的步骤
1、将模板总RNA(由实施例四获得)于75℃变性5min，迅速插入冰中冷却，2、准备Master Mix(80μl总体系)42μl RNase-free Water16μl 5×QIAGEN OneStep RT-PCR Buffer3.2μldNTP Mix (10mM)3.2μlQIAGEN OneStep RT-PCR Enzyme Mix64.4μl抽吸混匀，短暂离心；3、按照下表所示顺序添加各组分至0.5ml无菌离心管中(单位μl)
4、PCR循环程序·Reverse transcription 50℃ 30min·Initial PCR activation step50℃ 15min·3-step cycling·15 cycles 94℃ 40sec65℃ 1min (-1℃/cycle)72℃ 1min·25 cycles 94℃ 40sec50℃ 1min72℃ 1min·Final extension70℃ 10min5、循环结束后取5μl样品电泳检测。
(二)切胶回收RT-PCR产物1.配制的TAE电泳缓冲液，并配制0.8％琼脂糖凝胶；2.将50μl的RT-PCR产物与10×loading buffer按比例混合，上样；3.100V，电泳20min；4.电泳结束后，在紫外灯下观察条带位置，切下目的带，转移至一个新的灭菌的1.5ml的离心管中；5.加入800μlBuffer NT1；6.漩涡振荡NucleoTrap Suspension，使小珠完全悬浮后，取10μl加入离心管中；7.将离心管在50℃水浴6min，期间每隔2min短暂漩涡振荡；8.室温下，10000×g，离心30s，弃上清；9.加入500μl Buffer NT2，短暂漩涡振荡，室温下，10000×g，离心30s，弃上清。重复此步骤一次。
10.加入500μl Buffer NT3，短暂漩涡振荡，室温下，10000×g，离心30s，弃上清。重复此步骤一次。
11.再次10000×g，离心30s，弃上清，空气中干燥10-15min；12.加入30μlTE Buffer(pH8.0)，重悬沉淀。回收的片段命名为“E1”。RT-PCR产物的电泳检测。结果如图4所示，显示引物对P1和P2的反应结果中获得一个条带，条带位置约于800bp左右，命名为E1片段。
(三)TA克隆与测序1 连接在1.5ml新的灭菌的离心管中加入下列成份1μlpUCm-T载体3μlE1片断(RT-PCR回收产物)1μl10×buffer1μlT4 DNA连接酶加4μl的无菌水补充总体积至10μl；抽吸混匀，短暂离心，22℃水浴4h以上。
2 CaCl2法制备E.coli DH5α感受态细胞挑取DH5α单克隆于2mlLB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。从活化的新鲜DH5α菌液中取50μl接种于5mlLB液体培养基中，37℃振荡培养1.5-2h，冰浴30min，将菌液转移至无菌离心管中，5000rpm，离心5min，弃上清，取1.5ml冰浴的无菌CaCl2加入离心管，悬浮菌体，冰浴10min，5000rpm，离心5min，弃上清；加入200μl冰浴的无菌CaCl2加入离心管，悬浮菌体，保存于4℃下备用。
3 转化DH5α感受态细胞取感受态细胞200μl加入含10μl连接物的离心管中，混匀，冰浴30min；42℃水浴90s；立即冰浴3-5min；加入800μl LB液体培养基，37℃温育40-60min；将一转化的感受态细胞涂布于含有Amp及IPTG/X-gal的LB固体培养基上，每个90mm平板涂布200μl，37℃振荡培养12-16h。
4 碱提质粒DNA
挑取转化的单菌落，接种到2ml的含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃剧烈振荡培养过夜。取1.5ml菌液于微量离心管中，12000rpm离心2min，弃上清；取400μl STE溶液洗菌体，漩涡振荡混匀，12000rpm离心2min，弃上清；加入100μl预冷溶液I于沉淀菌体中，剧烈振荡混匀；加入200μl新鲜配制的溶液II，立即快速颠倒混匀，冰浴3min；加入150μl预冷溶液III，反复颠倒混匀，冰浴5min；12000rpm离心5min，上清移至另一管中；加入等体积酚仿，颠倒混匀，12000rpm离心5min；小心吸取上清转移至另一管中；加入两倍体积的预冷无水乙醇，颠倒混匀，室温静置40-60min；12000rpm离心10min，弃上清；加入200μl 70％乙醇，漂洗沉淀，12000rpm离心1min，弃上清；打开管盖空气中干燥5-10min，加入30μl无DNA酶的RNA酶的TE溶解沉淀，37℃温育1h。贮存于-20℃。
5 酶切鉴定重组质粒pTE1用HindIII和EcoRI酶切鉴定TA克隆的重组子，如下表(单位μl)
37℃酶切4h以上。1.5％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，结果如图5，重组载体pTE1的酶切鉴定，HindIII+EcoRI双酶切(1号样品)和HindIII单酶切(3号样品)均切下400bp多的条带，且前者的亮度比后者高，EcoRI单酶切将重组子切成线性(2号样品)，表明E1片断中央位置存在一个HindIII酶切位点。
