一种青蛤血管紧张素转换酶抑制肽制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种青蛤血管紧张素转换酶抑制肽制备方法，包括以下步骤：（1）青蛤预处理；（2）酶解；（3）超滤分离；（4）快速蛋白纯化系统分离纯化；（5）高效液相色谱系统分离纯化。本发明以青蛤为原料，通过胰蛋白酶酶解青蛤，并利用超滤技术、快速蛋白纯化系统和高效液相色谱系统对酶解液进行分离纯化后得到一种新的血管紧张素转换酶抑制肽（ACE抑制肽），提取分离工艺合理，可操作性强，为从青蛤中制备高活性的ACE抑制肽提供了实验依据。
【专利说明】
一种青蛤血管紧张素转换酶抑制肽制备方法
技术领域
[0001]本发明涉及生物制药技术领域，尤其是涉及一种青蛤血管紧张素转换酶抑制肽制备方法。
【背景技术】
[0002]高血压是困扰当今的一种心血管疾病，可导致严重的并发症，对人类健康危害极大。血管紧张素转化酶(Ang1tensin-converting enzyme，ACE)在机体血压调节过程中起重要作用，一方面ACE将无活性的血管紧张素I转化为具有强烈收缩全身微动脉，使血压升高的血管紧张素Π;另一方面ACE能促进有降血压作用的缓激肽分解，引起血压升高。
[0003]现今人工合成的卡托普利、依那普利和赖诺普利等ACE抑制剂，这些药物具有很强的降血压作用，但长期服用会产生眩晕、恶心、剧烈咳嗽、味觉异常、肾功能损害等副作用。许多研究表明源于食物中的短肽具有降血压的功效，Da1-Hung Ngo等以太平洋鳕鱼皮为原料，用木瓜蛋白酶进行酶解，经分离纯化后得到降血压肽:Thr-Cys-Ser-Pro ； Hasan F等利用胃蛋白酶酶解鲣鱼肉，经分离纯化后得到高活性降血压肽(IKYGD);源于食物中的生物活性肽具有安全、无毒副作用，且易于机体吸收等特点。因此，从食物源中制备分离出高活性的ACE抑制肽仍是研究的热点。
[0004]青蛤(Cyclinasinensis)是我国沿海常见的贝类，属于优质蛋白源。青蛤提取物具有抗氧化、抗肿瘤和提高机体免疫作用等功效。但目前尚未见与青蛤降血压肽相关的研究报道。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是为了提供一种提取分离工艺合理，可操作性强，产品稳定性好的青蛤血管紧张素转换酶抑制肽制备方法。
[0006]为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案:
一种青蛤血管紧张素转换酶抑制肽制备方法，包括以下步骤:
(I)青蛤预处理:将青蛤除壳、剥肉后，用清水把蛤肉洗净，经高速组织搅碎机匀浆后用
0.lmol/L的NaOH浸泡3?5h，过滤后滤渣用纯化水泡洗至pH呈中性，脱水后得青蛤肉渣，备用。对青蛤预处理主要是脱杂蛋白和除去脂质。
[0007](2)酶解:将步骤(I)中的青蛤肉渣加入胰蛋白酶进行酶解，酶解条件为:料液比1:2-3，加酶量1000?1200U/g，pH值7.5-8.5,酶解温度45?50°C，酶解时间9?12 h，酶解完成后用沸水浴灭活，预冷后离心，得上清液。
[0008](3)超滤分离:将上清液经0.45μπι滤膜抽滤后，用截留分子量为3ku的超滤膜进行超滤，得超滤液。
[0009](4)快速蛋白纯化系统分离纯化:将步骤(3)中的超滤液经快速蛋白纯化系统进行分离纯化，得到五个活性组分，分别取样测定该五个活性组分的血管紧张素转换酶抑制活性，取血管紧张素转换酶抑制活性最高的组分记为组分A。血管紧张素转换酶抑制活性的检测采用高效液相色谱(HPLC)法，该技术为现有技术，故不在此赘述。
