专利名称：蛋白酶解物的血管紧张素转化酶抑制活性的快速测定技术的制作方法
技术领域：
本发明涉及利用毛细管电泳技术快速测定蛋白酶解物的血管紧张素转化酶抑制活性的方法，属于应用生物技术领域。
背景技术：
高血压是威胁成年人健康的一个主要因素，其发病率呈上升趋势，全世界大约有20％的成年人受到高血压疾病的威胁。高血压会引起患者心脑肾等器官损坏，并与糖脂代谢紊乱和糖尿病有密切关系，严重时会危及生命。因此抗高血压治疗药物的研究越来越引起国内外学者的重视，特别是抑制血管紧张素转化酶的肽，由于是天然的活性肽，没有毒副作用，具有合成降压药物无法比拟的优越性，而且它多存在于各种食物蛋白的加工酶解产品中，有着较大的应用价值和经济潜力。
在人的生理过程中，肾素-血管紧张素-升压酶体系相互作用调节血管收缩。肾素进入血液将血浆中的血管紧张素原Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu-Val-Tyr-Ser-R水解为血管紧张素I(AT1)Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu，血管紧张素I是没有活力的，而血管紧张素I在血管紧张素转化酶(ACE)的作用下，会转化成有活力的血管紧张素II(ATII)Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe，血管紧张素II可加强心肌的收缩力，并同时使血管平滑肌收缩造成血压上升。另一方面，还有激肽-激肽释放酶系统也受到ACE的调控，它可使具有血管舒张作用的缓激肽转变为没有活力的缓释肽，正是由于两个系统在ACE的作用下，协同作用才造成了人体内血压的升高。如果能够抑制血管紧张素转化酶的作用，就可以实现降压作用。ACE抑制肽就是一种ACE抑制剂，由于ACE是一个特异性的C末端的二肽外切酶，ACE抑制肽一般是ACE的底物类似物，这样在ACE作用血管紧张素I时，ACE抑制肽就会对其形成竞争性抑制，与ACE特异性结合，从而减少ACE对血管紧张素I的作用，这样产生的具有血管收缩作用的血管紧张素II的量就大大减少了，从而达到抑制血压升高的目的。
自1970年以来，不断的有新的抗高血压活性肽被研究和发现，其中包括化学合成的，从天然物质中分离提取的，更多的是食物蛋白经过蛋白酶作用后，产生的酶解肽类片段。目前已经研究开发的蛋白质以食物蛋白为主，如大豆蛋白，乳蛋白，牲畜骨骼肌肉蛋白，卵黄蛋白、卵清蛋白等。蛋白质的种类非常多，并且，每一种蛋白质的氨基酸组成以及氨基酸一级序列也不同。可用于酶解的蛋白酶的种类有多种，不同的蛋白酶的酶切位点不尽相同。因此，同一种蛋白，应用不同的蛋白酶酶解，酶解物的ACE抑制活性不同；同一种酶，酶解不同的蛋白质，其酶解物的ACE酶抑制活性也不相同。基于此，酶解物的种类非常多，因此，从多种酶解物中高通量快速筛选具有高ACE酶抑制活性的酶解物，对于进一步分离、纯化、鉴定新的ACE抑制肽，显得尤为重要。以往鉴定血管紧张素抑制肽的抑制活力往往采用分光光度法或高压液相色谱法(HPLC)，既费时又费钱，而毛细管电泳具有快速，灵敏度高，样品用量少等优点，因此用毛细管电泳的方法可以快速筛选具有血管紧张素抑制肽的活性，即具有降血压活性的蛋白酶解物，将为进一步分离纯化鉴定新的降血压肽奠定基础。
发明内容本发明针对现有技术的不足，提供一种蛋白酶解物的血管紧张素转化酶抑制活性的快速测定技术，可快速准确地从大量的蛋白酶解产物中筛选富含抑制血管紧张素转化酶(ACE)活性肽的酶解物，用于筛选富含降血压肽的蛋白酶解物。