6 测序重组质粒PEG纯化法(Sambrook，et al.1989，Molecular cloing.Cold Spring HarborLabroratory Press.USA)提取质粒DNA。以T7和SP6为测序引物，采用ABI377 DNASequencer DNA自动序列仪(由上海博雅公司提供)，正反向进行测定，得到E1片段核酸序列。测序结果序列包含引物P1和P2序列，在中间位置出有一个aagctt的HindIII酶切位点。
实施例六编码ADTZ全长cDNA序列的获得根据实施例五已获得的ADTZ基因部分序列E1片段设计引物S1(5’-TAGGCGAAGTGTCGTCGTCAATGGAA-3’)、S3(5’-GAAGTTATCGGCTTTCCAGTCAGAGGGT-3’)分别作为3’RACE和5’RACE的引物，按SMARTTMRACE cDNA amplification Kit(COLONTECH Laboratories，Inc.Cat.No.K1811-2)手册进行3’RACE和5’RACE。切胶回收RACE产物，并按常规方法进行TA克隆，用HindIII和EcoRI酶切鉴定TA克隆的重组子，1.5％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。将重组质粒送交测序公司进行测序，得到两个片断E2、E3，利用NCBI的VecScreen(BLASTN2.2.5)程序(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/VecScreen.html)识别去除载体序列，用DNAMAN程序(美国Lynnon BioSoft公司的软件)将E1、E2、E3拼接，将得到的序列用NCBI的ORF Finder程序(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)进行开放阅读框分析，得到了编码ADTZ成熟肽的ADTZ基因的全长cDNA序列。具体如下引物S15’-TAGGCGAAGTGTCGTCGTCAATGGAA-3’引物S35’-GAAGTTATCGGCTTTCCAGTCAGAGGGT-3’一、3’RACE(一)3’RACE-Ready cDNA的制备1.将模板总RNA于75℃变性5min，迅速插入冰中冷却；2.在一个0.5ml灭菌离心管中加入以下试剂1μl变性的模板总RNA1μl3’-CDS Primer A加3μl的无RNA酶的无菌水补充体积到5μl；3.抽吸混匀，并短暂离心使混合液位于管底；4.70℃，温浴2min；5.冰浴2min，稍稍离心后加入下列试剂2μl 5×First-Strand Buffer1μl DTT(20mM)1μl dNTP Mix(10mM)1μl PowerScript Reverse Transcriptase10μl总体积6.轻轻抽吸混匀试剂并稍稍离心；7.温箱中42℃温浴1.5h；8.用100μlTricine-EDTA buffer稀释产物；9.72℃温育7min；10.样品存于-20℃。
(二)3’RACE的步骤1.准备Master Mix(100μl总体系)69μlPCR-Grade Water10μl10×Advantage 2 PCR Buffer2μl dNTP Mix(10mM)2μl 50×Advantage 2 Polymerase Mix83μl
抽吸混匀，短暂离心；2.按照下表所示顺序添加各组分至0.5ml无菌离心管中(单位μl)
3.PCR循环程序·5 cycles94℃ 5sec72℃ 3min·5 cycles94℃ 5sec70℃ 10sec72℃ 3min·35 cycles 94℃ 5sec68℃ 10sec72℃ 3min4.循环结束后取5μl样品电泳检测，结果如图6所示，显示3’RACE获得一个一条带的产物，产物带位于分子量约800bp处，命名为E2片段。
(三)切胶回收3’RACE产物，TA克隆，CaCl2法制备E.coli DH5α感受态细胞，转化DH5α感受态细胞，碱提质粒DNA(实验操作同前面实施例五的内容)。
(四)酶切鉴定重组质粒pTE2用HindIII和EcoRI酶切鉴定TA克隆的重组子，如下表(单位μl)
37℃酶切4h以上。1.5％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，结果如图7所示，重组载体pTE2的酶切鉴定，HindIII+EcoRI双酶切(1号样品)切下两条带分别位于600bp和300-400bp左右，HindIII单酶切(3号样品)切下一条带约300-400bp，EcoRI单酶切将重组载体切成线性(2号样品)，E2片断中存在一个HindIII酶切位点，位置约靠近片断的某一侧。
(五)测序重组质粒PEG纯化法(Sambrook，et al.1989，Molecular cloing.Cold SpringHarbor Labroratory Press.USA)提取质粒DNA。以T7和SP6为测序引物，采用ABI377DNA Sequencer DNA自动序列仪(由上海博雅公司提供)，正反向进行测定，得到2段核酸序列。得到的E2序列，在偏3’位置存在一个AAGCTT的HindIII酶切位点。