[0010](5)高效液相色谱系统分离纯化:将组分A经高效液相色谱系统(HPLC)分离纯化，得到七个活性组分，分别取样测定该七个活性组分的血管紧张素转换酶抑制活性，取血管紧张素转换酶抑制活性最高的组分记为组分B，组分B经纯度检测后，即得氨基酸序列为:Trp-Pro-Met-Gly- Phe(TPMGP)的血管紧张素转换酶抑制肽。
[0011]作为优选，步骤(2)中，酶解期间不断搅拌。
[0012]作为优选，步骤(2)中，预冷至4?6°C。预冷至4?6°C，有助于提高离心效果。
[0013]作为优选，步骤(2)中，离心工艺条件为:转速5000?10000rpm/min，离心时间10?30mino
[0014]作为优选，步骤(4)中，快速蛋白纯化系统进行分离纯化的具体方法为:采用Superose 12 10/300 GL琼脂糖凝胶柱(填料粒径10 μπι, 10 X 300 mm)，超滤液稀释至0.1g/mL，#0.22 μπι滤膜后进样，进样量:500 yL;超纯水洗脱，流速:0.5 mL/min;检测波长:280 nm;自动收集:3.5 mL/管，收集各峰。
[0015]作为优选，步骤(5)中，高效液相色谱系统分离纯化的具体方法为:采用ZORBAXSB-C18制备型色谱柱(填料粒径5μπι，4.6 X 250 mm);流动相A为超纯水(含0.05%TFA)，流动相B为乙腈(含0.05%TFA)，采用梯度洗脱方式:5min 20% B，30min 100% B;流速:1.5 mL/min;检测波长:214和280 nm;柱温:25°C ;自动进样，进样量:500 yL，收集各峰。
[0016]作为优选，步骤(5)中，组分B纯度检测方法为:采用ZORBAXSB-C18分析型色谱柱(填料粒径:5μ??，4.6 X 150 mm);流动相A为超纯水(含0.05%TFA)，流动相B为乙腈(含0.05%TFA)，采用梯度洗脱方式:5min 20% B，30min 100% B;流速:1.0 mL/min;柱温:25°C ;自动进样，进样量:500 yL;检测波长:214和280 nm0
[0017]因此，本发明具有如下有益效果是:以青蛤为原料，通过胰蛋白酶酶解青蛤，并利用超滤技术、快速蛋白纯化系统和高效液相色谱系统对酶解液进行分离纯化后得到一种新的血管紧张素转换酶抑制肽(ACE抑制肽)，提取分离工艺合理，可操作性强，为从青蛤中制备高活性的ACE抑制肽提供了实验依据。
【具体实施方式】
[0018]下面通过【具体实施方式】对本发明做进一步的描述。
[0019]实施例1
(I)青蛤预处理:将青蛤除壳、剥肉后，用清水把蛤肉洗净，经高速组织搅碎机匀浆后用
0.111101/1的他0田受泡311，过滤后滤渣用纯化水泡洗至pH呈中性，脱水后得青蛤肉渣，备用。
[0020](2)酶解:将步骤(I)中的青蛤肉渣加入胰蛋白酶进行酶解，酶解条件为:料液比1:2，加酶量1000U/g，pH值7.5，酶解温度45°C，酶解时间9 h，酶解期间不断搅拌，酶解完成后用沸水浴灭活，预冷至4°C后以转速5000rpm/min离心lOmin，得上清液；
(3)超滤分离:将上清液经0.45μπι滤膜抽滤后，用截留分子量为3ku的超滤膜进行超滤，得超滤液。
[0021](4)快速蛋白纯化系统分离纯化:将步骤(3)中的超滤液经快速蛋白纯化系统(Apurifier UPC-100型快速蛋白纯化仪，GE生命科学公司)进行分离纯化，得到五个活性组分，分别取样测定该五个活性组分的血管紧张素转换酶抑制活性，取血管紧张素转换酶抑制活性最高的组分记为组分A，快速蛋白纯化系统进行分离纯化的具体方法为:采用Superose 12 10/300 GL琼脂糖凝胶柱(填料粒径10 μπι, 10 X 300 mm)，超滤液稀释至0.1g/mL，#0.22 μπι滤膜后进样，进样量:500 yL;超纯水洗脱，流速:0.5 mL/min;检测波长:280 nm;自动收集:3.5 mL/管，收集各峰。