本发明的方法包括用毛细管电泳的方法测定各种蛋白酶解产物的抑制ACE活性的IC50值，根据IC50值的大小，判断各种海洋蛋白酶解物的抑制ACE的活性，IC50越低，表明该蛋白酶解物抑制ACE酶的活性越强，抑制ACE的降血压活性肽的含量越高。具体包括如下步骤(1)酶反应系列样品反应液包括10μl底物Hip-His-Leu(1mM)，0.8mU的血管紧张素转化酶(ACE)分别和不同浓度的(0.03～40mg/ml)10μl蛋白酶解产物。上述样品反应液都用100mM的硼酸缓冲液(包含0.3M NaCl，pH8.3)配制。反应液均在37℃反应30min，然后用0.1％三氟乙酸TFA(10μl)中止反应。底物经ACE作用后产生单独的马尿酸和His-Leu二肽。
(2)检测血管紧张素转化酶抑制反应产物直接在毛细管电泳仪上进行检测。毛细管电泳仪为Beckman Coulter P/ACE MDQ(Fullerton，CA)装置，配备有PDA(photodiode array)检测器，数据采集、分析、系统控制用P/ACE MDQ软件，该软件来自Beckman Coulter(Fullerton，CA)。中止反应后的混合物样品直接用毛细管电泳进行检测，上样压力为1psi，时间为5秒，电泳电压20kV，紫外吸收为228nm，电泳时间5分钟，电泳缓冲液为20mM的硼酸缓冲液(pH9.18)。每测一个样品之后用缓冲液冲洗毛细管1分钟。底物和产物马尿酸分别在2.5分钟和3.5分钟出峰，根据软件计算马尿酸的峰面积。
(3)ACE抑制活性的计算(IC50值的计算)马尿酸配制成不同浓度0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，2，4，6mM，通过毛细管电泳测定其峰面积与马尿酸浓度的线性关系。
峰面积＝K×Chip+NACE活力(umol/min)＝V×Chip÷t上述公式中V反应体积，t反应时间，K根据峰面积和马尿酸浓度求出的曲线常数，Chip马尿酸浓度，N马尿酸浓度曲线与Y轴的交点。
通过血管紧张素转化酶作用，反应混合物中不含任何抑制剂，从底物Hip-His-Leu释放出来的马尿酸HA的量被定义为100％ACE活力。将所要测定ACE抑制活力的抑制剂系列稀释成不同浓度，分别与底物和酶共同反应，然后根据所产生的马尿酸的峰面积，来计算抑制剂的IC50值。抑制50％的ACE活力的海洋蛋白酶解产物的量被定义为该酶解产物的抑制活力。
IC50值的计算采用线性对数法，以Log(ACE活力/(1-ACE活力))对Log(水解产物浓度mg/ml)作图，所得直线与X轴的交点对应的值为M，10M为酶解产物抑制ACE活力的IC50值。
具有酶解ACE抑制肽的IC50值为0.2μM-500μM，IC50值越小，说明对ACE的抑制作用越强，降血肽效果越好。
上述步骤(1)不同的蛋白首先经过匀浆，然后用蛋白酶进行酶解，经过5小时的酶解后，离心取上清，将上清冻干，取适量冻干粉末配制成一定浓度的抑制剂。
上述步骤(1)反应在0.2ml的小离心管中进行，反应结束后直接放置在毛细管样品瓶支架上样。
本发明应用毛细管电泳技术测定酶解物的ACE抑制肽，可以减少传统方法耗费时间，耗费样品的缺点，可以实现对多种蛋白资源酶解物的ACE抑制活性进行高通量快速筛选。
本发明的优点在于将毛细管电泳技术应用于从蛋白酶解产物中筛选抗高血压活性肽。具体体现在1、运用毛细管电泳技术快速测定ACE抑制剂的抑制活力，2、重复性好，灵敏度高，IC50值测定准确，3、与以往的色谱法相比，大大减少了测定IC50值所用的时间，而且不需要价格昂贵的有机溶剂作为流动相。4、利用毛细管电泳技术开发具有将血压功能的蛋白酶解产品，有广阔的市场空间。
图1是实施例1的IC50值的线性对数图，横坐标是Log(鯷鱼酶解物mg/ml)纵坐标是Log(ACE活力/(1-ACE活力))，以Log(ACE活力/(1-ACE活力))对Log(水解产物浓度mg/ml)作图，所得直线与X轴的交点为-3.39。
图2是实施例2的IC50值的线性对数图，横坐标是Log(玉米蛋白酶解物)mg/ml)纵坐标是Log(ACE活力/(1-ACE活力))，以Log(ACE活力/(1-ACE活力))对Log(水解产物浓度mg/ml)作图，所得直线与X轴的交点为-3.01。
具体实施方式
实施例1.