二、5’RACE(一)5’RACE-Ready cDNA的制备1.取出模板总RNA于75℃变性5min，迅速插入冰中冷却；2.在一个0.5ml灭菌离心管中加入以下试剂1μl变性的模板总RNA1μl5’-CDS Primer A1μlSMART IIA Oligonucleotide加2μl的无RNA酶的无菌水补充体积到5μl；2.抽吸混匀，并短暂离心使混合液位于管底；3.70℃，、温浴2min；4.冰浴2min，稍稍离心后加入下列试剂2μl5×First-Strand Buffer1μlDTT(20mM)1μldNTP Mix(10mM)1μlPowerScript Reverse Transcriptase10μl 总体积5.轻轻抽吸混匀试剂并稍稍离心；6.温箱中42℃温浴1.5h；7.用100μlTricine-EDTA buffer稀释产物；8.72℃温育7min；9.样品存于-20℃。
(二)5’RACE步骤1.准备Master Mix(110μl总体系)75.9μlPCR-Grade Water11μl 10×Advantage 2 PCR Buffer2.2μl dNTP Mix(10mM)2.2μl 50×Advantage 2 Polymerase Mix91.3μl抽吸混匀，短暂离心；2.按照下表所示顺序添加各组分至0.5ml无菌离心管中(单位μl)
3.PCR循环程序· 94℃ 1min·5 cycles94℃ 30sec72℃ 4min·5 cycles94℃ 30sec70℃ 4min·25 cycles 94℃ 30sec68℃ 4min· 72℃ 10min4.循环结束后取5μl样品电泳检测，得到5’RACE产物E3。结果如图8所示，显示5’RACE获得一个单条带的产物，条带位置约于1400-1800bp左右，命名为E3片段。
(三)切胶回收5’RACE产物，TA克隆，CaCl2法制备E.coli DH5α感受态细胞，转化DH5α感受态细胞，碱提质粒DNA(实验操作同实施例五的内容)。
(四)酶切鉴定重组质粒pTE3用HindIII和EcoRI酶切鉴定TA克隆的重组子，如下表(单位μl)
37℃酶切4h以上。1.5％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，结果如图9所示，重组载体pTE3的酶切鉴定，HindIII+EcoRI双酶切(1号样品)出现两条带分别位于1400-1000bp和300-400bp左右，HindIII单酶切(3号样品)出现一条带约1400-1000bp，E3片断中能存在一个HindIII酶切位点。
(五)测序挑取重组质粒PEG纯化法(Sambrook，et al.1989，Molecular cloing.Cold SpringHarbor Labroratory Press.USA)提取质粒DNA。以T7和SP6为测序引物，采用ABI377DNA Sequencer DNA自动序列仪(由上海博雅公司提供)，正反向进行测定，得到E3片段核酸序列。得到的E3片段，在偏向5’位置存在一个HindIII酶切位点，在3’末端存在一个HindIII酶切位点。
三、ADTZ cDNA序列的拼接利用NCBI的Vecscreen程序识别去除载体序列，用DNAMAN程序将E1、E2、E3拼接，将得到的序列用NCBI的ORF Finder程序进行开放阅读框分析，得到序列长度为2.3kb，含有完整开放阅读框，有3’末端的poly(A)尾巴，并包含5’端和3’端的非翻译区。结果见图序列SEQ ID NO2。将ADTZ核苷酸序列和推测的氨基酸序列通过因特网进行BLASTA序列相似性查询，程序BLAST和BLASTX(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，结果表明ADTZ为一全新的基因，由其推算出的编码ADTZ的成熟肽氨基酸序列在GENEBANK中找不到相同的序列，为一全新的氨基酸序列。
编码ADTZ全长cDNA序列的获得不限于用实施例六所述的方法，用ADTZ短肽氨基酸序列设计探针从Armillariella tabescens的cDNA文库中克隆该序列也包含在内。
实施例七编码ADTZ成熟肽cDNA产物的获得分析实施例六所得编码ADTZ全长cDNA序列的两端序列，设计了一对引物P35’-GTCGAATTCATGGCCACCACAACTGTC-3’P43’-GTAACTCTCTGCTAACACTCCTAGGGAC-5’以获得从起始密码子开始到终止密码子的ADTZ开放阅读框序列，并在引物上分别添加限制酶切位点EcoRI(GAATTC)和BamHI(GGATCC)。按常规方法进行PCR扩增，切胶回收PCR产物。具体如下1.准备Master Mix(100μl总体系)69μlPCR-Grade Water10μl10×Advantage 2 PCR Buffer2μl dNTP Mix(10mM)2μl 50×Advantage 2 Polymerase Mix83μl抽吸混匀，短暂离心；2.按照下表所示顺序添加各组分至0.5ml无菌离心管中(单位μl)
3.PCR循环程序· 94℃ 1min·5 cycles94℃ 30sec72℃ 4min·5 cycles94℃ 30sec70℃ 4min·35 cycles 94℃ 30sec68℃ 4min· 72℃ 10min4.循环结束后取5μl样品电泳检测，结果如图10所示，显示PCR获得一个一条带的产物，条带位置约于1800bp左右，命名为ADTZ’片段。
5.切胶回收PCR产物按常规的PCR产物回收方法进行。得到含编码ADTZ成熟肽的cDNA，此片断命名为“ADTZ’”。