[0022](5)高效液相色谱系统分离纯化:将组分A经高效液相色谱系统(HPLC)分离纯化，得到七个活性组分，分别取样测定该七个活性组分的血管紧张素转换酶抑制活性，取血管紧张素转换酶抑制活性最高的组分记为组分B，组分B经纯度检测后，即得氨基酸序列为:Trp-Pro-Met-Gly- Phe(TPMGP)的血管紧张素转换酶抑制肽，高效液相色谱系统分离纯化的具体方法为:采用ZORBAX SB-C18制备型色谱柱(填料粒径5μπι，4.6 X 250 mm);流动相A为超纯水(含0.05%TFA)，流动相B为乙腈(含0.05%TFA)，采用梯度洗脱方式:5min 20% B，30min 100% B;流速:1.5 mL/min;检测波长:214和280 nm;柱温:25°C ;自动进样，进样量:500 yL，收集各峰，组分B纯度检测方法为:采用ZORBAX SB-C18分析型色谱柱(填料粒径:5μπι,4.6Χ150 mm)；流动相A为超纯水(含0.05%TFA)，流动相B为乙腈(含0.05%TFA)，采用梯度洗脱方式:5min 20% B，30min 100% B;流速:1.0 mL/min;柱温:25°C ;自动进样，进样量:500 yL;检测波长:214和280 nm。
[0023]实施例2
(I)青蛤预处理:将青蛤除壳、剥肉后，用清水把蛤肉洗净，经高速组织搅碎机匀浆后用
0.111101/1的他0田受泡411，过滤后滤渣用纯化水泡洗至pH呈中性，脱水后得青蛤肉渣，备用。
[0024](2)酶解:将步骤(I)中的青蛤肉渣加入胰蛋白酶进行酶解，酶解条件为:料液比1:2.5，加酶量1100U/g，pH值8，酶解温度48°C，酶解时间10 h，酶解期间不断搅拌，酶解完成后用沸水浴灭活，预冷至5°C后以转速8000rpm/min离心20min，得上清液。
[0025](3)超滤分离:将上清液经0.45μπι滤膜抽滤后，用截留分子量为3ku的超滤膜进行超滤，得超滤液。
[0026](4)快速蛋白纯化系统分离纯化:将步骤(3)中的超滤液经快速蛋白纯化系统进行分离纯化，得到五个活性组分，分别取样测定该五个活性组分的血管紧张素转换酶抑制活性，取血管紧张素转换酶抑制活性最高的组分记为组分A，快速蛋白纯化系统进行分离纯化的具体方法为:采用Superose 12 10/300 GL琼脂糖凝胶柱(填料粒径10 μπι, 10 X 300 mm)，超滤液稀释至0.1 g/mL，#0.22 ym滤膜后进样，进样量:500 ;超纯水洗脱，流速:0.5mL/min;检测波长:280 nm;自动收集:3.5 mL/管，收集各峰。
[0027](5)高效液相色谱系统分离纯化:将组分A经高效液相色谱系统(HPLC)分离纯化，得到七个活性组分，分别取样测定该七个活性组分的血管紧张素转换酶抑制活性，取血管紧张素转换酶抑制活性最高的组分记为组分B，组分B经纯度检测后，即得氨基酸序列为:Trp-Pro-Met-Gly- Phe(TPMGP)的血管紧张素转换酶抑制肽，高效液相色谱系统分离纯化的具体方法为:采用ZORBAX SB-C18制备型色谱柱(填料粒径5μπι，4.6 X 250 mm);流动相A为超纯水(含0.05%TFA)，流动相B为乙腈(含0.05%TFA)，采用梯度洗脱方式:5min 20% B，30min 100% B;流速:1.5 mL/min;检测波长:214和280 nm;柱温:25°C ;自动进样，进样量:500 yL，收集各峰，组分B纯度检测方法为:采用ZORBAX SB-C18分析型色谱柱(填料粒径:5μπι,4.6Χ150 mm)；流动相A为超纯水(含0.05%TFA)，流动相B为乙腈(含0.05%TFA)，采用梯度洗脱方式:5min 20% B，30min 100% B;流速:1.0 mL/min;柱温:25°C ;自动进样，进样量:500 yL;检测波长:214和280 nm。
