具有血管紧张素转化酶抑制活性的扁杏仁肽及其制备方法【
技术领域：
】[0001]本发明属于医用蛋白或肽/蛋白
技术领域：
，具体涉及两种具有显著的血管紧张素转化酶（ACE)抑制活性的扁杏仁肽及其制备方法。【
背景技术：
】[0002]目前，天然生物活性肽研究的蛋白来源主要有：（1)植物性来源：大豆/豆柏、米糟、花生、杏仁等；（2)动物性来源：蚕丝、猪肉、鸡肉、动物皮/骨、动物毒液等。[0003]生物活性肽的作用研究方向主要有：（1)抗高血压活性；（2)抗氧化活性；（3)抗血栓活性；(4)抗菌作用；（5)免疫作用；(6)拮抗与抗拮抗活性；（7)抗炎症作用等。[0004]以上成果大多停留在色谱分析水平，没有制取到足够的纯净样品。有的仅进行了体外或细胞活性研究两者中的一项，不能充分证明产物的安全和有效性。【
发明内容】[0005]本发明所要解决的技术问题在于提供两种具有显著的血管紧张素转化酶抑制活性的扁杏仁肽，以及这两种扁杏仁肽的制备方法。[0006]解决上述技术问题所采用的技术方案是：该扁杏仁肽的氨基酸序列为a-His-Thr-Asp-Asp，其中a代表Met或Gin。[0007]本发明具有血管紧张素转化酶抑制活性的扁杏仁肽的制备方法由下述步骤组成：[0008]1、提取扁杏仁蛋白[0009]将扁杏仁依次经热水脱皮、粉碎、脱脂、溶剂提取、乙醇和等电点沉降法复合沉淀、冷冻干燥，得到扁杏仁蛋白。[0010]2、蛋白酶解[0011]将步骤1得到的扁杏仁蛋白先用Protamex复合蛋白酶水解，然后用Alcalase碱性蛋白酶水解，离心分离，上清液冷冻干燥，得到扁杏仁总肽。[0012]3、葡聚糖凝胶层析[0013]将步骤2得到的扁杏仁总肽与超纯水按质量体积比为30~50g:1L混合，脱气、超滤膜过滤后加入SephadexG-15填充柱中，以超纯水为流动相，采用自动液相色谱分离层析仪进行分离，进样量2mL，流速3mL/分钟；收集19~40分钟所有流出成分，冷冻干燥。[0014]4、反相制备色谱分离[0015]将步骤3冷冻干燥后得到的产品与超纯水按质量体积比为40~60g:1L混合，用超滤膜过滤，超声脱气后，注射入制备色谱系统，进样量lmL，采用SinochromODS-BP色谱柱分离，洗脱相A为乙腈，洗脱相B为含0.05%三氟乙酸的超纯水，梯度洗脱程序：0~10分钟，20%乙腈；10~30分钟，20%~40%乙腈；30~40分钟，40%~70%乙腈；流速12mL/分钟；收集8.52~9.14分钟和14.87~15.26分钟流出的两种成分，冷冻干燥，得到氨基酸序列为Met-His-Thr-Asp-Asp和Gln-His-Thr-Asp-Asp的扁杏仁肽。[0016]本发明的扁杏仁蛋白可根据现有文献公开的任意一种提取方法提取。[0017]本发明以扁杏仁为原料，先提取扁杏仁蛋白，再将扁杏仁蛋白酶解后得到的扁杏仁总肽经葡聚糖凝胶层析、反相制备色谱分离得到两种扁杏仁肽。实验结果表明，所制备的两种扁杏仁肽具有较高的ACE抑制活性，其中氨基酸序列为Met-His-Thr-Asp-Asp的扁杏仁肽对ACE抑制活性的IC5。值为67.52±0.05yg/mL，氨基酸序列为Gln-His-Thr-Asp-Asp的扁杏仁肽对ACE抑制活性的IC5。值为43.18±0.07yg/mL，且细胞毒性较低，因而可以作为降压药物。【具体实施方式】[0018]下面结合实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。[0019]实施例1[0020]1、提取扁杏仁蛋白[0021]根据公布号为CN102845585A、发明名称为"聚乙二醇-微波辅助提取杏仁蛋白的方法"中实施例1公开的方法提取扁杏仁蛋白。