实施例八重组质粒ADTZ表达质粒的构建基因克隆按常规方法(Sambrook，et al.2001，Molecular Cloning A LaboratoryManual.Cold Spring Harbor Labroratory Press.USA)进行，将实施例七所得的ADTZ’克隆到pHIL-S1构建成表达质粒pHIL-S1-ADTZ，克隆后的目的基因经酶切、测序鉴定。
具体做法如图14所示，含基因ADTZ的重组质粒pHIL-S1的构建过程为EcoRI+BamHI双酶切质粒pHIL-S1和目的片断ADTZ，酶切产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳，并切胶回收。利用T4 DNA连接酶进行质粒pHIL-S1和目的基因ADTZ的连接。CaCl2法制备E.coli DH5α感受态细胞，转化DH5α感受态细胞，筛选转化子，碱提质粒。用EcoRI+BamHI、HindIII、Sacl酶切鉴定重组质粒pHIL-S1-ADTZ。挑取重组质粒PEG纯化法(Sambrook，et al.2001，Molecular Cloning A Laboratory Manual.Cold SpringHarbor Labroratory Press.USA)提取质粒DNA。以T7和SP6为测序引物，采用ABI377DNA Sequencer DNA自动序列仪(由上海博雅公司提供)，正反向进行测定。酶切结果如图11所示，重组载体pSA的酶切鉴定，BamHI、EcoRI双酶切(样品1)切下一条带位于2000bp左右，HindIII单酶切(样品2)切下三条带分别约在1400bp，600bp和500bp，SacI单酶切(样品3)将重组质粒切成线性，说明插入片段中没有SacI酶切位点。。
实施例九重组ADTZ的表达用Sacl酶切重组质粒pHIL-S1-ADTZ和质粒pHIL-S1，酶切产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳，切胶回收酶切后的线性重组质粒pHIL-S1-ADTZ和质粒pHIL-S1。按PichiaExpression Kit(Invitrogen Inc.，美国)手册中的原生质法转化毕赤酵母菌GS115，筛选Mut+转化子。利用甲醇作为唯一碳源对重组菌进行诱导表达(按Pichia Expression Kit手册操作)中，培养液经SDS-PAGE电泳分析表明，转化子经诱导表达后，培养液上清出现明显的目的蛋白带，而转化不含目的基因的空质粒的对照菌在相同的条件下诱导96小时，在上清中未检测到目的蛋白条带。结果如图12所示，转化子经甲醇诱导表达后，培养液上清出现明显的目的蛋白带；而转化不含目的基因的空质粒的阴性对照菌，在相同的条件下诱导在上清中无目的蛋白出现。
具体做法如下一、重组子与毕赤酵母的同源重组(一)线性化质粒Sacl酶切重组质粒pSA和质粒pHIL-S1，同时线性化质粒pHIL-S1是作为下面实验的control。
酶切pSA(120总体系)12μl Buffer L+8μl Sacl+100μl pSA酶切pHIL-S1(120总体系)12μl Buffer L+8μl Sacl+100μl pHIL-S10.8％琼脂糖凝胶电泳酶切样品，切胶回收酶切后的线性重组质粒pSA和质粒pHIL-S1。
(二)培养用于原生质化的毕赤酵母菌GS1151.从平板上挑取一个GS115单克隆接种于10mlYPD中，在150ml锥形瓶中，30℃，250-300rpm振荡培养过夜；2.从昨日培养的的10mlYPD菌液中分别取5，10，20μl接种于200mlYPD中，在500ml的锥形瓶中，250-300rpm振荡培养过夜；3.检测3个瓶中菌液的OD600值，取OD600＝0.2-0.3的菌液转入离心管中，室温1500×g离心5min，弃上清，收集的细胞用于原生质化。
(三)毕赤酵母菌GS115的原生质化1.培养收集的细胞重悬于200ml的无菌水中，转移至两个无菌的10ml离心管中；2.室温下，1500×g离心5min，弃上清；3.用10ml新鲜配制的SED洗沉淀，室温下，1500×g离心5min，弃上清；4.用10ml 1M山梨醇洗沉淀，室温下，1500×g离心5min，弃上清；5.用10mlSCE重悬沉淀；6.取一管Zymolyase冻融后轻弹管壁，使溶液混匀；7.取7.5μl Zymolyase加入管中，30℃温育30min；8.室温下750×g离心10min，收集菌体，弃上清；9.用10ml 1M山梨醇洗原生质体，轻轻敲打管壁分散沉淀，室温下750×g离心10min，收集菌体，弃上清；10.用10ml CaS洗菌体，室温下750×g离心10min，收集菌体，弃上清；
11将沉淀重悬于0.6ml CaS中，此原生质体在30min内必须使用。
(四)原生质法转化毕赤酵母菌GS1151.分别取100μl毕赤酵母原生质体加入A、B、C 3个无菌15ml离心管中；2.A管中不加DNA作为阴性对照，B管中加入30μl线性化的原质粒pHIL-S1，C管中加入30μl线性化的重组质粒pSA，室温下温育10min，期间准备一支3ml新鲜配制的PEG/CaT；3.各管中加入1ml新鲜配制的PEG/CaT，轻轻混匀，室温下温育10min；4.室温下750×g离心10分钟，弃上清，控干；5.将沉淀重悬于150μl SOS中，室温温育20min；6.各管加入850μl 1M山梨醇，准备铺板；7.涂布RD固体培养基，每板涂布200μl，28-30℃温育倒置培养，转化子约在4-6天出现。