[0028]实施例3
(I)青蛤预处理:将青蛤除壳、剥肉后，用清水把蛤肉洗净，经高速组织搅碎机匀浆后用
0.111101/1的他0田受泡511，过滤后滤渣用纯化水泡洗至pH呈中性，脱水后得青蛤肉渣，备用。
[0029](2)酶解:将步骤(I)中的青蛤肉渣加入胰蛋白酶进行酶解，酶解条件为:料液比1:3，加酶量1200U/g，pH值8.5，酶解温度50 °C，酶解时间12 h，酶解期间不断搅拌，酶解完成后用沸水浴灭活，预冷至6°C后以转速10000rpm/min离心30min，得上清液。
[0030](3)超滤分离:将上清液经0.45μπι滤膜抽滤后，用截留分子量为3ku的超滤膜进行超滤，得超滤液。
[0031](4)快速蛋白纯化系统分离纯化:将步骤(3)中的超滤液经快速蛋白纯化系统进行分离纯化，得到五个活性组分，分别取样测定该五个活性组分的血管紧张素转换酶抑制活性，取血管紧张素转换酶抑制活性最高的组分记为组分A，快速蛋白纯化系统进行分离纯化的具体方法为:采用Superose 12 10/300 GL琼脂糖凝胶柱(填料粒径10 μπι, 10 X 300 mm)，超滤液稀释至0.1 g/mL，#0.22 ym滤膜后进样，进样量:500 ;超纯水洗脱，流速:0.5mL/min;检测波长:280 nm;自动收集:3.5 mL/管，收集各峰。
[0032](5)高效液相色谱系统分离纯化:将组分A经高效液相色谱系统(HPLC)分离纯化，得到七个活性组分，分别取样测定该七个活性组分的血管紧张素转换酶抑制活性，取血管紧张素转换酶抑制活性最高的组分记为组分B，组分B经纯度检测后，即得氨基酸序列为:Trp-Pro-Met-Gly- Phe(TPMGP)的血管紧张素转换酶抑制肽，高效液相色谱系统分离纯化的具体方法为:采用ZORBAX SB-C18制备型色谱柱(填料粒径5μπι，4.6 X 250 mm);流动相A为超纯水(含0.05%TFA)，流动相B为乙腈(含0.05%TFA)，采用梯度洗脱方式:5min 20% B，30min 100% B;流速:1.5 mL/min;检测波长:214和280 nm;柱温:25°C ;自动进样，进样量:500 yL，收集各峰，组分B纯度检测方法为:采用ZORBAX SB-C18分析型色谱柱(填料粒径:5μπι,4.6Χ150 mm)；流动相A为超纯水(含0.05%TFA)，流动相B为乙腈(含0.05%TFA)，采用梯度洗脱方式:5min 20% B，30min 100% B;流速:1.0 mL/min;柱温:25°C ;自动进样，进样量:500 yL;检测波长:214和280 nm。
[0033]本发明提取分离工艺合理，可操作性强，以青蛤为原料，通过胰蛋白酶酶解后利用超滤技术、快速蛋白纯化系统和高效液相色谱系统对酶解液进行分离纯化得到一种新的血管紧张素转换酶抑制肽(ACE抑制肽)，其经氨基酸测序仪进行N端降解测序，得到五肽，其氨基酸序列为:Trp-Pro-Met-Gly- Phe(TPMGP)，其相对分子质量为636.78 Da，TPMGP的 IC50为0.5025 mg/ml，具有较高的ACE抑制活性(ACE抑制率为87.58%以上)，为从青蛤中制备高活性的ACE抑制肽提供了实验依据。
[0034]以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
【主权项】
