专利名称：具有血管紧张素转化酶抑制作用的新型肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新型肽和含有该肽的血管紧张素转化酶抑制剂。所述血管紧张素转化酶抑制剂可以用作食用产品、饲料和药物。
背景技术：
血管紧张素转化酶(ACE)是作用于血管紧张素I的一种酶，血管紧张素I是通过利用血管紧张肽原酶消化血管紧张素原生成的，并通过释放其C-末端的两个氨基酸将其转化为血管紧张素II。血管紧张素转化酶的作用不仅能产生具有强增血压作用的血管紧张素II，还能使具有降血压效果的缓激肽失活。由于这些作用，一直将血管紧张素转化酶抑制剂用作高血压的治疗剂，例如甲巯丙脯酸(Sankyo Co.，Ltd.生产)和Renivase(Banyu Pharmaceutical Co.，Ltd.生产)是已知的商购药物。此外，还已知血管紧张素转化酶抑制剂具有使心肌肥大逆转的作用。
另一方面，具有血管紧张素转化酶抑制作用的肽存在于自然产物或动物蛋白如酪蛋白和明胶、植物蛋白如来自小麦、稻米和玉米的那些和鱼蛋白如来自沙丁鱼的那些的酶降解产物中。例如，已知存在于自然产物中的肽包括壬肽抗压素(九肽，SQ20881)和属于链霉菌属的放线菌的代谢产物IS83(JP58-177920A)。此外，已知的酶降解产物包括通过利用胰蛋白酶分解酪蛋白获得的肽(JP58-109425A、JP59-44323A、JP59-44324A、JP61-36226A和JP61-36227A)，通过利用嗜热菌蛋白酶水解酪蛋白获得的肽(JP6-277090A、JP6-277091A、JP6-279491A、JP7-101982A和JP7-101985A)，通过利用乳酸菌或蛋白酶和肽酶的组合水解酪蛋白等获得的肽(JP6-197786A、JP6-40944A和JP2001-136995A，以下分别称作“参考文献1-3”)。参考文献1-3的肽用作具有降血压作用的特定健康用途食品。
在上述肽中，JP7-101982A(以下称作“参考文献4”)描述的肽表现出最高的血管紧张素转化酶抑制活性并具有相当简单的三肽结构。
发明内容
如上所述，本领域内已知多种血管紧张素转化酶抑制肽。然而，在食品中那些肽对血管紧张素转化酶的抑制活性功能仍嫌不足。因此，需要得到一种从天然产物而来、对血管紧张素转化酶有更高抑制活性并具有简单结构的肽，以及将该肽应用于食物产品、药物等当中。
为解决上述问题本发明人进行了深入研究，结果，他们发现利用特异性酶水解酪蛋白，在水解产物中形成了对血管紧张素转化酶具有高抑制活性的新型肽，所述肽具有Met-Lys-Pro表征的序列，由此完成了本发明。
这就是说，本发明涉及由Met-Lys-Pro组成的肽(以下也称作“本发明的肽”)。
进而，本发明提供了包含由Met-Lys-Pro组成的肽作为有效成分的血管紧张素转化酶抑制剂。
进而，本发明提供了包含由Met-Lys-Pro组成的肽作为有效成分的降压剂。
以下详细描述本发明。
本发明的肽具有表征为Met-Lys-Pro的序列。此外，本发明的肽可以是该肽的盐。在本发明中，Met表示L-蛋氨酸残基，Lys表示L-赖氨酸残基，Pro表示L-脯氨酸残基。
本发明的肽可以通过利用适当的水解酶水解蛋白质如酪蛋白来制备。
以下，将例示利用水解酶水解蛋白质的方法。
利用酶来水解蛋白质，尽管处理方式因蛋白质的性质不同而变化，但总是将原料蛋白质分散于冷水或热水中，当蛋白质可溶时溶解于其中。当蛋白质溶解性差时，将其与热水混合并在强力搅拌下使之匀化。
对蛋白质没有特定限制，只要其含有Met-Lys-Pro表征的序列并且在利用适当的水解酶消化时能生成本发明的肽即可。因此，可以采用任何源自动物或细菌的蛋白质。特别地，优选蛋白质是可以大量获得的酪蛋白。
为防止由于细菌污染造成的变质，需要将含有蛋白质的溶液在70-90℃灭菌约15秒-10分钟。
随后，优选通过向溶液中加入碱性试剂或酸性试剂将含蛋白质的溶液的pH值调节至对所用水解酶最佳的pH或其近似pH。本发明的方法中所用的碱性或酸性试剂可以是食物产品或药物中可接受的任何碱性或酸性试剂。碱性试剂的具体实例包括氢氧化钠、氢氧化钾和碳酸钾，酸性试剂的实例包括盐酸、柠檬酸、磷酸和乙酸。