(1)血管紧张素转化酶反应条件样品反应液包括10μl底物Hip-His-Leu(1mM)，0.8mU的血管紧张素转化酶(ACE)和10μl的不同浓度海洋鯷鱼肉的酶解产物。具体如下样品 底物Hip-His-Leu 血管紧张素转化酶鯷鱼肉的酶解产物1 10μl，1mM 0.8mU 10μl，39mg/ml2 10μl，1mM 0.8mU 10μl，9.3mg/ml3 10μl，1mM 0.8mU 10μl，4.6mg/ml4 10μl，1mM 0.8mU 10μl，1.8mg/ml5 10μl，1mM 0.8mU 10μl，0.63mg/ml6 10μl，1mM 0.8mU 10μl，0.29mg/ml对照 10μl，1mM 0.8mU 水10μl上述反应液都用100mM的硼酸缓冲液(包含0.3M NaCl，pH8.3)配制。同时用不含酶解产物，只有ACE和底物Hip-His-Leu的反应体系作为对照。所有样品都分别装载在0.2ml的小离心管中，在37℃反应30min，然后用0.1％三氟乙酸TFA(10μl)中止反应，离心管内样品体积均为40μl。
鯷鱼肉的酶解采用现有公知技术，例如将鯷鱼肉先经过匀浆，然后用蛋白酶进行酶解，经过5小时的酶解后，离心取上清，将上清冻干，取适量冻干粉末配制成一定浓度的抑制剂。其他按现有技术。
(2)检测条件上述反应产物直接在毛细管电泳仪上进行检测。上样压力为1psi，时间为5秒，电泳电压20kV，紫外吸收为228nm，电泳时间5分钟，电泳缓冲液为20mM的硼酸缓冲液(pH9.18)。每测一个样品之后用缓冲液冲洗毛细管1分钟。毛细管电泳仪为BeckmanCoulter P/ACE MDQ(Fullerton，CA)装置，配备有PDA(photodiode array)检测器，数据采集、分析、系统控制用P/ACE MDQ软件，该软件来自Beckman Coulter(Fullerton，CA)。
(3)ACE抑制活性的计算(IC50值的计算)IC50值的计算采用线性对数法，以Log(ACE活力/(1-ACE活力))对Log(水解产物浓度mg/ml)作图，所得直线与X轴的交点对应的值为M，10M为酶解产物抑制ACE活力的IC50值。
上述步骤(3)通过对所有样品中马尿酸的面积进行积分，然后根据公式对数作图(图1)，得出直线与X轴的交点为-3.39，所以IC50为0.4mg/ml。说明该酶解物对ACE的抑制作用较强。该数据与用高压液相色谱法(HPLC)方法得到的IC50值相近。
实施例2.同实施例1，所不同的是作为ACE抑制剂的是玉米蛋白的酶解液，酶解液配制浓度为0.05mg/ml～2mg/ml，得出直线与X轴的交点为-3.01(见图2)，所以IC50为0.98mg/ml，说明该酶解物对ACE的抑制作用较强。
实施例3.同实施例1，所不同的是作为ACE抑制剂的是卡托普利(Captopril)。
卡托普利是ACE的竞争性抑制剂，配制浓度为0.03～3mg/ml，测定它的IC50为22nM，与分光光度法或高压液相色谱法测定的结果相吻合。
实施例4.同实施例1，所不同的是作为ACE抑制剂的是肽段Val-Pro-Ala-Phe配制浓度为0.03～4mg/ml，测定它的IC50为575.4μM，说明，该短肽抑制ACE的活性较弱。
本发明不限于上述实施例。