(五)筛选Mut+转化子1.用无菌牙签挑取His+转化子，分别在MM和MD板上一一对应点菌，同时点上GS115/His+MutsAlbumin和GS115/His+Mut+β-gal作为对照。
2.28-30℃温育倒置培养2天；3.两天后，观察对照MM和MD板，若在两板上均生长良好为Mut+，若在MD上生长良好，在MM板上生长少或不生长则为Muts。
(六)重组菌的诱导表达1.挑取一个His+Mut+转化子的单克隆，接种于25mlBMG，在250ml的锥形瓶中，28-30℃，250-300rpm振荡培养，直至OD600＝2-6(约16-18h)；2.1500-3000×g离心5min收集细胞，弃上清，重悬细胞于BMM中至OD600为1.0(约需100-200mlBMM)，在1升的锥形瓶中，28-30℃，250-300rpm继续振荡培养。
3.每24h加100％甲醇，始终浓度至0.5％，保持诱导表达；4.诱导表达96h的时间。培养液离心2-3min，留取上清放入-80℃保存以用于纯化表达产物。
经诱导96小时培养上清中总蛋白量达0.23mg/ml。目的蛋白的分子量与用BioEdit软件(http//www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html)预测的理论值76.95kDa相符。
实施例十重组ADTZ的纯化诱导表达的发酵液经70％饱和(NH4)2SO4沉淀，收取沉淀获得粗酶样品。粗酶样品以等体积的PBS溶解，离心后取上清上疏水色谱层析Phenyl sepharose柱，以连续梯度的洗脱缓冲液洗脱，收集目的峰。透析脱盐，PBS溶液平衡后浓缩。浓缩酶液上金属螯合亲和色谱层析Chelating Sepharose柱pH7.5～6.0的连续pH梯度缓冲液进行洗脱，收集目的峰。具体如下
1、硫酸氨沉淀收集粗酶重组表达发酵液加入(NH4)2SO4粉末至40％饱和度，4℃，10000g离心20分钟，上清继续再加入(NH4)2SO4粉末至70％饱和度。4℃，10000g离心20分钟。即获得粗酶样品。
2、疏水层析ADTZ粗酶样品以等体积的0.02M PBS(pH6.0)液溶解，4000g 4℃离心10分钟，取上清，上Phenyl sepharose柱[Phenyl sepharose 6 Fast flow(high sub)，Pharmacia Biotech，Inc]，溶液液(0.02M PBS+30％饱和硫酸铵，pH6.0)洗至基线，然后以连续梯度的洗脱缓冲液[A液(0.02M PBS+10％饱和硫酸铵，pH6.0)+B液(0.02MPBS，pH6.0)]洗脱，收活性峰。透析脱盐，并以F液(0.02M PBS+0.5M NaCl，pH7.5)平衡，浓缩至蛋白浓度约为1mg/ml。
3、金属螯合层析Chelating Sepharose[Chelating Sepharose Fast Flow，PharmaciaBiotech，Inc]预先以0.2M CuCl2溶液饱和，以纯水洗柱至基线，再用F液(0.02M PBS+0.5MNaCl，pH7.5)洗至基线稳定。将经过疏水层析后的目的峰样品上样，分别以不连续pH梯度缓冲液G液
进行洗脱，收集目的峰。目的峰用SDS-PAGE电泳鉴定。
结果诱导表达后的1升发酵液，经以上的纯化后可获得58mg纯化的重组ADTZ。纯度达到95％以上。
实施例十一重组ADTZ活性的鉴定重组ADTZ活性的鉴定按参照实施例二之一方法进行。反应体系(1)活性酶组1μLAFB1溶液(AFB1甲醇溶液0.5μg/μL，氮气挥干)+重组表达ADTZ酶液(蛋白含量0.1mg/mL)300μL+0.5μL MgSO4+10μL PEG200；(2)灭活酶组1μL AFB1溶液(AFB1甲醇溶液0.5μg/μL，氮气挥干)+灭活的重组表达ADTZ酶液(蛋白含量0.1mg/mL，预先以100℃水浴5分钟)300μL+0.5μL MgSO4+10μL PEG200；(3)缓冲液对照组1μL AFB1溶液(AFB1甲醇溶液0.5μg/μL，氮气挥干)+PBS缓冲液(0.1M pH6.6)300μL+0.5μL MgSO4+10μL PEG200；反应体系充分混匀，30℃水浴，反应1小时，以后每小时向各加入0.5μL AFB1溶液，直至管内AFB1总量为2μg。加毕后，再继续反应6小时。反应结束后按实施例二之一方法操作点板展开检测。
结果显示用重组ADTZ处理后的AFB1产物则Rf值接近1(＝0.93)，与天然ADTZ的结果相似，表明重组ADTZ具有转化AFB1的活性。结果如图13所示，表明用重组ADTZ处理后的AFB1产物则Rf值接近1(＝0.93)，与天然的ADTZ相似，表明重组的ADTZ有转化AFB1的活性。
实施例十二 重组ADTZ对AFB1解毒生物学活性的鉴定重组ADTZ活性的鉴定按参照实施例二之二方法进行。受试样品的制备将天然的ADTZ替换为重组表达的ADTZ，其余的分组设计和做法同样。结果活性重组ADTZ处理反应组的细菌回复突变菌落数与阴性对照组(DMSO对照组)相近(MR值均小于2)。缓冲液处理对照组和灭活重组ADTZ处理对照组的细菌回复突变菌落数明显高于阴性对照组(MR值均大于2)，与阳性对照(黄曲霉毒素B1对照)的细菌回复突变数无显著性差异。说明重组ADTZ具有抗AFB1引起突变的生物活性作用。结果如下表。