接下来，向蛋白质溶液中加入预定量的水解酶，在约10-85℃的温度下进行反应0.1-48小时。
水解酶优选为内肽酶，但并非特别限于此，只要该水解酶能够水解蛋白质生成本发明的肽即可。所述内肽酶包括源自芽孢杆菌的蛋白酶和源自动物胰脏的蛋白酶。那些酶可以商购获得。优选的源自芽孢杆菌的蛋白酶例如为Biopuraze sp-20(Nagase BiochemicalIndustry Inc.制造)和Protease N(Amano Enzyme Inc.制造)，优选的源自动物胰脏的蛋白酶可例如为PTN6.0S(Novozymes Japan Ltd.制造)。源自芽孢杆菌的蛋白酶需要以100-5000活性单位/1克蛋白质的比率加入。另一方面，源自动物胰脏的蛋白酶需要以3000-8000活性单位/1克蛋白质的比率加入。
本发明中所用的水解酶可以是一种水解酶或者两或多种水解酶的组合。当使用两或多种水解酶时，可以同时或独立地进行它们的酶反应。在本发明中，特别优选采用Biopuraze sp-20、Protease N和PTN6.0S的混合物。
加入酶的溶液的温度根据酶的种类而保持在适当的温度，例如30-60℃，优选45-55℃以引起蛋白质的水解。关于水解的反应时间，在监控反应的分解率的情况下，将反应持续至达到优选的分解率。为获得本发明的肽，需要分解率为20-30％。
就计算蛋白质分解率的方法而言，用凯氏法测定样品的总含氮量(The Japanese Society for Food Science and Technology，Ed.，“Food Analysis Method”，第102页，KORIN PublishingCo.，Ltd.，1984)，并用甲醛滴定法测定样品的甲醛氮含量(Manda等，Ed.，“Laboratory Manuals of Food Engineering”，第一卷，第547页，Yokendo Co.，Ltd.，1970)，接下来利用那些测量值采用下面的方程计算分解率。
分解率(％)＝(甲醛氮含量/总含氮量)×100通过例如使水解溶液中的酶失活来终止酶反应。可以通过采用通用方法的热失活来进行。考虑到所用酶的热稳定性，可以就热失活作用的加热温度和保持时间来适当地确定充分失活的条件。例如，可以在80-130℃的温度范围内进行30分-2秒的保持时间。
优选将本发明的肽从上述的水解溶液中分离出来并提纯。肽的提纯通常以与提纯寡肽相同的技术来进行，例如，通过适当地将以下组合起来各种层析法包括离子交换层析、吸收层析、反相层析、分配层析和凝胶过滤层析，溶剂沉淀，盐析提取，以及在两个液相之间进行分配等。在提纯本发明的肽的时候，可以根据下述的血管紧张素转化酶抑制作用来确定含有目标物质的部分。可以通过质谱法来鉴别那些部分中的活性成分。
而且，也可以通过化学合成来制备本发明的肽。可以通过通常用于寡肽合成的液相法或固相法来进行本发明的肽的化学合成。根据需要，对合成的肽进行去保护，然后除去未反应试剂、副产物等。可以采用可商购的肽合成器来进行这些肽的合成。可以根据血管紧张素转化酶抑制作用来确认目标肽的生成。
本发明的肽可以用作血管紧张素转化酶抑制剂的有效成分。本发明的肽对血管紧张素转化酶具有抑制作用并对缓激肽的失活具有抑制作用并显示出降血压作用。因此，可以将其用作源于高血压的各种疾病的预防剂或治疗剂，如脑出血、脑梗塞、心绞痛、心肌梗塞形成和肾机能不全，更具体而言，可以将其用作降血压剂等。此外，已知血管紧张素转化酶抑制剂还对原因尚不清楚的instinct高血压有效，这样，还可以预期本发明的肽显示出对instinct高血压的治疗或预防作用。此外，可以将其用作其它疾病的治疗或预防药物，如心肌肥大和绞痛疾病，对这些疾病，认为血管紧张素转化酶抑制剂是有效的。
本发明的血管紧张素转化酶抑制剂可以口服给药或者肠胃外给药，但优选口服给药。肠胃外给药包括静脉内注射、直肠内给药和吸入法。口服给药的药物形式包括片剂形式、胶囊形式、锭剂形式、糖浆形式、颗粒形式、粉末形式和软膏形式。就药物制剂而言，除乳清蛋白水解产物以外，可以采用其它成分如赋形剂、pH调节剂、着色剂和药物用香料，这些都是常用于常规药物配方中的。而且，还可以与本领域已知的或将来发现具有血管紧张素转化酶抑制作用的药物一起使用。