[0022]2、蛋白酶解[0023]将扁杏仁蛋白与蒸馏水按质量体积比为40g:1L混合，在温度为42°C水浴中先用Protamex复合蛋白酶在pH值为6.5下水解100分钟，加酶量为53140U/g蛋白，水解完后在沸水浴中灭酶20分钟，然后在温度为53°C的环境中用Alcalase碱性蛋白酶在pH值为7.6下酶解90分钟，加酶量为1130U/g蛋白，酶解完后在沸水浴中灭酶20分钟，酶解过程用0.5mol/LNaOH水溶液调节pH值；10000转/分钟离心分离20分钟，所得上清液在-40°C冷冻干燥24小时，得到扁杏仁总肽。[0024]3、葡聚糖凝胶层析[0025]将2.06g扁杏仁总肽与超纯水按质量体积比为40g:1L混合，脱气、超滤膜过滤后加入SephadexG-15填充柱中，以超纯水为流动相，采用自动液相色谱分离层析仪（上海沪西分析仪器厂提供）在检测波长为280nm、进样量为2mL、流速为3mL/分钟下进行分离，收集19~40分钟所有流出成分，如此反复试验，合并流出组分，在-40°C冷冻干燥24小时，得到产品共0.76g。[0026]4、反相制备色谱分离[0027]将步骤3葡聚糖凝胶层析中得到的0.76g产品与超纯水按质量体积比为50g:1L混合，用超滤膜过滤，超声脱气20分钟后，注射入岛津LC-10A制备色谱系统，色谱柱为大连伊利特Sinochrom0DS-BP，检测波长220nm，进样量lmL，流速12mL/min，洗脱相A为乙腈，洗脱相B为超纯水（含0.05wt.%三氟乙酸），梯度洗脱程序：0~10分钟，20%(体积浓度）乙腈；10~3〇分钟，2〇%~40%(体积浓度）乙腈；3〇~40分钟，40%~7〇%(体积浓度）乙腈；收集8.52~9.14分钟和14.87~15.26分钟流出的两种成分，在-40°C冷冻干燥24小时，得到114mg肽A和12mg肽B，经HPLC检测证明两种肽均为纯品，经PPSQ-31A蛋白质自动检测仪检测，肽A的氨基酸序列为Met-His-Thr-Asp-Asp，肽B的氨基酸序列为Gln-His-Thr-Asp-Asp〇[0028]发明人对实施例1得到的肽A和肽B分别进行体外和细胞实验，具体实验情况如下：[0029]1、体外ACE抑制活性[0030]在37°C下，ACE可以与马尿酰-组氨酰-亮氨酸（HHL)相互作用，将其降解为马尿酸（HA)，即同等条件下，一个物质如果使得ACE-HHL体系中转化出的HA越少，其ACE抑制性越强，即HA峰面积越小，物质的ACE抑制性越强。[0031]将肽A和肽B分别用pH值为8.3的硼酸缓冲液配制成5yg/mL、10yg/mL、50yg/mL、100iig/mL、150iig/mL5个浓度，作为样品溶液。向2mL离心管中加入120iiL5mmol/LHHL和40yL样品溶液，于37°C水浴恒温6min，加入100yL0.lU/mL的ACE溶液（用pH值为8.3的硼酸缓冲液配制），于恒温磁力搅拌器中37°C恒温4000r/min搅拌反应60min，加入160yL1.Omol/LHC1水溶液反应lOmin，终止反应后用超滤膜过滤，滤液用Watersl525高效液相色谱仪测定HA，色谱条件：WatersPDA2996二极管阵列检测器；美国安捷伦Agilent300Stable_bondC18大孔色谱柱；进样量20yL;流速lmL/min;检测波长228nm;流动相A为乙腈，流动相B为超纯水，两者均含0.05%TFA;梯度洗脱程序：0~40min，10%~45%乙腈。同时pH值为8.3的硼酸缓冲液做空白对照试验。每个实验平行测定3次取平均值。用SPSSStatistics进行统计，分别拟当前第1页1 2