1.一种青蛤血管紧张素转换酶抑制肽制备方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)青蛤预处理:将青蛤除壳、剥肉后，用清水把蛤肉洗净，经高速组织搅碎机匀浆后用0.lmol/L的NaOH浸泡3?5h，过滤后滤渣用纯化水泡洗至pH呈中性，脱水后得青蛤肉渣，备用； (2)酶解:将步骤(I)中的青蛤肉渣加入胰蛋白酶进行酶解，酶解条件为:料液比1:2?3，加酶量1000~12001]/^，？!1值7.5-8.5,酶解温度45?50°C，酶解时间9?12 h，酶解完成后用沸水浴灭活，预冷后离心，得上清液； (3)超滤分离:将上清液经0.45μπι滤膜抽滤后，用截留分子量为3ku的超滤膜进行超滤，得超滤液； (4)快速蛋白纯化系统分离纯化:将步骤(3)中的超滤液经快速蛋白纯化系统进行分离纯化，得到五个活性组分，分别取样测定该五个活性组分的血管紧张素转换酶抑制活性，取血管紧张素转换酶抑制活性最高的组分记为组分A; (5)高效液相色谱系统分离纯化:将组分A经高效液相色谱系统(HPLC)分离纯化，得到七个活性组分，分别取样测定该七个活性组分的血管紧张素转换酶抑制活性，取血管紧张素转换酶抑制活性最高的组分记为组分B，组分B经纯度检测后，即得氨基酸序列为:Trp-Pro-Met-Gly- Phe(TPMGP)的血管紧张素转换酶抑制肽。2.根据权利要求1所述的一种青蛤血管紧张素转换酶抑制肽制备方法，其特征在于，步骤(2)中，酶解期间不断搅拌。3.根据权利要求1所述的一种青蛤血管紧张素转换酶抑制肽制备方法，其特征在于，步骤(2)中，预冷至4?6 °C。4.根据权利要求1所述的一种青蛤血管紧张素转换酶抑制肽制备方法，其特征在于，步骤(2)中，离心工艺条件为:转速5000~10000rpm/min，离心时间10~30min。5.根据权利要求1所述的一种青蛤血管紧张素转换酶抑制肽制备方法，其特征在于，步骤(4)中，快速蛋白纯化系统进行分离纯化的具体方法为:采用Superose 12 10/300 GL琼脂糖凝胶柱(填料粒径1 μ??, 10 × 300 mm)，超滤液稀释至0.1 g/mL，#0.22 μm滤膜后进样，进样量:500 UL;超纯水洗脱，流速:0.5 mL/min;检测波长:280 nm;自动收集:3.5 mL/管，收集各峰。6.根据权利要求1所述的一种青蛤血管紧张素转换酶抑制肽制备方法，其特征在于，步骤(5)中，高效液相色谱系统分离纯化的具体方法为:采用ZORBAX SB-C18制备型色谱柱(填料粒径5μm，4.6 × 250 mm)；流动相A为超纯水(含0.05%TFA)，流动相B为乙腈(含0.05%TFA)，采用梯度洗脱方式:5min 20% B，30min 100% B;流速:1.5 mL/min;检测波长:214和.280nm;柱温:25℃;自动进样，进样量:500μL，收集各峰。7.根据权利要求1所述的一种青蛤血管紧张素转换酶抑制肽制备方法，其特征在于，步骤(5)中，组分B纯度检测方法为:采用ZORBAX SB-C18分析型色谱柱(填料粒径:5μm，4.6 X.150 mm);流动相A为超纯水(含0.05%TFA)，流动相B为乙腈(含0.05%TFA)，采用梯度洗脱方式:5min 20% B，30min 100% B;流速:1.0 mL/min;柱温:25°C ;自动进样，进样量:500 yL；检测波长:214和280 nm。
【文档编号】C07K7/06GK105821103SQ201511011197
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2015年12月30日
【发明人】余方苗, 罗李玉, 杨最素, 黄芳芳, 丁国芳
【申请人】浙江海洋学院