可以将本发明的肽作为有效成分包含于食物产品中，并且作为血管紧张素转化酶抑制剂的一种实施方案，加工成具有血管紧张素转化酶抑制作用的食物产品。不论形式为液体、膏体、固体和粉末等，这些食物产品包括除糖果，流食和饲料(包括用于宠物的那些)以外，小麦粉产品如面包、通心粉、细条实心面、面条，面包混和料、法式炸薯条混和料和面包屑；方便食品如方便面、碗面、蒸煮包装食品、预制食品、罐装食品、微波炉食品、速食汤或炖制品、速食日本酱汤或日本清汤、罐装汤、冻干食品和其它方便食品；农业加工产品如罐装农产品、罐装水果、果酱或柑桔果酱、腌制食品、煮豆、农业干食品，和谷物(谷物加工产品)；加工海产品如罐装海产品、鱼火腿或香肠，鱼酱、海产品珍品和佃煮；畜牧业加工产品如罐装畜牧业产品、酱和牲畜肉火腿或香肠；奶和奶制品如加工奶、奶饮料、酸奶、乳酸菌饮料、奶酪、冰淇淋、改制奶粉、奶油和其它奶制品；脂肪和脂肪油如黄油、人造黄油和植物油；主调味品如大豆酱、日本豆瓣酱、沙司、土豆加工调味品、烹调用甜米酒和醋；混合调味品和食物如烹调混和料、咖喱预混和料、卤汁、色拉调料、面条汤料、香辛料和其它混合调味品；冷冻食品如材料冷冻食品、半制冷冻食品和冷冻烹调食品；糖食如糖油、糖果、口香糖、巧克力、曲奇饼、饼干、蛋糕馅饼、小吃、脆饼干、日式甜食、米饼、豆类甜品、甜食和其它糖食；带味饮料如碳酸饮料、天然果汁、果汁饮料、含果汁的软饮料、果肉饮料、含有浆果的果汁饮料、蔬菜饮料、豆奶，豆奶饮料、咖啡饮料、茶饮料、饮料粉、浓缩饮料、运动饮料、营养饮料和酒类饮料以及其它带味饮料；以及其它市售的食物产品如婴儿食品、鱼粉和带茶paste的白米饭。
在本发明的血管紧张素转化酶抑制剂中，本发明的肽的含量优选至少为0.001％重量，相对于该血管紧张素转化酶抑制剂的最终组成计。
本发明的血管紧张素转化酶抑制剂的剂量因年龄、症状等变化。通常，以0.001-3000毫克/天的剂量服用该抑制剂，优选0.01-30毫克/天，而且，可以每天服用一次或者二或三次。
图1示范了本发明的肽的MS/MS分析结果。
具体实施例方式
接下来，利用实施例更详细地描述本发明。
实施例1通过酪蛋白的酶降解制备肽<1>酪蛋白的酶降解向100克商购的酪蛋白(New Zealand Dairy Board制造)中加入900克水并使酪蛋白在其中良好地分散。然后，加入氢氧化钠将得到的溶液的pH调至7.0使酪蛋白完全溶解，由此，制备了浓度为约10％的酪蛋白水溶液。将所述酪蛋白水溶液在85℃热灭菌10分钟，然后将温度调至50℃，接下来加入氢氧化钠将pH调至9.5。之后向溶液中加入100,800活性单位(1,200活性单位/1克蛋白质)的Biopurazesp-20(Nagase Biochemical Industry Inc.制造)、168,000活性单位(2,000活性单位/1克蛋白质)的Protease N(Amano Enzyme Inc.制造)和588,000活性单位(7,000活性单位/1克蛋白质)的PTN6.0S(Novozymes Japan Ltd.制造)以开始水解反应。当酪蛋白的分解率达到24.1％时，在80℃加热6分钟使酶失活以终止该酶反应，接下来冷却至10℃。用分级分子量为3,000的超滤膜(Asahi KaseiCorporation制造)超过滤该水解溶液，然后将其浓缩并接下来进行冷冻干燥，获得85克冻干产物。
(2)通过HPLC分离肽通过反相HPLC分离酪蛋白水解产物。HPLC的条件描述在下面所述的HPLC条件1中。
柱CAPCELL PAK C18(UG120，5μm)20mmI.D.×250mm(Shiseido Co.，Ltd.)检测UV 215nm流速16ml/min洗脱液A含有0.05％TFA的1％乙腈水溶液洗脱液B含有0.05％TFA的25％乙腈水溶液在从100％洗脱液A到100％洗脱液B的线性梯度条件下40分钟后，水解产物得到了分离。对于每个洗脱级分，用后面描述的方法测定其血管紧张素转化酶抑制能力。结果是在保留时间为22分钟时，具有血管紧张素转化酶抑制能力的肽被洗脱出来。为了提纯肽，将其用HPLC进一步提纯。其条件示于下面的HPLC条件2中。