本发明实施例的毛细管电泳图重复性好，可以准确的计算出各种蛋白酶解产物的和各种ACE抑制剂的ACE抑制活性，为快速分离鉴定ACE抑制肽提供了良好的检测手段。
权利要求
1.蛋白酶解物的血管紧张素转化酶抑制活性的快速测定技术，其特征在于用毛细管电泳的方法测定各种蛋白酶解产物的血管紧张素转化酶抑制活性的IC50值，具体包括如下步骤(1)酶反应系列样品反应液包括10μl底物Hip-His-Leu 1mM，0.8mU的血管紧张素转化酶分别和浓度为0.03～40mg/ml的10μl蛋白酶解产物，上述样品反应液都用pH8.3含0.3M NaCl的100mM的硼酸缓冲液配制，反应液均在37℃反应30min，然后用0.1％三氟乙酸10μl中止反应，底物经血管紧张素转化酶作用后产生单独的马尿酸和His-Leu二肽；(2)检测上述血管紧张素转化酶抑制反应产物直接在毛细管电泳仪上进行检测，毛细管电泳仪为Beckman Coulter P/ACE MDQ装置，配备有PDA检测器，数据采集、分析、系统控制用P/ACE MDQ软件，上样压力为1psi，时间为5秒，电泳电压20kV，紫外吸收为228nm，电泳时间5分钟，电泳缓冲液为20mM的硼酸缓冲液pH9.18，每测一个样品之后用缓冲液冲洗毛细管1分钟，底物和产物马尿酸分别在2.5分钟和3.5分钟出峰，根据软件计算马尿酸的峰面积；(3)血管紧张素转化酶抑制活性IC50值的计算马尿酸配制成不同浓度0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，2，4，6mM，通过毛细管电泳测定其峰面积与马尿酸浓度的线性关系峰面积＝K×Chip+NACE活力(umol/min)＝V×Chip÷t上述公式中V反应体积，t反应时间，K根据峰面积和马尿酸浓度求出的曲线常数，Chip马尿酸浓度，N马尿酸浓度曲线与Y轴的交点；通过血管紧张素转化酶作用，反应混合物中不含任何抑制剂，从底物Hip-His-Leu释放出来的马尿酸HA的量被定义为100％血管紧张素转化酶活力。将所要测定血管紧张素转化酶抑制活力的抑制剂系列稀释成不同浓度，分别与底物和酶共同反应，然后根据所产生的马尿酸的峰面积，来计算抑制剂的IC50值；抑制50％的ACE活力的海洋蛋白酶解产物的量被定义为该酶解产物的抑制活力；IC50值的计算采用线性对数法，以Log(ACE活力/(1-ACE活力))对Log(水解产物浓度mg/ml)作图，所得直线与X轴的交点对应的值为M，10M为酶解产物抑制ACE活力的IC50值。
2.如权利要求1所述的蛋白酶解物的血管紧张素转化酶抑制活性的快速测定技术，其特征在于，步骤(1)的蛋白首先经过匀浆，然后用蛋白酶进行酶解，经过5小时的酶解后，离心取上清，将上清冻干，取冻干粉末配制成抑制剂。
3.如权利要求1所述的蛋白酶解物的血管紧张素转化酶抑制活性的快速测定技术，其特征在于，步骤(1)反应在0.2ml的小离心管中进行，反应结束后直接放置在毛细管样品瓶支架上样。
全文摘要
本发明涉及利用毛细管电泳技术快速测定蛋白酶解物的血管紧张素转化酶抑制活性的方法，属于应用生物技术领域。本发明的方法包括用毛细管电泳的方法测定各种蛋白酶解产物的抑制ACE活性的IC
文档编号G01N21/33GK1632528SQ20041007582
公开日2005年6月29日 申请日期2004年12月27日 优先权日2004年12月27日
发明者张玉忠, 何海伦, 陈秀兰, 吴昊, 周百成 申请人:山东大学