黄曲霉毒素B1经重组表达酶处理后的细菌突变回复试验
序列表<110>暨南大学<120>一种具有转化黄曲霉毒素活性的解毒酶及编码该酶的基因<140>
<141>2004-08-17<160>2<170>Patentln version 3.2<210>1<211>695<212>PRT<213>假蜜环菌(Armillariella tabescens)<400>1Met Ala Thr Thr Thr Val His Arg Glu Arg Phe Leu Ala Asp Lys Ser1 5 10 15Ala Pro Leu Cys Gly Met Asp Ile Arg Lys Ser Phe Asp Gln Leu Ser20 25 30Ser Lys Glu Lys Leu Tyr Thr His Tyr Val Thr Glu Ala Ser Trp Ala35 40 45Gly Ala Arg Ile Ile Gln Ala Gln Trp Thr Pro Gln Ala Thr Asp Leu50 55 60Tyr Asp Leu Leu Ile Leu Thr Phe Ser Val Asn Gly Lys Leu Ala Asp65 70 75 80
Leu Asn Ala Leu Lys Thr Ser Ser Gly Leu Ser Glu Asp Asp Trp Glu85 90 95Ala Leu Ile Gln Tyr Thr Val Gln Val Leu Ser Asn Leu Val Asn Tyr100 105 110Lys Thr Phe Gly Phe Thr Lys Ile Ile Pro Arg Val Asp Ala Glu Lys115 120 125Phe Glu Ser Val Val Lys Ala Ser Ser Asn Ala Asp Gln Gly Ser Ala130 135 140Leu Phe Thr Lys Leu Lys Gln His Ile Tyr Ala Leu Ser Pro Glu Ser145 150 155 160Ala Leu Phe Ile Gly Lys Arg Lys Asp Gly His Val Ser Asn Tyr Tyr165 170 175Leu Gly Glu Pro Val Gly Asp Ala Glu Val Asp Ala Ile Gln Asn Val180 185 190Ala Glu Lys Leu Gly Val Asp Ile Leu Asn Thr Arg Val Lys Lys Asn195 200 205Gly Ala Gly Asp Tyr Thr Leu Leu Val Ala Ser Ala Lys Thr Ser Pro210 215 220Pro Ser Val His Asp Phe Gln Ile Asp Ser Thr Pro Ala Lys Leu Thr225 230 235 240Ile Glu Tyr Gly Asp Tyr Ala Ser Ser Leu Thr Lys Val Val Ala Ala245 250 255Leu Gln Glu Ala Lys Gln Tyr Thr Ala Asn Asp His Gln Ser Ala Met260 265 270Ile Glu Gly Tyr Val Lys Ser Phe Asn Ser Gly Ser Ile Pro Glu His275 280 285Lys Ala Ala Ser Thr Glu Trp Val Lys Asp Ile Gly Pro Val Val Glu290 295 300Ser Tyr Ile Gly Phe Val Glu Thr Tyr Val Asp Pro Tyr Gly Gly Arg305 310 315 320Ala Glu Trp Glu Gly Phe Thr Ala Ile Val Asp Lys Gln Leu Ser Ala325 330 335Lys Tyr Glu Ala Leu Val Asn Gly Ala Pro Lys Leu Ile Lys Ser Leu340 345 350
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Ala Asp Gly Thr Gly Ser Arg Asp Phe Tyr Thr Thr Leu Thr Glu Pro625 630 635 640Ile Ser Gly Trp Glu Gly Lys Ile Arg Asp Ile Val Leu Lys Lys Lys645 650 655Leu Pro Arg Lys Ile Phe Val Gln Pro Asn Thr Phe Val Val Asn Gly660 665 670Glu Val Gln Leu Lys Glu Tyr Pro Leu Thr Ala Ala Gly Val Ile Glu675 680 685Ser Phe Ile Glu Arg Arg Leu690 695<210>2<211>2321<212>DNA<213>假蜜环菌(Armillariella tabescens)<220>