柱CAPCELL PAK C18(UG300，5μm)2.0mmI.D.×250mm(Shiseido Co.，Ltd.)检测UV 215nm流速0.2ml/min洗脱液A含有0.05％TFA的1％乙腈水溶液洗脱液B含有0.05％TFA的10％乙腈水溶液在从100％洗脱液A至100％洗脱液B的线性梯度条件下15分钟后，在保留时间为13分钟的峰处观测到强的血管紧张素转化酶抑制能力。在该峰处血管紧张素I转化酶抑制能力使IC50[抑制50％的血管紧张素转化酶活性所需要的浓度(μg/ml)]＝0.18μg/ml。
用Applied Biosytems Ltd.的蛋白质序列仪(473A型)鉴定上述活性峰值处的化合物。结果发现该化合物具有新型的Met-Lys-Pro结构。而且，采用Thermoquest Co.，Ltd.的质谱仪LCQ鉴定分子量(M)为374.2，通过MS/MS分析法检测到m/z＝260,215和129等的子离子，m/z＝375.2(MH+)的母离子，如图1所示。
结果，阐明具有血管紧张素转化酶抑制能力的肽的结构为H-Met-Lys-Pro-OH。在冻干产物(85克)中含有42.5mg三肽Met-Lys-Pro。
实施例2肽的化学合成通过固相合成方法，采用肽合成器(Model 433A，AppliedBiosystems Ltd.)并采用Fmoc-L-Met(Applied Biosystems Ltd.)、Fmoc-Lys(Boc)(Applied Biosystems Ltd.)和Fmoc-Pro-TrtA-PEGResin(Watanabe Kagaku Kogyo K.K.)作为原料，合成了三肽Met-Lys-Pro。按照Applied Biosystems Ltd.的手册进行操作，接下来进行去保护。在上述的HPLC条件1下提纯肽。采用该材料测量血管紧张素转化酶抑制能力，结果获得了与实施例1中从酪蛋白降解产物提取得到的几乎相同的值(IC50＝0.19μg/ml)。
通过质谱法测定得到的三肽的分子量(M)为374.2。通过MS/MS分析获得几乎与图1相同的光谱，母离子为mz＝375.2(MH+)。
实施例3肽的血管紧张素转化酶抑制作用按照Cushman等人的方法[Biochemical Pharmacology，第20卷，第1637-1648页(1971)]实施血管紧张素转化酶抑制作用的测量。
采用实施例1和实施例2中获得的肽(Met-Lys-Pro)、描述于参考文献1-3中的肽(Val-Pro-Pro、Ile-Pro-Pro)和描述于参考文献4中的肽(Leu-Leu-Trp)作为样品。那些肽中的每一个都是按与实施例2相同的方式化学合成的。
将样品溶解于0.1M的硼酸盐缓冲液(含有0.3M NaCl，pH8.3)中，然后将其中的0.08ml加入试管中。之后，加入用0.1M硼酸盐缓冲液(含有0.3M NaCl，pH8.3)调节至5mM的0.2ml酶底物(马尿酰-组氨酰-亮氨酸，Sigma Co.，Ltd制造)，然后在37℃培育3分钟。然后，加入通过加入蒸馏水调至0.1U/ml的0.02ml兔肺血管紧张素转化酶(Sigma Co.，Ltd.制造)，然后在37℃反应30分钟。
接下来，加入0.25ml 1N的盐酸来终止反应。然后，加入1.7ml的乙酸乙酯并强力搅拌混合物20秒，在3000rpm实施离心操作10分钟，接下来收集1.4ml乙酸乙酯层。通过加热得到的乙酸乙酯层除去溶剂后，加入1.0ml蒸馏水并测量提取的马尿酸的吸收(228nm的吸光度)并定义为酶活性。
由下面的方程计算出抑制活性，然后定义IC50[抑制50％的血管紧张素转化酶活性所需的浓度(μg/ml或μM)]。结果示于表1中。
抑制率＝(A-B)/(A-C)×100％A不含样品(肽)情况下的酶活性(228nm吸光度)。
B加入样品时的酶活性(228nm吸光度)。
C不加入酶和样品时的酶活性(228nm吸光度)。
表1
实施例4肽对动物的降血压作用<1>试验方法将12只10周龄的雄性SHR/Hos大鼠(从Japan SLC，Inc.购得)预先喂养一周，然后采用小动物用无损伤性自动血压计(MK-2000，Muromachi Kikai Co.，Ltd.制造)测量大鼠的血压。
根据收缩血压将大鼠分成各自包括6只动物的两组，这样在服药前每组的平均收缩血压应为几乎相同的值。之后，使大鼠禁食约16小时。对于测试组，将实施例1中部分<1>获得的酪蛋白酶降解产物溶于注射用水中，然后以10ml/kg体重的比率经口给药(酪蛋白酶降解产物为100mg/kg体重，本发明的肽(Met-Lys-Pro)为0.05mg/kg体重)。服药后2小时测量大鼠的血压。对于对照组，将相同体积的注射用水代替含酪蛋白酶降解产物的水溶液经口给药。服药后2小时测量大鼠的血压。
<2>测试结果结果示于表2中。从表2明显看出，在测试组中观测到了血压下降。另一方面，在对照组中未观测到这一结果。因此，发现含有本发明的肽(Met-Lys-Pro)的酪蛋白酶降解产物对动物具有降血压作用。
表2
实施例5肽对人的降血压作用<1>测试方法九名被实验者为30岁至低于58岁的男性志愿者，在开始摄取前的3周的筛选试验(通过医生医学检查)时患有收缩血压为140-165mmHg的轻度高血压，而且他们没有接受任何降压剂的治疗。
将被实验者分为5名被实验者的测试样品摄取组和4名被实验者的对照组，这样在筛选试验时测量的血压值、吸烟习惯和年龄在组间应是均等的。
作为测试样品，每日摄取一次3克的实施例1中部分<1>获得的酪蛋白酶降解产物(含有1.5mg本发明的肽(Met-Lys-Pro))，作为对照，每天摄取一次3克糊精。在几乎相同的时间进行血压的测量(0-第三周)。
得到的数值(收缩血压)示于表3和表4中。
采用统计分析软件SPSS(SPSS Inc.制造)以5％的显著性水平，通过单向变差分析法(参见，例如Kiyoshi Ichihara，“Statistics forBioscience”，Fifth Issue，Nankodo Co.，Ltd.，November 20，1991，第150-151页)就其显著性差异对得到的数值(收缩血压)进行分析。当数值中存在显著性差异时，通过Dunnett多重比较法(参见，例如Kei Takeuchi及其他13人编，“Statistics Dictionary”，ToyoKeizai Inc.，December 4，1989，第399页)比较平均值。
表3测试样品摄取组的结果(收缩血压单位mmHg)No. 服药前 第一周 第二周 第三周(0周)1162 150 1491452163 160 1521603157 153 1361424145 137 1471375145 133 139127表4对照组结果(收缩血压单位mmHg)No. 服药前 第一周 第二周 第三周(0周)1150 145 1391442153 145 1361563149 137 1341354146 143 148137<2>测试结果作为统计分析软件SPSS的分析结果，发现对照组在与服药前(0周)相比时，服药后第一、第二和第三周全无显著性差异，而在测试样品摄取组，获得的结果是在服药后第二和第三周存在显著性差异。因此，证实含有本发明的肽(Met-Lys-Pro)的酪蛋白酶降解产物对人具有降血压作用。
工业实用性根据本发明，提供了一种可用作血管紧张素转化酶抑制剂的新型肽。本发明的肽源自天然产物并显示出低毒性和高安全性。因此，本发明的肽也可以作为活性成分包含在食品中，而且，作为降压剂的实施方案，加工成具有降血压作用的食物产品。
权利要求
1.由Met-Lys-Pro组成的肽。
2.包含由Met-Lys-Pro组成的肽作为有效成分的血管紧张素转化酶抑制剂。
3.包含由Met-Lys-Pro组成的肽作为有效成分的降压剂。
全文摘要
将通过化学合成或酪蛋白水解获得的肽Met－Lys－Pro用作血管紧张素转化酶抑制剂或降压药物的活性成分。
文档编号C07K5/083GK1612892SQ0282702
公开日2005年5月4日 申请日期2002年11月21日 优先权日2001年11月21日
发明者田村吉隆, 宫川博, 山田明男, 斋藤仁志, 川口靖, 越智浩, 井出朋子, 井上惠梨 申请人:森永乳业株式会社