<221>CDS<222>(92)...(2179)<400>2acgcggggaa tcttatcctc aatcttatcg ccagccagtc acatctcttc ctttctcgag 60aactcgtcac ctgaatacct accgcagaga a atg gcc acc aca act gtc cac cgg gag cga 121Met Ala Thr Thr Thr Val His Arg Glu Arg1 5 10ttc ctg gca gat aag tct gct cct ttg tgt ggt atg gat att aga aag tca ttt gat 178Phe Leu Ala Asp Lys Ser Ala Pro Leu Cys Gly Met Asp Ile Arg Lys Ser Phe Asp15 20 25cag ctc agc tct aag gaa aag ctc tac acg cat tac gtg acc gaa gct tct tgg gcg ggc 238Gln Leu Ser Ser Lys Glu Lys Leu Tyr Thr His Tyr Val Thr Glu Ala Ser Trp Ala Gly30 35 40 45gca aga atc atc cag gct cag tgg acc ccg cag gcg aca gat cta tat gat ctg ttg atc 298Ala Arg Ile Ile Gln Ala Gln Trp Thr Pro Gln Ala Thr Asp Leu Tyr Asp Leu Leu Ile50 55 60 65ctt acg ttc agc gta aat gga aag ctc gcc gac ctg aat gcc ctt aag acg tcg tca ggc 358Leu Thr Phe Ser Val Asn Gly Lys Leu Ala Asp Leu Asn Ala Leu Lys Thr Ser Ser Gly70 75 80 85ctt tca gag gac gat tgg gag gcc ttg ata cag tac acg gtc cag gta ttg agc aat ctt 418Leu Ser Glu Asp Asp Trp Glu Ala Leu Ile Gln Tyr Thr Val Gln Val Leu Ser Asn Leu90 95 100 105gtc aac tac aag acg ttc gga ttt acg aag atc att ccc cgc gtc gac gca gaa aag ttt 478Val Asn Tyr Lys Thr Phe Gly Phe Thr Lys Ile Ile Pro Arg Val Asp Ala Glu Lys Phe110 115 120 125
gag tca gtg gtc aaa gcc tct agc aac gca gac cag ggc tcg gca cta ttc acc aag ttg 538Glu Ser Val Val Lys Ala Ser Ser Asn Ala Asp Gln Gly Ser Ala Leu Phe Thr Lys Leu130 135 140 145aaa caa cac ata tat gcg ctt tct cct gag tca gcg cta ttc att ggc aaa agg aag gac 598Lys Gln His Ile Tyr Ala Leu Ser Pro Glu Ser Ala Leu Phe Ile Gly Lys Arg Lys Asp150 155 160 165ggt cac gta tca aat tac tat ctt ggt gaa cct gtt gga gat gct gag gtc gat gct atc 658Gly His Val Ser Asn Tyr Tyr Leu Gly Glu Pro Val Gly Asp Ala Glu Val Asp Ala Ile170 175 180 185cag aat gtc gct gag aag tta ggc gtt gat atc ctc aat act cgc gtg aag aag aat gga 718Gln Asn Val Ala Glu Lys Leu Gly Val Asp Ile Leu Asn Thr Arg Val Lys Lys Asn Gly190 195 200 205gcg ggt gat cac acg ctc tta gtt gcc tct gct aaa acc agt cca ccc tcc gtg cat gac 778Ala Gly Asp Tyr Thr Leu Leu Val Ala Ser Ala Lys Thr Ser Pro Pro Ser Val His Asp210 215 220 225ttc caa atc gac tca act ccg gct aaa ttg acg att gag tat ggc gac tac gcg tca tct 838Phe Gln Ile Asp Ser Thr Pro Ala Lys Leu Thr Ile Glu Tyr Gly Asp Tyr Ala Ser Ser230 235 240 245cta acg aag gtt gtc gcc gcc ctt cag gag gcc aaa cag tat acc gcg aac gat cat caa 898Leu Thr Lys Val Val Ala Ala Leu Gln Glu Ala Lys Gln Tyr Thr Ala Asn Asp His Gln250 255 260 265tca gcg atg atc gaa ggc tat gtc aag tcg ttc aac tca gga tca att ccg gaa cac aaa 958Ser Ala Met Ile Glu Gly Tyr Val Lys Ser Phe Asn Ser Gly Ser Ile Pro Glu His Lys270 275 280 285gct gcg tca aca gaa tgg gtg aaa gat att gga ccg gtt gta gag tcc tac atc ggg ttc 1018Ala Ala Ser Thr Glu Trp Val Lys Asp Ile Gly Pro Val Val Glu Ser Tyr Ile Gly Phe290 295 300 305gtc gaa acc tat gtc gac cca tat ggc gga cgc gcg gaa tgg gag ggt ttc act gcc atc 1078Val Glu Thr Tyr Val Asp Pro Tyr Gly Gly Arg Ala Glu Trp Glu Gly Phe Thr Ala Ile310 315 320 325gtc gac aag cag ctg agt gcg aag tac gaa gca ttg gtt aac ggt gct cct aag ttg atc 1138Val Asp Lys Gln Leu Ser Ala Lys Tyr Glu Ala Leu Val Asn Gly Ala Pro Lys Leu Ile330 335 340 345aag agt ctt ccg tgg gga acg gac ttc gag gtt gtc gtc ttc agg aag ccg gac ttt act 1198Lys Ser Leu Pro Trp Gly Thr Asp Phe Glu Val Asp Val Phe Arg Lys Pro Asp Phe Thr350 355 360 365gcg ttg gaa gtc gta tca ttt gca aca gga ggt att cct gcc gga atc aat ata cca aac 1258Ala Leu Glu Val Val Ser Phe Ala Thr Gly Gly Ile Pro Ala Gly Ile Asn Ile Pro Asn370 375 380 385tat tat gaa gtc cgg gaa agc aca ggg ttt aag aat gtt tcg cta gcg aat att ttg gcg 1318Tyr Tyr Glu Val Arg Glu Ser Thr Gly Phe Lys Asn Val Ser Leu Ala Asn Ile Leu Ala390 395 400 405gcc aag gca cca aac gag gag tta act ttc atc cat cct gat gac gta gaa cta tat aac 1378Ala Lys Val Pro Asn Glu Glu Leu Thr Phe Ile His Pro Asp Asp Val Glu Leu Tyr Asn410 415 420 425
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1.一种具有转化黄曲霉毒素活性的解毒酶，其等电点为5.3～6.8，分子量为73～77千道尔顿，其氨基酸序列如序列表所示。
2.编码如权利要求1所述的具有转化黄曲霉毒素活性的解毒酶的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其核苷酸序列如序列表所示。
4.包含如权利要求3所述的基因的重组表达载体。
5.用如权利要求4所述的重组表达载体转化宿主细胞所得的转化体。
6.制备如权利要求1所述的解毒酶的方法，其特征在于，包括以下步骤培养用包含如权利要求5所述的转化体，回收所表达的具有转化黄曲霉毒素活性的解毒酶。
7.如权利要求1所述的具有转化黄曲霉毒素活性的解毒酶在制备饲料和食品中黄曲霉毒素除毒产品的应用。
8.如权利要求1所述的具有转化黄曲霉毒素活性的解毒酶在制备预防和治疗由黄曲霉毒素诱发的肿瘤的药物的应用。
全文摘要
本发明涉及一种具有转化黄曲霉毒素活性的解毒酶及编码该酶的基因。发明人首先分离并纯化出了具有该活性的新型蛋白，命名为黄曲霉毒素解毒酶(Aflatoxin－detofizyme，ADTZ)。本发明通过纯化和测序获得ADTZ的基因特异性引物，从假蜜环菌(Armillariella tabescens)的总RNA出发，克隆得到编码ADTZ的基因，并利用基因工程的方法，在多种表达系统中表达并纯化出重组ADTZ蛋白。本发明所述的解毒酶具有转化AFB
文档编号C12N9/00GK1712526SQ200410051120
公开日2005年12月28日 申请日期2004年8月17日 优先权日2004年8月17日
发明者姚冬生, 刘大岭, 管敏, 谢春芳 申请人:暨南大学